一种抑制 Bcl-2 基因表达的 siRNA 分子及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种抑制 Bcl-2 基因表达的 siRNA 分子及其应用。背景技术 RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是 1998 年首次报道的一种转录后的基因沉 默效应， 是指在生物体细胞内， 外源性或内源性的双链 RNA 识别有同源序列的 mRNA， 对其特 异性切割， 从而阻断其翻译的过程 (Nature.1998， 391 ： 806-811)。RNAi 发挥基因沉默作用 的机制是 ： 长 dsRNA 进入细胞后， 被 Dicer 酶结合并切割。Dicer 酶的切割产物通常是长度 为 20-25bp， 且在每个链的 3’ 末端有 2 个核苷酸悬垂的小干扰 RNA(siRNA)。siRNA 双链中 的一条， 一般是反义链掺入到 RNA- 诱导的沉默复合物中 (RISC)， 与互补的序列配对。RISC 首先介导 siRNA 双链解旋， 与 RISC 耦合的单链的 siRNA 以序列特异的方式与靶 mRNA 结合， 之后由 RISC 的催化组分切割靶 mRNA。切割靶 mRNA 可以抑制其翻译， 最终抑制转录该 mRNA 的基因的表达。与传统的抑制基因表达的反义寡核苷酸技术和核酶技术相比， siRNA 沉默 基因表达的效果要强大数十倍至数百倍， 现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗 中具有极大的潜力， 是理想的阻断基因表达的治疗手段。
恶性肿瘤是危害人类生命和健康的主要疾病之一， 但尚无有效的根治方法。近 年来的研究发现肿瘤的发生、 发展及多药耐药现象与细胞凋亡障碍密切相关。Bcl-2 基因 是广泛存在于恶性肿瘤细胞中的一种癌基因， 定位于 18q21 上， 因其具有抑制细胞凋亡和 延长细胞存活的功能而被称为 “存活基因” 。Bcl-2 基因编码的蛋白主要分布于线粒体内 膜、 核膜和内质网上， 目前认为， Bcl-2 蛋白能够稳定线粒体膜电压、 阻止线粒体释放 Cyt C、 AIF 等细胞因子， 抑制或阻断多种因素诱发的细胞凋亡， 在线粒体凋亡途径的调控中起 中心调控因子的作用 (Nature.1999， 399 ： 483-487)。正常机体组织中， Bcl-2 分布比较局 限， 主要在胚胎早期组织、 成熟淋巴细胞、 增生活跃的上皮细胞和神经元等组织表达， 但在 膀胱癌、 鼻咽癌、 结 - 直肠癌、 乳腺癌、 肝癌、 胃癌、 前列腺癌和肺癌等许多肿瘤中异常高表 达， 且其表达水平常与肿瘤细胞对多种化疗药物及 γ 射线的耐受相关 (J CellBiochem， 1996.60 ： 23-32)。因此， 抑制肿瘤细胞中过度表达的 Bcl-2， 恢复其正常的凋亡通路及增加 其对化疗药物和放疗的敏感性是治疗肿瘤的新策略。此外， Bcl-2 在正常细胞中分布局限， 因而这一治疗策略比传统的细胞毒药物具有选择性更好， 毒性更低的优势 (Cell， 1993， 75 ： 229-240)， 可能成为非常有效的单独治疗或增加放、 化疗药物效果的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种特异性的靶向 Bcl-2 基因， 抑制其表达， 从而抑制肿瘤细胞 生长， 具有抗癌作用的 siRNA 双链序列， 并提供了该 siRNA 序列在肿瘤基因治疗中的应用。
本发明所述的一组抑制 Bcl-2 基因表达的 siRNA 双链， 其序列为 ：
si-B-3 ：
正义链 ： 5’ -GUACGAUAACCGGGAGAUAdTdT-3’ (SEQ ID NO ： 1)反义链 ： 5’ -UAUCUCCCGGUUAUCGUACdTdT-3’ (SEQ ID NO ： 2)
其中， dT 是脱氧胸腺嘧啶。
换言之， 该双链 siRNA 分子的主干序列为 ：
正义链 ： 5’ -GUACGAUAACCGGGAGAUA-3’ (SEQ ID NO ： 3)
反义链 ： 5’ -UAUCUCCCGGUUAUCGUAC-3’ (SEQ ID NO ： 4)
在一个优选的实施方式中， 上述序列中 3’ 端是两个脱氧胸腺嘧啶 dTdT。
