抑肝散的生物测定方法 技术领域 本发明涉及一种抑肝散的测定方法， 更详细而言， 涉及一种能够利用神经系统培 养细胞来定量评价中药制剂抑肝散的生理活性值 ( 药理活性价 ) 的测定方法。
背景技术 中药是将生药混合而成的药品， 其活性成分并没有完全确定。 此外， 由于并不是仅 以单一的活性成分发挥效果， 而是共同起作用， 因此为了保证其品质， 需要能够对中药整体 进行评价的测定方法 ( 专利文献 1、 专利文献 2)。
在该测定方法中， 有测定个别的成分后对它们进行综合性评价的方法和采用生物 材料来评价生理活性的生物测定。而且在生物测定中， 有生物体内 ( 体内， in vivo) 试验 和试管内 ( 体外， in vitro) 试验， 但生物体内试验的体系在试验设施、 试验动物、 处理能力 等方面存在各种限制， 用于中药的品质评价时伴随有困难。
另一方面， 在试管内试验的体系中， 由于不需要特殊的设施， 且短时间内能获得稳 定的试验结果， 因此期望利用该体系来建立生物测定法， 实际上已有报道关于肌肉生长抑 制素 (Myostatin) 的生物测定法 ( 专利文献 3)。但是， 对于自身由包含多种有效成分的生 药组合而成的中药来说， 还没有发现通常适用的生物测定体系， 因而期待建立该生物测定 体系。
例如， 中药制剂抑肝散通常包含以下的组成， 但关于该制剂， 也还没有发现合适的 生物测定体系， 为了进行更高的品质保证， 期望开发该生物测定体系。
[ 表 1]
日文名 ( 英文名 ) 日本药典苍术 (JP 日本药典茯苓 (JP 日本药典川芎 (JP 日本药典当归 (JP 日本药典柴胡 (JP 日本药典甘草 (JP 日本药典钩藤 (JP
配方 Atractylodes Lancea Rhizome) Poria Sclerotium) Cnidium Rhizoma) Japanese Angelica Root) Bupleurum Root) Glycyrrhiza) Uncaria Hook) 4.0g 4.0g 3.0g 3.0g 2.0g 1.5g 3.0g专利文献 1 ： 日本特表 2000-512621
专利文献 2 ： 日本特表 2001-521876
专利文献 3 ： 日本特表 2005-520486
非 专 利 文 献 1： “PlantaMed.” 2004 May ； 70(5) ： 427-31.(Hong H， Liu GQ.Scutellarin attenuates oxidative glutamatetoxicity in PC 12 cells.)
非专利文献 2 ： “J.Ethnopharmacol.” 2005 Apr 8 ； 98(1-2) ： 89-94.(Yu D， DuanY， Bao Y， Wei C， An L.Isoflavonoids fromAstragalus mongholicus protect PC12 cells from toxicity inducedby L-glutamate.)
非专利文献 3 ： “Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.” 2004 Aug ； 31(8) ： 530-6.(Lee JH， Song DK， Jung CH， Shin DH， Park J， Kwon TK， Jang BC， Mun KC， Kim SP， Suh SI， Bae JH.(-)-Epigallocatechin gallate attenuates glutamate-inducedcytotoxicity via intracellular Ca modulation in C12 cells.) 发明内容 发明要解决的问题
因此， 本发明的课题在于发现能够保证抑肝散的更高品质的、 试管内试验的生物 测定体系。
用于解决问题的方案
本发明人等想到， 作为抑肝散的作用， 可能具有直接保护因谷氨酸所致的细胞死 亡的作用， 并进行了深入研究， 结果确认， 在谷氨酸的存在下培养通常在有关细胞死亡的研 究中使用的神经系统培养细胞， 以诱导细胞死亡， 如果同时添加抑肝散， 则细胞死亡得到抑 制， 且该抑制具有用量依赖性。并且发现， 应用该见解， 能够构建针对神经细胞死亡的抑肝 散的生物测定法， 从而完成了本发明。
