一种己酸菌.pdf

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1、10申请公布号CN101942405A43申请公布日20110112CN101942405ACN101942405A21申请号201010238106722申请日20100727CCTCCNOM201017520100713C12N1/20200601C12G3/02200601C12R1/14520060171申请人湖北工业大学地址430068湖北省武汉市武昌南湖李家墩特1号72发明人陈茂彬镇达方尚玲汪江波74专利代理机构武汉帅丞知识产权代理有限公司42220代理人朱必武54发明名称一种己酸菌57摘要本发明的目的在于提供一种己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13菌株CCTCC。

2、NOM2010175。该菌株具有高产己酸及较好的生长稳定性特征，经强化功能菌后可用于制备高浓度复合己酸菌液，与应用于人工窖泥的培养，在实际生产中达到缩短新建窖池老熟周期与退化窖池功能复壮的效果，提高了出酒率和优品率，解决退化老窖池复壮及缩短新建窖池老熟时间等问题。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图3页CN101942410A1/1页21己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13菌株CCTCCNOM2010175。2如权利要求1所述的菌株，其特征在于它的培养特征为乙醇醋酸钠培养基厌氧培养35培养4D，菌株为淡褐色。

3、，扁平中间稍凸起，质地柔软，菌落大小1420CM；乙酸钠培养基真空厌氧培养35培养4D，菌株为浅黄色，扁平中间稍凸起，质地柔软，菌落大小0816CM。3如权利要求1所述的菌株，其特征在于它的形态特征为梭状芽孢杆菌，短杆端生芽孢，呈鼓锤状，18M24M，革兰氏阴性菌。4如权利要求1所述的菌株，其特征在于它的生物学特性为所述菌株菌体芽孢菌数数量与产酸量随着培养时间增加先后达到峰值，芽孢菌数6D7D达到高峰，己酸产量则在10D左右达到高峰；生长温度范围为2545；对乙醇有较好的耐受性，在乙醇浓度07范围内均能生长；在PH2070范围内均能生长，不适宜在碱性环境下生长。5如权利要求4所述的菌株，其特征。

4、在于所述菌株的生长温度范围为3238。6如权利要求4所述的菌株，其特征在于所述菌株的乙醇耐受浓度为20。7如权利要求4所述的菌株，其特征在于所述菌株在PH65PH70能生长。8如权利要求1所述的菌株，其特征在于所述菌株在EAM培养基35培养4D，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，生物学性状稳定。权利要求书CN101942405ACN101942410A1/7页3一种己酸菌技术领域0001本发明涉及一种微生物，尤其是涉及一种能够应用于人工窖泥培养及退化老窖池养护，快速增加窖泥中主要功能菌数量，缩短窖池老熟时间的高产己酸菌株。背景技术0002浓香型大曲酒发酵采用独特的泥窖发酵工艺。

5、，属于多种微生物群的共同发酵，是一个复杂的生物化学反应体系。研究发现，浓香型白酒以己酸乙酯为主体香味物质，己酸乙酯含量多少直接影响大曲酒的质量。它来源于栖息在窖泥中一类梭状芽孢杆菌己酸菌所产己酸与酒醅中酵母产生的乙醇的化合。在发酵过程中，己酸与己酸乙酯的生成主要在窖泥与酒醅接触的界面上进行，梭状芽孢杆菌在环境条件适宜时，通过下列途径合成己酸乙酯00031乙醇和乙酸结合生成丁酸，丁酸再与乙醇结合生成己酸。000400052己酸与乙醇发生酯化反应，生成浓香型白酒的主体香己酸乙酯。0006CH3CH24COOHCH3CH2OHCH3CH24COOC2H5H2O0007人们很早就在生产实践过程中发现，。