本发明根据 GenBank 提供的人 Bcl-2 基因的 cDNA 序列， 使用在线设计 siRNA 软 件设计了 5 对针对 Bcl-2 的长度为 21 个核苷酸的 siRNA 序列， 分别记为 si-B-1， si-B-2， si-B-3， si-B-4， si-B-5， 每种 siRNA 的 3’ 末端有两个脱氧核糖核苷酸 (dTdT)， 呈单链悬挂 状态。所述 siRNA 序列由百奥迈科生物技术有限公司合成。本发明还涉及用实时定量 PCR 法检测 5 种 siRNA 转染到人膀胱癌细胞系 T24 后， 抑制 Bcl-2 基因的 mRNA 表达的情况， 结果 表明， si-B-3 抑制了 88％的 Bcl-2mRNA 的表达 ( 图 1)。 本发明还涉及了蛋白印迹 (Western Blot) 法进一步检测 si-B-3 对 Bcl-2 蛋白表达的影响 ( 图 2， 图 3)， 结果表明， si-B3 在蛋 白水平也显著抑制了 Bcl-2 的表达， 抑制率为 83.2％。本发明还涉及用 WST-8 法检测所述 si-B-3 抑制细胞增殖的作用， 结果见图 4 和图 5， 结果表明 ： 转染了 si-B-3 的 T24 细胞从转 染后 48h 生长即被抑制， 在转染后第 96h 抑制效果最佳， 此时， 转染 si-B-3 的抑制率达到了 31％。综上所述， 本发明提供了一种特异抑制 Bcl-2 基因表达的 siRNA 序列， 这一种 siRNA 在 mRNA 水平和蛋白质水平均有效的抑制了 Bcl-2 这一抗凋亡基因的表达， 最终显著抑制了 肿瘤细胞的生长和增殖， 有望应用于抗肿瘤药物中。 附图说明
图 1 是实时定量 PCR 法检测转染 siRNA 后 Bcl-2 基因 mRNA 的表达量柱形图。纵 坐标表示 Bcl-2 基因 mRNA 表达水平 ； 横坐标表示处理实验组。
图 2 是 Western Blot 法检测转染 siRNA 后 Bcl-2 蛋白表达条带图。
图 3 是 Bcl-2 蛋白相对表达水平灰度分析结果柱形图， 其中 ： * 表示与未处理组相 比 P ＜ 0.01， 有极显著差异。
图 4 是转染了不同 siRNA 序列后 T24 细胞的生长曲线图。
图 5 是与阴性对照相比各组 siRNA 抑制 T24 细胞生长的抑制率柱形图。 具体实施方式
本发明中诸如 “siRNA” 、 “siRNA 序列” 或 “siRNA 分子” 等术语可以互换， 其表示的 意思和范围相同。
其中， siRNA 序列可以是单链结构， 也可以是双链结构。
本发明的 siRNA 分子来源于针对 Bcl-2 基因开放阅读框设计的 siRNA， 长度为 21nt， 3’ 末端有两个脱氧核糖核苷酸 (dTdT)， 呈单链悬挂状态。
siRNA 的制备可采用多种方法， 比如 ： 化学合成法、 体外转录、 酶切长链 dsRNA、 载 体表达 siRNA、 PCR 合成 siRNA 表达元件等， 这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间， 可以更好地获得基因沉默效率。
本发明的 siRNA 分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分。出于应用目的， 可将 siRNA 分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位， 比如 病灶组织。
本发明的药物的剂型可以为多种形式， 只要适合于相应疾病的给药、 并且恰当地 保持 siRNA 分子的活性。比如， 对于注射用给药系统， 剂型可以是冻干粉。
任选地， 上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂， 只要其适合于相应 的给药体系、 并且恰当地保持 siRNA 分子的活性。
为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的 siRNA 的抗肿瘤效果， 设计了如下 实验方案 ：
(1) 设计靶向于 Bcl-2 基因的 siRNA 分子， 长度为 21nt， 3’ 末端悬挂有两个脱氧核 糖核苷酸 (dTdT)。
(2) 化学合成制备 siRNA 分子， 由百奥迈科生物技术有限公司合成， 双链 siRNA 纯 度＞ 95％， 用无核酸酶水溶解后可直接用于细胞转染。
(3) 运用实时定量 PCR 技术， 检测上述 siRNA 在细胞中对 Bcl-2 基因的抑制作用。
(4) 运用 Western Blot 技术， 检测上述 siRNA 抑制 Bcl-2 蛋白表达的情况。
下述实施例仅用于阐明本发明， 并非是对本发明进行限制。