即， 本发明为一种抑肝散的生物测定方法， 其特征在于， 在培养细胞的培养基中， 添加对诱导细胞死亡为充分量的谷氨酸和抑肝散， 根据培养基中的培养细胞的存活率来评 价抑肝散的药理活性价。
发明的效果
根据本发明的生物测定法， 能够不受试验设施、 试验动物、 处理能力等限制， 通过 试管内试验简便且稳定地求出抑肝散的生理活性值 ( 药理活性价 )。
附图说明 图 1 是表示使用通常血清和透析血清时谷氨酸添加量与存活细胞率的关系的附 图。图中， 标准是指通常血清， 透析后是指透析血清。
图 2 是表示 3 种板 ( 胶原、 Poly-L-lysine、 PRIMARIA( 注册商标 )) 中的、 谷氨酸 浓度与存活细胞的关系的附图。
图 3 是通过培养基添加物的有无来表示谷氨酸浓度与细胞存活率的关系的附图。 图中， PR(+) 是指含有酚红和 HEPES 的 RPMI 1640 培养基， PR(-) 是指不含酚红和 HEPES 的 RPMI1640 培养基。
图 4 是表示谷氨酸浓度与细胞存活率的关系的附图。
图 5 是表示谷氨酸浓度 17.5mM 的培养基中的、 TJ-54 的添加量与细胞存活率的关 系的附图。图中， 对照是指未添加谷氨酸时的细胞存活率。
图 6 是表示根据图 5 的结果以由 17.5mM 谷氨酸诱导的细胞死亡为基准的、 TJ-54 浓度依赖性抑制谷氨酸诱导的细胞死亡作用的标准曲线。
具体实施方式
本发明的抑肝散的生物测定法为如下方法 ： 在培养神经系统培养细胞的培养基 中， 添加对诱导细胞死亡为充分量的谷氨酸和抑肝散， 根据培养基中的神经系统培养细胞 的存活率来评价抑肝散的药理活性价。
本申请发明的抑肝散的生物测定法中， 作为神经系统培养细胞， 可利用作为同 类细胞而公知的细胞， 优选使用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤来源的 PC12 细胞。该 PC12 细胞 通常在有关细胞死亡的研究中广为使用， 其特征在于， 响应神经营养因子 (NerveGrowth Factor ： NGF)。在不存在 NGF 的培养中， 显示出肾上腺髓质嗜铬细胞的特征， 但存在 NGF 时 延伸出长的神经纤维并分化成交感神经节细胞样。其应用非常广泛， 特别是在分子生物 学的应用中记录了庞大的利用度。另外， 已知 PC12 细胞由于谷氨酸而引起细胞死亡， 并 且野黄芩苷 (Scutellarin)、 异黄酮 (Isoflavonoids)、 (-)- 表没食子儿茶素没食子酸酯 (Epigallocatechin gallate) 等植物来源成分可抑制该细胞死亡 ( 非专利文献 1 ～ 3)。
本发明中使用的 PC12 细胞可通过在包被有胶原的培养瓶中用添加有 5％胎牛血 清和 10％灭活马血清的 RPMI1640 培养基培养一定时期、 例如 3 天～ 7 天而制得。
另外， 虽然 PC12 细胞响应神经营养因子 (Nerve GrowthFactor ： NGF)， 但无论是否 有 NGF 刺激， PC12 细胞依赖于谷氨酸的浓度而引起细胞死亡。因此， 在实施本申请发明时， 是否有 NGF 刺激对 PC12 细胞没有影响。
在本申请发明的抑肝散的生物测定法中， 培养神经系统培养细胞的培养基中的谷 氨酸浓度必须为对诱导这些培养细胞的细胞死亡而言充分的浓度。然而， 将谷氨酸以高浓 度添加到培养基中时， 培养基中的 pH 偏酸性侧， 结果是， 培养环境变化对细胞死亡的影响 令人担忧， 因此， 必须选择能够以更低浓度的谷氨酸诱导细胞死亡的条件。
具体而言， 考虑到血清中存在谷氨酸、 该谷氨酸对神经细胞的存活率带来影响， 必 须研究血清的影响。进而， 培养神经系统的细胞时， 为了提高细胞对培养容器的粘附， 通常 包被细胞外基质 ( 胶原、 多聚赖氨酸等 )， 但对于这些也必须研究更好的基质。 此外， 作为培 养基添加物的酚红具有雌激素样活性， 有时会对吸光测定或荧光测定造成影响， 因此这也 必须进行研究。