6、浓香型大曲酒产酒质量的优劣与泥窖的窖龄有关。一般而言，发酵窖池窖龄越长，产酒质量越好。但是，新建窖池依靠自然老熟要达到老窖的标准，需要经过漫长的岁月，短则数十年长则几十年。同时，发酵窖池由于自然环境的变化、窖池内生化反应作用等综合原因，使得窖泥中的营养成分的缺失及酸碱度的变化，己酸菌生长繁殖与代谢受到抑制，引起窖池老化、功能退化，产酒质量下降的现象。己酸菌作为窖泥中关键功能菌，在窖泥中含量多少决定了窖泥的质量。0008浓香型大曲酒厂随着生产需求的不断扩大，要构建新窖池，但新建窖池并不能马上生产出优质酒，并且老窖池由于各种原因可能也会出现退化。为了使新建窖池和退化老窖池尽快产出好酒，科研技术工作。

7、者开始对发酵窖池的研究，利用各种生物科技手段，探究老窖泥生化功能及发酵窖泥的老熟机理，以期缩短新建窖池达到优质窖泥水平自然老熟过程及恢复退化窖池的生化功能。0009高素洁等人生物技术1997年第7期己酸菌的分离筛选及发酵条件的研究公开了一株从黑龙江省富裕酒厂的窖泥中分离到高产己酸的菌株，并通过发酵条件的研究，该菌株己酸最高产量可达540MG/100ML。然而，该文献没有对该菌株做种属鉴定，也没有公开该菌株的拉丁名称。吴根福等人杭州太学学报自然科学版1996年7月第23卷第3期己酸菌的自然选育及其生物学特性的初步研究公开了一株从杭州酒厂三家村分厂的大曲酒窖池底泥中分离到产己酸量较高的菌株，经初步。

8、鉴定为梭状芽孢杆菌属，并推测是克氏控状芽孢杆菌CLOSTRIDIUMKLUYVERI，其最适生长温度35，最适PH为70说明书CN101942405ACN101942410A2/7页4左右，最适酵母提取物浓度在生长时为1、产酸时为01，乙醇浓度在14范围内对生长和产酸影响不大；在醋酸钠培养基中生长10天，己酸产量最高可达380MG/100ML。周春红等人食品与发酵工业，浓香型大曲酒生产中己酸菌的制备公开了从白酒厂的窖池中提取己酸菌进行人工培养强化，再模仿天然状态条件混合窖泥共同厌氧发酵，以达到己酸菌的自然生长条件，并对采用人工窑泥生产的浓香型白酒进行了评定，结果是，己酸乙酯的含量最高为305G。

9、/L，总酯的产量最高为462G/L。中国专利CN101306020公开了己酸菌在制备预防和治疗肠癌药物组合物中的应用，包括预防肠息肉、克罗恩病、溃疡性结肠炎等慢性肠道疾病癌变、晚期不能手术肠癌的辅助治疗、肠癌手术后的辅助治疗等，己酸菌选自但不限于己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMCGMCC03131。发明内容0010本发明的目的在于提供一种己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13。该菌株具有高产己酸及较好的生长稳定性特征，经强化功能菌后可用于制备高浓度复合己酸菌液，应用于人工窖泥的培养，在实际生产中达到缩短新建窖池老熟周期与退化窖池功能复壮的效果，提高了出酒率和优品率。

10、，解决退化老窖池复壮及缩短新建窖池老熟时间等问题。0011发明人通过大量试验筛选各地名优浓香型大曲酒优质老窖泥，最终获得了本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13，并于2010年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOM2010175。0012本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13的形态特征如下0013于1000倍显微镜观察高产己酸菌株GK13的菌体形态，菌株形态特征为梭状芽孢杆菌，短杆端生芽孢，呈鼓锤状，18M24M，革兰氏阴性菌。0014本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13的培养特征如下0015。