实施例 1
siRNA 的设计与合成
根 据 GenBank 数 据 库 中 人 源 性 Bcl-2 基 因 开 放 阅 读 框 (ORF) 的 序 列， 用 Invitrogen 和 Thermo 公司的设计软件设计 siRNA 序列， 经 si-search 软件评分并在人类 EST 数据库中比对， 确定靶基因的唯一性， 以人类基因无同源性的 siRNA 序列为阴性对照 siRNA。
上述 siRNA 由百奥迈科生物技术有限公司合成， 双链 siRNA 纯度＞ 95％， 用无核酸 酶水溶解后可直接用于细胞转染。
实施例 2
siRNA 的细胞转染
人膀胱癌细胞系 T24 用含 10％胎牛血清的 1640 培养基， 37℃、 5％ CO2 条件下培养。 取生长状态良好的 T24 细胞， 转染前一天铺 6 孔细胞培养板， 调整每孔的细胞数， 使第二天 细胞汇合度达到 30％左右。设置 7 个实验组， 分别为 ：
编号 1 2 3 4 5实验组 si-B-1 转染组 si-B-2 转染组 si-B-3 转染组 si-B-4 转染组 si-B-5 转染组5101974533 A CN 101974537说6 7明书4/5 页阴性对照组 ( 转染阴性对照 siRNA) 未转染组转染前将培养基更换为无血清无双抗的 Opti-MEM 培养基 (Invitrogen 公司 ) 培 养细胞。以 6 孔板的一个孔为例， 用 Invitrogen 公司的 LipofectamineTM2000(Lipo2000) 脂质体转染 siRNA ： a) 用 250μL 无血清 Opti-MEM 培养基稀释 5μl Lipo2000， 轻轻混匀， 室温下静置 5min。b) 用 250μL 无血清 Opti-MEM 培养基稀释适量的 siRNA， 使转染时的终 浓度为 50nM。c) 混合 Lipo2000 和 siRNA 的稀释液 ( 总体积为 500μL)。轻轻混匀后， 室温 下静置 20min， 以形成 siRNA-Lipo2000 混和物。d) 逐滴将 siRNA-Lipo2000 混合液加入含 有细胞以及培养液的细胞培养板中， 轻轻摇晃， 使之混和。e) 将培养板置于 37℃的 CO2 培 养箱中培养。4-6h 后， 将孔里含 siRNA-Lipo2000 混合液的培养基移去， 更换新鲜的完全培 养基， 培养至检测时间检测。
每个转染组设 3 个复孔， 实验重复三次。
实施例 3
实时定量 PCR 法检测 siRNA 抑制 Bcl-2mRNA 表达
细胞总 RNA 提取 ： 按上述实施例 2 方法所转染的各组细胞， 培养 48h 后吸尽培养 TM 基， PBS 洗 2 遍。吸尽 PBS， 按每孔培养细胞中加入 1mL RISO ( 百奥迈科公司 ) 试剂， 在 室温下水平放置 5min， 使裂解液均匀分布于细胞表面， 然后吹打细胞使细胞脱落。将细胞 裂解液转移至 DEPC 处理的离心管中， 并反复吹打直至裂解液中无明显沉淀， 在室温下放置 5min， 使核酸蛋白复合物完全分离。按 1mL RISO 加入 0.2mL 氯仿的量向细胞裂解液中加入 氯仿， 盖紧管盖， 轻微振荡 15s， 室温静置 2-3min。12,000g， 离心 15min。小心吸取无色上清 液至新的 1.5mL DEPC 处理的 EP 管中。每管加入 0.5ml 异丙醇， 轻轻混匀， 室温静置 10min， 12,000g， 4℃离心 10min。弃去上清， 加 1mL 75％乙醇 ( 每使用 1mL RISO 试剂至少加 1ml 75％乙醇 )， 涡旋振荡混匀。7,500g， 4℃离心 5min 弃尽上清， 超净工作台干燥沉淀或真空 离心干燥， 加入适量 DEPC 处理水溶解 RNA 沉淀 ( 可在 55-60℃促溶 10min)。取少量 RNA 用 1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳观察 28S 和 18S 两条清晰条带， 以确保提取的总 RNA 的纯度 和完整性。
采用一步法实时荧光定量 PCR 检测目的基因 mRNA 的水平， 所用引物序列如下， 由 百奥迈科生物技术有限公司合成。
Bcl-2 引物 ：
上游引物 ： 5’ -GGCTGGGATGCCTTTGTG-3’
下游引物 ： 5’ -GCCAGGAGAAATCAAACAGAGG-3’
GAPDH 引物 ：
上游引物 ： 5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’
