抑肝散的生物测定方法.pdf

1、10申请公布号CN101981443A43申请公布日20110223CN101981443ACN101981443A21申请号200880128344322申请日20080403G01N33/15200601A61K36/18200601A61P25/28200601C12N5/06200601G01N33/5020060171申请人株式会社津村地址日本东京都72发明人五十岚康川上善治74专利代理机构北京林达刘知识产权代理事务所普通合伙11277代理人刘新宇李茂家54发明名称抑肝散的生物测定方法57摘要为了发现一种能够保证抑肝散的更高品质的、试管内试验的生物测定体系，提供了一种抑肝散的生物测定

2、方法，其特征在于，在培养培养细胞的培养基中，添加对诱导细胞死亡为充分量的谷氨酸和抑肝散，根据培养基中的培养细胞的存活率来评价抑肝散的药理活性价。85PCT申请进入国家阶段日2010092786PCT申请的申请数据PCT/JP2008/0566842008040387PCT申请的公布数据WO2009/122580JA2009100851INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图3页CN101981452A1/1页21一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，在培养培养细胞的培养基中，添加对诱导细胞死亡为充分量的谷氨酸和抑肝散，根据培养基中的培养细胞的存活率

3、来评价抑肝散的药理活性价。2根据权利要求1所述的抑肝散的生物测定方法，其中，培养细胞为神经系统培养细胞。3根据权利要求1所述的抑肝散的生物测定方法，其中，培养细胞为PC12细胞。4根据权利要求13中任一项所述的抑肝散的生物测定方法，其中，培养培养细胞的培养基中的谷氨酸的浓度为1M50MM。权利要求书CN101981443ACN101981452A1/5页3抑肝散的生物测定方法技术领域0001本发明涉及一种抑肝散的测定方法，更详细而言，涉及一种能够利用神经系统培养细胞来定量评价中药制剂抑肝散的生理活性值药理活性价的测定方法。背景技术0002中药是将生药混合而成的药品，其活性成分并没有完全确定。此

4、外，由于并不是仅以单一的活性成分发挥效果，而是共同起作用，因此为了保证其品质，需要能够对中药整体进行评价的测定方法专利文献1、专利文献2。0003在该测定方法中，有测定个别的成分后对它们进行综合性评价的方法和采用生物材料来评价生理活性的生物测定。而且在生物测定中，有生物体内体内，INVIVO试验和试管内体外，INVITRO试验，但生物体内试验的体系在试验设施、试验动物、处理能力等方面存在各种限制，用于中药的品质评价时伴随有困难。0004另一方面，在试管内试验的体系中，由于不需要特殊的设施，且短时间内能获得稳定的试验结果，因此期望利用该体系来建立生物测定法，实际上已有报道关于肌肉生长抑制素MYO

5、STATIN的生物测定法专利文献3。但是，对于自身由包含多种有效成分的生药组合而成的中药来说，还没有发现通常适用的生物测定体系，因而期待建立该生物测定体系。0005例如，中药制剂抑肝散通常包含以下的组成，但关于该制剂，也还没有发现合适的生物测定体系，为了进行更高的品质保证，期望开发该生物测定体系。0006表10007日文名英文名配方日本药典苍术JPATRACTYLODESLANCEARHIZOME日本药典茯苓JPPORIASCLEROTIUM日本药典川芎JPCNIDIUMRHIZOMA日本药典当归JPJAPANESEANGELICAROOT日本药典柴胡JPBUPLEURUMROOT日本药典甘草

6、JPGLYCYRRHIZA日本药典钩藤JPUNCARIAHOOK40G40G30G30G20G15G30G0008专利文献1日本特表20005126210009专利文献2日本特表20015218760010专利文献3日本特表20055204860011非专利文献1“PLANTAMED”2004MAY；70542731HONGH，LIUGQSCUTELLARINATTENUATESOXIDATIVEGLUTAMATETOXICITYINPC12CELLS0012非专利文献2“JETHNOPHARMACOL”2005APR8；98128994YUD，DUAN说明书CN101981443ACN101

7、981452A2/5页4Y，BAOY，WEIC，ANLISOFLAVONOIDSFROMASTRAGALUSMONGHOLICUSPROTECTPC12CELLSFROMTOXICITYINDUCEDBYLGLUTAMATE0013非专利文献3“CLINEXPPHARMACOLPHYSIOL”2004AUG；3185306LEEJH，SONGDK，JUNGCH，SHINDH，PARKJ，KWONTK，JANGBC，MUNKC，KIMSP，SUHSI，BAEJHEPIGALLOCATECHINGALLATEATTENUATESGLUTAMATEINDUCEDCYTOTOXICITYVIAINTR