并且， 作为由这些结果选定的最优细胞死亡诱导条件， 培养基中使用透析血清， 板 使用以胶原包被的板， 并使用不添加酚红的培养基。 然而， 本发明的生物测定法的实施并不 限定于这些条件。
本发明中， 用于有效地诱导细胞死亡的培养基中的谷氨酸的浓度优选为 1μM ～ 50mM， 更优选为 1mM ～ 20mM。
本发明的生物测定法的评价法的一个方式为如下方法 ： 在添加有对于诱导细胞死 亡充分的程度的量的谷氨酸和一定量的抑肝散的培养基中， 诱导 PC12 细胞的细胞死亡， 通 过 MTT 测定法测定存活细胞数， 根据其来评价抑肝散的药理活性价。
所述 MTT 测定法利用了下述事实 ： 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四氮 唑溴化物 (MTT) 是细胞内的线粒体的脱氢酶的底物， 存活能力越高的细胞则所还原的 MTT 量越多， 其结果是所产生的黄色～红色的甲臜 (formazan) 量与存活细胞数很好地对应。该 方法是仅能够测定活细胞的方法， 以 690nm 作为参比波长， 来测定 570nm 的波长下的样品的 吸光度。当然， 只要是能够测定存活细胞数的方法， 也可以采用其他公知方法。在该测定中， 通常优选同时对包含已知浓度的抑肝散的试样进行多点、 优选为 3 点以上的测定， 由此来定量待测试样中的抑肝散的药理活性价， 但如果条件基本没有改变， 则也可以使用已经由包含已知浓度的抑肝散的试样制作的标准曲线来测定。
如上述那样， 能够评价神经系统培养细胞中抑肝散的药理活性价， 且该作用机制 直接基于抑肝散的作用。 即， 根据本发明人等的研究， 发现抑肝散能够抑制由谷氨酸诱导的 神经系统培养细胞的细胞死亡， 由此， 能够评价抑肝散的抑制细胞死亡的药理活性价。
进而， 根据本发明的生物测定法， 通过对临床上已确认作为抑肝散的药理效果的 标准制剂和待测制剂在同一条件下评价药理活性价， 并比较标准制剂和待测制剂， 从而能 够对制剂的品质同等性进行评价。
此外， 关于多个制剂批次， 可通过下述方式评价品质同等性 ： 通过本发明的生物测 定法进行药理活性价的评价并由其平均等导出上下限的范围， 通过判断待测试样的药理活 性价是否符合该范围来评价。
实施例
下面列举出实施例， 对本发明进行更详细的说明， 但本发明不受这些实施例的任 何限定。 实施例 1
PC12 细胞的培养 ：
PC12 细胞 ( 供给源 ： 大日本住友制药株式会社 ) 的培养如下所述进行。即， 使用 2 包被有胶原 ( 胶原酸性溶液 IAC-15 ： 株式会社高研制 ) 的培养面积 75cm 的培养瓶， 向其中 加入下述培养基作为增殖培养基 ： 在向 500mL 的 RPMI1640 培养基 (GIBCO 22400-089) 中添 加有 5mL 的青霉素 - 链霉素溶液 (GIBCO 15070-063) 的含抗生素的培养基中， 还含有 5％的 胎牛血清 (FBS ； ICN 2916754) 和 10％的灭活马血清 (HS ； GIBCO26050) 的培养基。将冷冻 保存的 PC12 细胞解冻后， 用该增殖培养基培养 1 周以上， 用于实验。这里， PC12 细胞的传 代利用巴斯德吸管 (Pipette Pasteur)、 注射器通过机械剥离法来进行。另外， 包括以下的 实施例在内， 全部细胞培养在 37℃下含有 5％ CO2 的空气的 CO2 孵化器内进行。
实施例 2
谷氨酸诱导的细胞死亡 ：
利用实施例 1 中得到的 PC12 细胞， 研究谷氨酸有效地引起细胞死亡的培养条件。 其如下所述。
(1) 血清
研究血清对谷氨酸诱导的细胞死亡的影响。在通常的血清 (FBS 和 HS) 和透析血 清 ( 通过排阻极限 10000 道尔顿的超滤膜透析了的血清 ) 的比较中， 血清对谷氨酸诱导的 细胞死亡的影响没有确认到显著差异， 但出现透析血清容易诱导细胞死亡的倾向。结果示 于图 1 中。
(2) 包被