下游引物 ： 5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
反应体系为 ： RNA 模板 10pg ～ 100ng， 2×Master mix 12.5μL， 50×SYBR green I0.5μL， 上游引物 0.5μL， 下游引物 0.5μL， DEPC 处理水补足总体积至 25μL。每个样 TM 品做 3 个平行样。用 BIO-RAD 公司的 MyIQ 实时定量 PCR 仪进行反应， 反应条件为 ： 反转 录 42 ℃ /30min， 预 变 性 95 ℃ /5min， 95 ℃ /20s， 60 ℃ /20s， 72 ℃ /20s， 共 40 个 循 环。 以
60℃ -95℃， 0.5℃ /10s 测定溶解曲线。 结果通过 2-ΔΔCt 方法计算， 目的基因表达差异通过转 染组相对于未处理组的比值来表示， 结果见图 1。结果表明 ： si-B-3 有效抑制了 Bcl-2mRNA 的表达， 与未处理组相比抑制率为 88％。
实施例 4
Western Blot 法检测 siRNA 抑制 Bcl-2 蛋白表达
按上述实施例 2 所述方法转染 siRNA 到 T24 细胞中， 另余一孔做未处理组。转染 72h 后吸尽培养基， 预冷的 PBS 漂洗 2 遍， 吸尽 PBS。加入 50μL/ 孔的预冷的 RIPA 细胞裂 解液 ( 含 1mM PMSF)， 立即用细胞刮刀刮下细胞， 冰浴 0.5-1h。4℃， 12,000g 离心 15min 收 集上清至新的离心管中， 用标准 Bradfold 法测蛋白浓度。取各样品等量总蛋白 (20μg) 与 上样缓冲液混合， 沸水煮沸变性 10min 后， 用 12％的 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白， 按 《分子 克隆实验指南》 第二版中操作流程使用 Bio-Rad 公司的 Mini Trans-Blot 转膜电泳槽转移 印迹蛋白到 PVDF 膜 (Millipore) 上。转膜后的 PVDF 膜用 5％ (w/v) 脱脂奶粉 TBS 溶液室 温封闭 2h。TBST 漂洗膜 3 次， 10min/ 次， 之后用 1 ％ BSA 的 TBST 溶液 1 ： 200 倍稀释一抗 (Santa cruz 小鼠抗人 Bcl-2 单抗， 小鼠抗人 β-actin 单抗 )， 4℃孵育过夜。次日， TBST 室温漂洗 3 次， 10min/ 次。用 1％ BSA 的 TBST 溶液 1 ∶ 1000 稀释的羊抗小鼠二抗 (Santa Cruz) 室温孵育 2h。TBST 室温润洗 3 次， 10min/ 次。膜上滴加化学发光增强剂， 按试剂说 明进行操作， 将 X 光胶片附在膜上， 根据目的条带荧光亮度调整曝光时间， 经显影后拍照保 存。结果如图 2 所示， si-B-3 组的 Bcl-2 蛋白条带几乎不可见， 而未处理组 Bcl-2 蛋白清晰 可见， 各组间 β-actin 条带亮度基本一致。使用 Image J 软件进行灰度半定量分析后的结 果如图 3 所示， 结果表明 si-B-3 在蛋白水平也显著抑制了 Bcl-2 的表达， 抑制率为 83.2％， 与其实时定量 PCR 结果相符。
实施例 5
WST-8 法检测 siRNA 对细胞增殖能力的影响
取生长状态良好的细胞， 按 1000cells/ 孔的数量铺 96 孔板， 按实施例 4 所述方法 转染细胞， 转染后 48h， 72h， 96h 分别取细胞进行 WST-8 法检测细胞活力， 每个时间点设 5 个 复孔。 每孔加入 10μL WST-8 溶液， 在细胞培养箱中培养 2h， 酶标仪在 450nm 波长处检测每 孔的光密度 (A 值 )。
细胞增殖抑制率 (IR) ＝ (1- 实验组平均 A 值 / 对照组平均 A 值 )×100％。
各组 T24 细胞的生长曲线和增殖抑制率如图 4 和图 5 所示 ： si-B-3 转染组的 T24 细胞从转染后 48h 生长即被抑制， 在转染后第 96h 抑制效果最佳， 此时， si-B-3 的抑制率达 到了 31％。
实施例 6
siRNA 在制备抗肿瘤药物中的应用
本发明所述 si-B-3 用于制备抗肿瘤的药物， 可单独使用或与其他化疗， 放疗药物 联合使用。