8、ACELLULARCAMODULATIONINC12CELLS发明内容0014发明要解决的问题0015因此，本发明的课题在于发现能够保证抑肝散的更高品质的、试管内试验的生物测定体系。0016用于解决问题的方案0017本发明人等想到，作为抑肝散的作用，可能具有直接保护因谷氨酸所致的细胞死亡的作用，并进行了深入研究，结果确认，在谷氨酸的存在下培养通常在有关细胞死亡的研究中使用的神经系统培养细胞，以诱导细胞死亡，如果同时添加抑肝散，则细胞死亡得到抑制，且该抑制具有用量依赖性。并且发现，应用该见解，能够构建针对神经细胞死亡的抑肝散的生物测定法，从而完成了本发明。0018即，本发明为一种抑肝散的生物测定

9、方法，其特征在于，在培养细胞的培养基中，添加对诱导细胞死亡为充分量的谷氨酸和抑肝散，根据培养基中的培养细胞的存活率来评价抑肝散的药理活性价。0019发明的效果0020根据本发明的生物测定法，能够不受试验设施、试验动物、处理能力等限制，通过试管内试验简便且稳定地求出抑肝散的生理活性值药理活性价。附图说明0021图1是表示使用通常血清和透析血清时谷氨酸添加量与存活细胞率的关系的附图。图中，标准是指通常血清，透析后是指透析血清。0022图2是表示3种板胶原、POLYLLYSINE、PRIMARIA注册商标中的、谷氨酸浓度与存活细胞的关系的附图。0023图3是通过培养基添加物的有无来表示谷氨酸浓度与细

10、胞存活率的关系的附图。图中，PR是指含有酚红和HEPES的RPMI1640培养基，PR是指不含酚红和HEPES的RPMI1640培养基。0024图4是表示谷氨酸浓度与细胞存活率的关系的附图。0025图5是表示谷氨酸浓度175MM的培养基中的、TJ54的添加量与细胞存活率的关系的附图。图中，对照是指未添加谷氨酸时的细胞存活率。0026图6是表示根据图5的结果以由175MM谷氨酸诱导的细胞死亡为基准的、TJ54浓度依赖性抑制谷氨酸诱导的细胞死亡作用的标准曲线。说明书CN101981443ACN101981452A3/5页5具体实施方式0027本发明的抑肝散的生物测定法为如下方法在培养神经系统培养细

11、胞的培养基中，添加对诱导细胞死亡为充分量的谷氨酸和抑肝散，根据培养基中的神经系统培养细胞的存活率来评价抑肝散的药理活性价。0028本申请发明的抑肝散的生物测定法中，作为神经系统培养细胞，可利用作为同类细胞而公知的细胞，优选使用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤来源的PC12细胞。该PC12细胞通常在有关细胞死亡的研究中广为使用，其特征在于，响应神经营养因子NERVEGROWTHFACTORNGF。在不存在NGF的培养中，显示出肾上腺髓质嗜铬细胞的特征，但存在NGF时延伸出长的神经纤维并分化成交感神经节细胞样。其应用非常广泛，特别是在分子生物学的应用中记录了庞大的利用度。另外，已知PC12细胞由于谷氨酸而引起

12、细胞死亡，并且野黄芩苷SCUTELLARIN、异黄酮ISOFLAVONOIDS、表没食子儿茶素没食子酸酯EPIGALLOCATECHINGALLATE等植物来源成分可抑制该细胞死亡非专利文献13。0029本发明中使用的PC12细胞可通过在包被有胶原的培养瓶中用添加有5胎牛血清和10灭活马血清的RPMI1640培养基培养一定时期、例如3天7天而制得。0030另外，虽然PC12细胞响应神经营养因子NERVEGROWTHFACTORNGF，但无论是否有NGF刺激，PC12细胞依赖于谷氨酸的浓度而引起细胞死亡。因此，在实施本申请发明时，是否有NGF刺激对PC12细胞没有影响。0031在本申请发明的抑肝