探索有效地使 PC12 细胞粘附在培养容器上的细胞基质。并且， 对胶原、 L- 多聚赖 氨酸 (Poly-L-lysine ： SIGMA P4707、 分子量 ： 70000-150000) 和 PRIMARIA( 注册商标 )( 表 面添加有含氮阳离子的初代培养用板 ) 这 3 种培养板进行研究。在显微镜下的观察中， 在 L- 多聚赖氨酸和 PRIMARIA( 注册商标 ) 的板中浮游有聚集的细胞， 由于细胞的粘附较弱， 细
胞数减少。将通过 MTT 测定法测定存活细胞的结果示于图 2 中。
(3) 培养基添加物
为了易于检测细胞死亡， 进行了培养基中的添加物的研究。以含有酚红和 HEPES 的 RPMI 1640(GIB CO 22400-089) 培 养 基 作 为 PR(+)， 以 不 含 酚 红 和 HEPES 的 RPMI 1640(GIBCO11835-030) 培养基作为 PR(-)， 进行比较研究。其结果是， 培养基中不含酚红的 培养基容易引起细胞死亡。将该结果示于图 3 中。
根据以上的研究， 对于因谷氨酸诱导的细胞死亡， 判断在以胶原包被的板中接种 细胞、 并使用添加有透析血清且不含酚红的培养基作为诱导培养基为最优培养条件。诱导 培养基是在向 500mL 的 RPMI 1640 培养基 (GIBCO 11835-030) 中添加有 5mL 的青霉素 - 链 霉素溶液的含抗生素的培养基中， 含有 5％的透析胎牛血清 (GIBCO 26400-044) 和 10％的 透析马血清 (BiowestS090D) 的培养基。
实施例 3
抑肝散的生物测定 ：
基于上述 (1) ～ (3) 的条件， 如下所述培养 PC12 细胞。
将 PC12 细胞以 5000 细胞 / 孔接种于以胶原包被的 96 孔板中， 从接种日开始用诱 导培养基培养 3 天， 接种第 2 天分别添加 1mM ～ 20mM 浓度的谷氨酸， 诱导细胞死亡。 从上述细胞死亡的诱导开始 24 小时后， 对上述的 96 孔板中的培养基 100μL 添 加 20μL 的 0.5％ MTT 液 (Dojindo 345-01821)， 培养 5 小时， 添加 100μL 的停止液 (10％ SDS in 0.01N HCl)， 将反应停止。将甲臜的晶体用吸管溶解， 放置一夜后， 以 690nm 作为参 比波长， 用分光光度计 (Multiskan MCC/340、 Titertek 公司制 ) 测定 570nm 波长下的吸光 度。然后， 基于所得吸光度， 通过下述计算式计算出细胞存活率。将其结果示于图 4 中。另 外， 测定值 ( 相对于对照的％ ) 以未添加谷氨酸组作为对照。
细胞存活率 (％ ) ＝ [(As-Abs)/(Ac-Abc)]×100
式中， As 是检查体的吸光度 ( 加有细胞、 添加有待测物的培养基和 MTT 溶液的孔 )
Ac 是阴性对照的吸光度 ( 加有细胞、 对照培养基和 MTT 溶液的孔 )
Abs 是检查体的空白吸光度 ( 加有待测物添加培养基和 MTT 溶液的孔 )
Abc 是阴性对照的空白吸光度 ( 加有对照培养基和 MTT 溶液的孔 )
接着， 从图 4 选择有效引起细胞死亡的谷氨酸浓度 17.5mM， 添加抑肝散 (TJ-54 ； 株 式会社津村制 )( 以下称为 “TJ-54” )， 与上述同样地由细胞存活率测定 TJ-54 对 PC12 细胞 的谷氨酸诱导细胞死亡的抑制效果。在 PC12 细胞中， 在 TJ-54 为 10 ～ 1000μg/ml 的范围 内抑制细胞死亡， 且该抑制显示出浓度依赖性。将该结果示于图 5 中。
该结果表示， TJ-54 浓度依存性地抑制因添加谷氨酸所导致的 MTT 活性的降低 ( 图 5)。 另外可知， 以由 17.5mM 谷氨酸诱导的细胞死亡为基准， 将添加 TJ-54 时的浓度依赖性抑 制细胞死亡的效果制成标准曲线， 从而能够利用于抑肝散的生物测定体系的构建 ( 图 6)。
产业上的可利用性
根据本发明， 通过试管内试验， 能够不受试验设施、 试验动物、 处理能力等的限制， 简便且稳定地求出抑肝散的药理活性价。
因此， 与现有的对所含的一定成分进行分析的方法相比， 能够以更高程度保证抑 肝散的品质。