本发明涉及一种抑制 Bcl-2 基因表达的 siRNA 分子及其应用。背景技术 RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是 1998 年首次报道的一种转录后的基因沉 默效应， 是指在生物体细胞内， 外源性或内源性的双链 RNA 识别有同源序列的 mRNA， 对其特 异性切割， 从而阻断其翻译的过程 (Nature.1998， 391 ： 806-811)。RNAi 发挥基因沉默作用 的机制是 ： 长 dsRNA 进入细胞后， 被 Dicer 酶结合并切割。Dicer 酶的切割产物通常是长度 为 20-25bp， 且在每个链的 3’ 末端有 2 个核苷酸悬垂的小干扰 RNA(siRNA)。siRNA 双链中 的一条， 一般是反义链掺入到 RNA- 诱导的沉默复合物中 (RISC)， 与互补的序列配对。RISC 首先介导 siRNA 双链解旋， 与 RISC 耦合的单链的 siRNA 以序列特异的方式与靶 mRNA 结合， 之后由 RISC 的催化组分切割靶 mRNA。切割靶 mRNA 可以抑制其翻译， 最终抑制转录该 mRNA 的基因的表达。与传统的抑制基因表达的反义寡核苷酸技术和核酶技术相比， siRNA 沉默 基因表达的效果要强大数十倍至数百倍， 现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗 中具有极大的潜力， 是理想的阻断基因表达的治疗手段。
恶性肿瘤是危害人类生命和健康的主要疾病之一， 但尚无有效的根治方法。近 年来的研究发现肿瘤的发生、 发展及多药耐药现象与细胞凋亡障碍密切相关。Bcl-2 基因 是广泛存在于恶性肿瘤细胞中的一种癌基因， 定位于 18q21 上， 因其具有抑制细胞凋亡和 延长细胞存活的功能而被称为 “存活基因” 。Bcl-2 基因编码的蛋白主要分布于线粒体内 膜、 核膜和内质网上， 目前认为， Bcl-2 蛋白能够稳定线粒体膜电压、 阻止线粒体释放 Cyt C、 AIF 等细胞因子， 抑制或阻断多种因素诱发的细胞凋亡， 在线粒体凋亡途径的调控中起 中心调控因子的作用 (Nature.1999， 399 ： 483-487)。正常机体组织中， Bcl-2 分布比较局 限， 主要在胚胎早期组织、 成熟淋巴细胞、 增生活跃的上皮细胞和神经元等组织表达， 但在 膀胱癌、 鼻咽癌、 结 - 直肠癌、 乳腺癌、 肝癌、 胃癌、 前列腺癌和肺癌等许多肿瘤中异常高表 达， 且其表达水平常与肿瘤细胞对多种化疗药物及 γ 射线的耐受相关 (J CellBiochem， 1996.60 ： 23-32)。因此， 抑制肿瘤细胞中过度表达的 Bcl-2， 恢复其正常的凋亡通路及增加 其对化疗药物和放疗的敏感性是治疗肿瘤的新策略。此外， Bcl-2 在正常细胞中分布局限， 因而这一治疗策略比传统的细胞毒药物具有选择性更好， 毒性更低的优势 (Cell， 1993， 75 ： 229-240)， 可能成为非常有效的单独治疗或增加放、 化疗药物效果的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种特异性的靶向 Bcl-2 基因， 抑制其表达， 从而抑制肿瘤细胞 生长， 具有抗癌作用的 siRNA 双链序列， 并提供了该 siRNA 序列在肿瘤基因治疗中的应用。
本发明所述的一组抑制 Bcl-2 基因表达的 siRNA 双链， 其序列为 ：
si-B-3 ：
正义链 ： 5’ -GUACGAUAACCGGGAGAUAdTdT-3’ (SEQ ID NO ： 1)反义链 ： 5’ -UAUCUCCCGGUUAUCGUACdTdT-3’ (SEQ ID NO ： 2)
其中， dT 是脱氧胸腺嘧啶。
换言之， 该双链 siRNA 分子的主干序列为 ：
正义链 ： 5’ -GUACGAUAACCGGGAGAUA-3’ (SEQ ID NO ： 3)
反义链 ： 5’ -UAUCUCCCGGUUAUCGUAC-3’ (SEQ ID NO ： 4)
在一个优选的实施方式中， 上述序列中 3’ 端是两个脱氧胸腺嘧啶 dTdT。