13、散的生物测定法中，培养神经系统培养细胞的培养基中的谷氨酸浓度必须为对诱导这些培养细胞的细胞死亡而言充分的浓度。然而，将谷氨酸以高浓度添加到培养基中时，培养基中的PH偏酸性侧，结果是，培养环境变化对细胞死亡的影响令人担忧，因此，必须选择能够以更低浓度的谷氨酸诱导细胞死亡的条件。0032具体而言，考虑到血清中存在谷氨酸、该谷氨酸对神经细胞的存活率带来影响，必须研究血清的影响。进而，培养神经系统的细胞时，为了提高细胞对培养容器的粘附，通常包被细胞外基质胶原、多聚赖氨酸等，但对于这些也必须研究更好的基质。此外，作为培养基添加物的酚红具有雌激素样活性，有时会对吸光测定或荧光测定造成影响，因此这也必须进行

14、研究。0033并且，作为由这些结果选定的最优细胞死亡诱导条件，培养基中使用透析血清，板使用以胶原包被的板，并使用不添加酚红的培养基。然而，本发明的生物测定法的实施并不限定于这些条件。0034本发明中，用于有效地诱导细胞死亡的培养基中的谷氨酸的浓度优选为1M50MM，更优选为1MM20MM。0035本发明的生物测定法的评价法的一个方式为如下方法在添加有对于诱导细胞死亡充分的程度的量的谷氨酸和一定量的抑肝散的培养基中，诱导PC12细胞的细胞死亡，通过MTT测定法测定存活细胞数，根据其来评价抑肝散的药理活性价。0036所述MTT测定法利用了下述事实34，5二甲基噻唑2基2，5二苯基四氮唑溴化物MTT

15、是细胞内的线粒体的脱氢酶的底物，存活能力越高的细胞则所还原的MTT量越多，其结果是所产生的黄色红色的甲臜FORMAZAN量与存活细胞数很好地对应。该方法是仅能够测定活细胞的方法，以690NM作为参比波长，来测定570NM的波长下的样品的吸光度。当然，只要是能够测定存活细胞数的方法，也可以采用其他公知方法。说明书CN101981443ACN101981452A4/5页60037在该测定中，通常优选同时对包含已知浓度的抑肝散的试样进行多点、优选为3点以上的测定，由此来定量待测试样中的抑肝散的药理活性价，但如果条件基本没有改变，则也可以使用已经由包含已知浓度的抑肝散的试样制作的标准曲线来测定。003

16、8如上述那样，能够评价神经系统培养细胞中抑肝散的药理活性价，且该作用机制直接基于抑肝散的作用。即，根据本发明人等的研究，发现抑肝散能够抑制由谷氨酸诱导的神经系统培养细胞的细胞死亡，由此，能够评价抑肝散的抑制细胞死亡的药理活性价。0039进而，根据本发明的生物测定法，通过对临床上已确认作为抑肝散的药理效果的标准制剂和待测制剂在同一条件下评价药理活性价，并比较标准制剂和待测制剂，从而能够对制剂的品质同等性进行评价。0040此外，关于多个制剂批次，可通过下述方式评价品质同等性通过本发明的生物测定法进行药理活性价的评价并由其平均等导出上下限的范围，通过判断待测试样的药理活性价是否符合该范围来评价。00

17、41实施例0042下面列举出实施例，对本发明进行更详细的说明，但本发明不受这些实施例的任何限定。0043实施例10044PC12细胞的培养0045PC12细胞供给源大日本住友制药株式会社的培养如下所述进行。即，使用包被有胶原胶原酸性溶液IAC15株式会社高研制的培养面积75CM2的培养瓶，向其中加入下述培养基作为增殖培养基在向500ML的RPMI1640培养基GIBCO22400089中添加有5ML的青霉素链霉素溶液GIBCO15070063的含抗生素的培养基中，还含有5的胎牛血清FBS；ICN2916754和10的灭活马血清HS；GIBCO26050的培养基。将冷冻保存的PC12细胞解冻后，

18、用该增殖培养基培养1周以上，用于实验。这里，PC12细胞的传代利用巴斯德吸管PIPETTEPASTEUR、注射器通过机械剥离法来进行。另外，包括以下的实施例在内，全部细胞培养在37下含有5CO2的空气的CO2孵化器内进行。0046实施例20047谷氨酸诱导的细胞死亡0048利用实施例1中得到的PC12细胞，研究谷氨酸有效地引起细胞死亡的培养条件。其如下所述。00491血清0050研究血清对谷氨酸诱导的细胞死亡的影响。在通常的血清FBS和HS和透析血清通过排阻极限10000道尔顿的超滤膜透析了的血清的比较中，血清对谷氨酸诱导的细胞死亡的影响没有确认到显著差异，但出现透析血清容易诱导细胞死亡的倾向