本发明根据 GenBank 提供的人 Bcl-2 基因的 cDNA 序列， 使用在线设计 siRNA 软 件设计了 5 对针对 Bcl-2 的长度为 21 个核苷酸的 siRNA 序列， 分别记为 si-B-1， si-B-2， si-B-3， si-B-4， si-B-5， 每种 siRNA 的 3’ 末端有两个脱氧核糖核苷酸 (dTdT)， 呈单链悬挂 状态。所述 siRNA 序列由百奥迈科生物技术有限公司合成。本发明还涉及用实时定量 PCR 法检测 5 种 siRNA 转染到人膀胱癌细胞系 T24 后， 抑制 Bcl-2 基因的 mRNA 表达的情况， 结果 表明， si-B-3 抑制了 88％的 Bcl-2mRNA 的表达 ( 图 1)。 本发明还涉及了蛋白印迹 (Western Blot) 法进一步检测 si-B-3 对 Bcl-2 蛋白表达的影响 ( 图 2， 图 3)， 结果表明， si-B3 在蛋 白水平也显著抑制了 Bcl-2 的表达， 抑制率为 83.2％。本发明还涉及用 WST-8 法检测所述 si-B-3 抑制细胞增殖的作用， 结果见图 4 和图 5， 结果表明 ： 转染了 si-B-3 的 T24 细胞从转 染后 48h 生长即被抑制， 在转染后第 96h 抑制效果最佳， 此时， 转染 si-B-3 的抑制率达到了 31％。综上所述， 本发明提供了一种特异抑制 Bcl-2 基因表达的 siRNA 序列， 这一种 siRNA 在 mRNA 水平和蛋白质水平均有效的抑制了 Bcl-2 这一抗凋亡基因的表达， 最终显著抑制了 肿瘤细胞的生长和增殖， 有望应用于抗肿瘤药物中。 附图说明
图 1 是实时定量 PCR 法检测转染 siRNA 后 Bcl-2 基因 mRNA 的表达量柱形图。纵 坐标表示 Bcl-2 基因 mRNA 表达水平 ； 横坐标表示处理实验组。
图 2 是 Western Blot 法检测转染 siRNA 后 Bcl-2 蛋白表达条带图。
图 3 是 Bcl-2 蛋白相对表达水平灰度分析结果柱形图， 其中 ： * 表示与未处理组相 比 P ＜ 0.01， 有极显著差异。
图 4 是转染了不同 siRNA 序列后 T24 细胞的生长曲线图。
图 5 是与阴性对照相比各组 siRNA 抑制 T24 细胞生长的抑制率柱形图。 具体实施方式
本发明中诸如 “siRNA” 、 “siRNA 序列” 或 “siRNA 分子” 等术语可以互换， 其表示的 意思和范围相同。
其中， siRNA 序列可以是单链结构， 也可以是双链结构。
本发明的 siRNA 分子来源于针对 Bcl-2 基因开放阅读框设计的 siRNA， 长度为 21nt， 3’ 末端有两个脱氧核糖核苷酸 (dTdT)， 呈单链悬挂状态。
siRNA 的制备可采用多种方法， 比如 ： 化学合成法、 体外转录、 酶切长链 dsRNA、 载 体表达 siRNA、 PCR 合成 siRNA 表达元件等， 这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间， 可以更好地获得基因沉默效率。
本发明的 siRNA 分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分。出于应用目的， 可将 siRNA 分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位， 比如 病灶组织。
本发明的药物的剂型可以为多种形式， 只要适合于相应疾病的给药、 并且恰当地 保持 siRNA 分子的活性。比如， 对于注射用给药系统， 剂型可以是冻干粉。
任选地， 上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂， 只要其适合于相应 的给药体系、 并且恰当地保持 siRNA 分子的活性。
为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的 siRNA 的抗肿瘤效果， 设计了如下 实验方案 ：
(1) 设计靶向于 Bcl-2 基因的 siRNA 分子， 长度为 21nt， 3’ 末端悬挂有两个脱氧核 糖核苷酸 (dTdT)。
(2) 化学合成制备 siRNA 分子， 由百奥迈科生物技术有限公司合成， 双链 siRNA 纯 度＞ 95％， 用无核酸酶水溶解后可直接用于细胞转染。
(3) 运用实时定量 PCR 技术， 检测上述 siRNA 在细胞中对 Bcl-2 基因的抑制作用。
(4) 运用 Western Blot 技术， 检测上述 siRNA 抑制 Bcl-2 蛋白表达的情况。
下述实施例仅用于阐明本发明， 并非是对本发明进行限制。
实施例 1
siRNA 的设计与合成
根 据 GenBank 数 据 库 中 人 源 性 Bcl-2 基 因 开 放 阅 读 框 (ORF) 的 序 列， 用 Invitrogen 和 Thermo 公司的设计软件设计 siRNA 序列， 经 si-search 软件评分并在人类 EST 数据库中比对， 确定靶基因的唯一性， 以人类基因无同源性的 siRNA 序列为阴性对照 siRNA。
上述 siRNA 由百奥迈科生物技术有限公司合成， 双链 siRNA 纯度＞ 95％， 用无核酸 酶水溶解后可直接用于细胞转染。
实施例 2
siRNA 的细胞转染
人膀胱癌细胞系 T24 用含 10％胎牛血清的 1640 培养基， 37℃、 5％ CO2 条件下培养。 取生长状态良好的 T24 细胞， 转染前一天铺 6 孔细胞培养板， 调整每孔的细胞数， 使第二天 细胞汇合度达到 30％左右。设置 7 个实验组， 分别为 ：
编号 1 2 3 4 5实验组 si-B-1 转染组 si-B-2 转染组 si-B-3 转染组 si-B-4 转染组 si-B-5 转染组5101974533 A CN 101974537说6 7明书4/5 页阴性对照组 ( 转染阴性对照 siRNA) 未转染组转染前将培养基更换为无血清无双抗的 Opti-MEM 培养基 (Invitrogen 公司 ) 培 养细胞。以 6 孔板的一个孔为例， 用 Invitrogen 公司的 LipofectamineTM2000(Lipo2000) 脂质体转染 siRNA ： a) 用 250μL 无血清 Opti-MEM 培养基稀释 5μl Lipo2000， 轻轻混匀， 室温下静置 5min。b) 用 250μL 无血清 Opti-MEM 培养基稀释适量的 siRNA， 使转染时的终 浓度为 50nM。c) 混合 Lipo2000 和 siRNA 的稀释液 ( 总体积为 500μL)。轻轻混匀后， 室温 下静置 20min， 以形成 siRNA-Lipo2000 混和物。d) 逐滴将 siRNA-Lipo2000 混合液加入含 有细胞以及培养液的细胞培养板中， 轻轻摇晃， 使之混和。e) 将培养板置于 37℃的 CO2 培 养箱中培养。4-6h 后， 将孔里含 siRNA-Lipo2000 混合液的培养基移去， 更换新鲜的完全培 养基， 培养至检测时间检测。
每个转染组设 3 个复孔， 实验重复三次。
实施例 3
实时定量 PCR 法检测 siRNA 抑制 Bcl-2mRNA 表达
细胞总 RNA 提取 ： 按上述实施例 2 方法所转染的各组细胞， 培养 48h 后吸尽培养 TM 基， PBS 洗 2 遍。吸尽 PBS， 按每孔培养细胞中加入 1mL RISO ( 百奥迈科公司 ) 试剂， 在 室温下水平放置 5min， 使裂解液均匀分布于细胞表面， 然后吹打细胞使细胞脱落。将细胞 裂解液转移至 DEPC 处理的离心管中， 并反复吹打直至裂解液中无明显沉淀， 在室温下放置 5min， 使核酸蛋白复合物完全分离。按 1mL RISO 加入 0.2mL 氯仿的量向细胞裂解液中加入 氯仿， 盖紧管盖， 轻微振荡 15s， 室温静置 2-3min。12,000g， 离心 15min。小心吸取无色上清 液至新的 1.5mL DEPC 处理的 EP 管中。每管加入 0.5ml 异丙醇， 轻轻混匀， 室温静置 10min， 12,000g， 4℃离心 10min。弃去上清， 加 1mL 75％乙醇 ( 每使用 1mL RISO 试剂至少加 1ml 75％乙醇 )， 涡旋振荡混匀。7,500g， 4℃离心 5min 弃尽上清， 超净工作台干燥沉淀或真空 离心干燥， 加入适量 DEPC 处理水溶解 RNA 沉淀 ( 可在 55-60℃促溶 10min)。取少量 RNA 用 1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳观察 28S 和 18S 两条清晰条带， 以确保提取的总 RNA 的纯度 和完整性。
采用一步法实时荧光定量 PCR 检测目的基因 mRNA 的水平， 所用引物序列如下， 由 百奥迈科生物技术有限公司合成。
Bcl-2 引物 ：
上游引物 ： 5’ -GGCTGGGATGCCTTTGTG-3’
下游引物 ： 5’ -GCCAGGAGAAATCAAACAGAGG-3’
GAPDH 引物 ：
上游引物 ： 5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’
下游引物 ： 5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