19、。结果示于图1中。00512包被0052探索有效地使PC12细胞粘附在培养容器上的细胞基质。并且，对胶原、L多聚赖氨酸POLYLLYSINESIGMAP4707、分子量70000150000和PRIMARIA注册商标表面添加有含氮阳离子的初代培养用板这3种培养板进行研究。在显微镜下的观察中，在L多聚赖氨酸和PRIMARIA注册商标的板中浮游有聚集的细胞，由于细胞的粘附较弱，细说明书CN101981443ACN101981452A5/5页7胞数减少。将通过MTT测定法测定存活细胞的结果示于图2中。00533培养基添加物0054为了易于检测细胞死亡，进行了培养基中的添加物的研究。以含有酚红和HEP

20、ES的RPMI1640GIBCO22400089培养基作为PR，以不含酚红和HEPES的RPMI1640GIBCO11835030培养基作为PR，进行比较研究。其结果是，培养基中不含酚红的培养基容易引起细胞死亡。将该结果示于图3中。0055根据以上的研究，对于因谷氨酸诱导的细胞死亡，判断在以胶原包被的板中接种细胞、并使用添加有透析血清且不含酚红的培养基作为诱导培养基为最优培养条件。诱导培养基是在向500ML的RPMI1640培养基GIBCO11835030中添加有5ML的青霉素链霉素溶液的含抗生素的培养基中，含有5的透析胎牛血清GIBCO26400044和10的透析马血清BIOWESTS090

21、D的培养基。0056实施例30057抑肝散的生物测定0058基于上述13的条件，如下所述培养PC12细胞。0059将PC12细胞以5000细胞/孔接种于以胶原包被的96孔板中，从接种日开始用诱导培养基培养3天，接种第2天分别添加1MM20MM浓度的谷氨酸，诱导细胞死亡。0060从上述细胞死亡的诱导开始24小时后，对上述的96孔板中的培养基100L添加20L的05MTT液DOJINDO34501821，培养5小时，添加100L的停止液10SDSIN001NHCL，将反应停止。将甲臜的晶体用吸管溶解，放置一夜后，以690NM作为参比波长，用分光光度计MULTISKANMCC/340、TITERTE

22、K公司制测定570NM波长下的吸光度。然后，基于所得吸光度，通过下述计算式计算出细胞存活率。将其结果示于图4中。另外，测定值相对于对照的以未添加谷氨酸组作为对照。0061细胞存活率ASABS/ACABC1000062式中，AS是检查体的吸光度加有细胞、添加有待测物的培养基和MTT溶液的孔0063AC是阴性对照的吸光度加有细胞、对照培养基和MTT溶液的孔0064ABS是检查体的空白吸光度加有待测物添加培养基和MTT溶液的孔0065ABC是阴性对照的空白吸光度加有对照培养基和MTT溶液的孔0066接着，从图4选择有效引起细胞死亡的谷氨酸浓度175MM，添加抑肝散TJ54；株式会社津村制以下称为“T

23、J54”，与上述同样地由细胞存活率测定TJ54对PC12细胞的谷氨酸诱导细胞死亡的抑制效果。在PC12细胞中，在TJ54为101000G/ML的范围内抑制细胞死亡，且该抑制显示出浓度依赖性。将该结果示于图5中。0067该结果表示，TJ54浓度依存性地抑制因添加谷氨酸所导致的MTT活性的降低图5。另外可知，以由175MM谷氨酸诱导的细胞死亡为基准，将添加TJ54时的浓度依赖性抑制细胞死亡的效果制成标准曲线，从而能够利用于抑肝散的生物测定体系的构建图6。0068产业上的可利用性0069根据本发明，通过试管内试验，能够不受试验设施、试验动物、处理能力等的限制，简便且稳定地求出抑肝散的药理活性价。0070因此，与现有的对所含的一定成分进行分析的方法相比，能够以更高程度保证抑肝散的品质。说明书CN101981443ACN101981452A1/3页8图1图2说明书附图CN101981443ACN101981452A2/3页9图3图4说明书附图CN101981443ACN101981452A3/3页10图5图6说明书附图CN101981443A