反应体系为 ： RNA 模板 10pg ～ 100ng， 2×Master mix 12.5μL， 50×SYBR green I0.5μL， 上游引物 0.5μL， 下游引物 0.5μL， DEPC 处理水补足总体积至 25μL。每个样 TM 品做 3 个平行样。用 BIO-RAD 公司的 MyIQ 实时定量 PCR 仪进行反应， 反应条件为 ： 反转 录 42 ℃ /30min， 预 变 性 95 ℃ /5min， 95 ℃ /20s， 60 ℃ /20s， 72 ℃ /20s， 共 40 个 循 环。 以
60℃ -95℃， 0.5℃ /10s 测定溶解曲线。 结果通过 2-ΔΔCt 方法计算， 目的基因表达差异通过转 染组相对于未处理组的比值来表示， 结果见图 1。结果表明 ： si-B-3 有效抑制了 Bcl-2mRNA 的表达， 与未处理组相比抑制率为 88％。
实施例 4
Western Blot 法检测 siRNA 抑制 Bcl-2 蛋白表达
按上述实施例 2 所述方法转染 siRNA 到 T24 细胞中， 另余一孔做未处理组。转染 72h 后吸尽培养基， 预冷的 PBS 漂洗 2 遍， 吸尽 PBS。加入 50μL/ 孔的预冷的 RIPA 细胞裂 解液 ( 含 1mM PMSF)， 立即用细胞刮刀刮下细胞， 冰浴 0.5-1h。4℃， 12,000g 离心 15min 收 集上清至新的离心管中， 用标准 Bradfold 法测蛋白浓度。取各样品等量总蛋白 (20μg) 与 上样缓冲液混合， 沸水煮沸变性 10min 后， 用 12％的 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白， 按 《分子 克隆实验指南》 第二版中操作流程使用 Bio-Rad 公司的 Mini Trans-Blot 转膜电泳槽转移 印迹蛋白到 PVDF 膜 (Millipore) 上。转膜后的 PVDF 膜用 5％ (w/v) 脱脂奶粉 TBS 溶液室 温封闭 2h。TBST 漂洗膜 3 次， 10min/ 次， 之后用 1 ％ BSA 的 TBST 溶液 1 ： 200 倍稀释一抗 (Santa cruz 小鼠抗人 Bcl-2 单抗， 小鼠抗人 β-actin 单抗 )， 4℃孵育过夜。次日， TBST 室温漂洗 3 次， 10min/ 次。用 1％ BSA 的 TBST 溶液 1 ∶ 1000 稀释的羊抗小鼠二抗 (Santa Cruz) 室温孵育 2h。TBST 室温润洗 3 次， 10min/ 次。膜上滴加化学发光增强剂， 按试剂说 明进行操作， 将 X 光胶片附在膜上， 根据目的条带荧光亮度调整曝光时间， 经显影后拍照保 存。结果如图 2 所示， si-B-3 组的 Bcl-2 蛋白条带几乎不可见， 而未处理组 Bcl-2 蛋白清晰 可见， 各组间 β-actin 条带亮度基本一致。使用 Image J 软件进行灰度半定量分析后的结 果如图 3 所示， 结果表明 si-B-3 在蛋白水平也显著抑制了 Bcl-2 的表达， 抑制率为 83.2％， 与其实时定量 PCR 结果相符。
实施例 5
WST-8 法检测 siRNA 对细胞增殖能力的影响
取生长状态良好的细胞， 按 1000cells/ 孔的数量铺 96 孔板， 按实施例 4 所述方法 转染细胞， 转染后 48h， 72h， 96h 分别取细胞进行 WST-8 法检测细胞活力， 每个时间点设 5 个 复孔。 每孔加入 10μL WST-8 溶液， 在细胞培养箱中培养 2h， 酶标仪在 450nm 波长处检测每 孔的光密度 (A 值 )。
细胞增殖抑制率 (IR) ＝ (1- 实验组平均 A 值 / 对照组平均 A 值 )×100％。
各组 T24 细胞的生长曲线和增殖抑制率如图 4 和图 5 所示 ： si-B-3 转染组的 T24 细胞从转染后 48h 生长即被抑制， 在转染后第 96h 抑制效果最佳， 此时， si-B-3 的抑制率达 到了 31％。
实施例 6
siRNA 在制备抗肿瘤药物中的应用
本发明所述 si-B-3 用于制备抗肿瘤的药物， 可单独使用或与其他化疗， 放疗药物 联合使用。
以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变和变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明的范围。7101974533 A CN 101974537
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