11、分离培养基乙醇醋酸钠培养基，ETHANOLACETATEMEDIUM，EAM乙醇20灭菌后使用前加入、NAAC05、酵母01、MGSO47H2O002、K2HPO4004、NH42SO4005、CACO310，自然PH；固体培养基加入30的琼脂参见图1。0016乙酸钠培养基CO2厌氧培养箱35培养4D，淡褐色，扁平中间稍凸起，质地柔软，菌落大小1420CM。0017乙酸钠培养基真空厌氧培养35培养4D，浅黄色，扁平中间稍凸起，质地柔软，菌落大小0816CM参见图2。0018本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13的生物学特性如下0019己酸菌CLOSTRIDIUMBUTY。

12、RICUMGK13己酸菌菌体芽孢菌数数量与产酸量随着培养时间增加先后达到峰值，芽孢菌数6D7D达到高峰，己酸产量则在10D左右达到高峰。生长温度范围为2545，最适培养温度为3238；对乙醇有较好的耐受性，在乙醇浓度07范围内均能生长，最适培养乙醇浓度为20；在PH20PH70范围内均能生长，不适宜在碱性环境下生长，最适PH值为PH65PH70。0020本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13的在EAM培养基35培养4D，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。0021本发明涉及的微生物，通过强化功能菌方式，而获得高浓度复合己酸菌系。

13、，运用于退化老窖池的复壮与人工窖泥的培养，能够在较短的周期内提高退化窖池与新建窖池的出说明书CN101942405ACN101942410A3/7页5酒率和优质率。该操作简单，效果明显，不改变原有的生产流程，且酒的质量和风味都稳定。既经济又环保，减少企业开支，提高经济效益。0022本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13菌种与现有技术相比，具有如下有益的技术效果00231通过实施例2可以看出，含有己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13菌种的复合己酸菌系，产己酸的水平为8560MG/100ML，产丁酸的水平为3620MG/100ML，比高素洁等人生物技术19。

14、97年第7期己酸菌的分离筛选及发酵条件的研究报道的菌株产己酸量高3160MG/100ML，具有显著的进步。00242通过实施例3可以看出，利用本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13菌种制备的复合己酸菌菌系ZC21，在人工窖泥培养中的总酸产量水平可高达115G/L，总酯产量水平可高达57LG/L，己酸乙酯的产量水平可高达26919MG/100ML。比周春红等人食品与发酵工业，浓香型大曲酒生产中己酸菌的制备报道的菌株总酯产量高109G/L。另外，从表24实验结果表明，应用复合己酸菌ZC21菌液于人工培养的老窖泥，能够有效的维护老窖池中窖泥的营养平衡，稳定并增强窖内优势菌群，。

15、感官评定、理化和微生物指标均与优质老窖泥质量相接近。应用于扩建的新窖池中能快速形成窖内有益微生物生态环境，窖泥质量在短期内接近于成熟窖池，第三排便所产原酒的四大酯比例为己酸乙酯乳酸乙酯乙酸乙酯丁酸乙酯10630590096，其比例协调，感官评定完全达到了优质基酒的标准。00253通过实施例4可以看出，利用本发明的己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13菌种制备的复合己酸菌菌系ZC21，在退化老窖池复壮中的己酸乙酯产量依然可以高达33078MG/100ML，总酯的产量可高达82395MG/100ML，比周春红等人食品与发酵工业，浓香型大曲酒生产中己酸菌的制备报道的菌株总酯产量高36。

16、2G/L，己酸乙酯产量高出026G/L。另外，表5数据结果表明，复合己酸菌菌系ZC21能有效补充了窖内优势菌群，提高了窖泥的生香功能。采用窖泥培养液复壮窖池，激活和增加了有益微生物菌群，使己酸乙酯含量显著提高。四大酯比例较为协调，窖内发酵能力增强，生香功能明显提高。附图说明0026图1为本发明所述的高产己酸菌株GK13在EAM培养基上CO2厌氧培养的菌落图0027图2为本发明所述的高产己酸菌株GK13在EAM培养基上真空培养的菌落图0028图3为本发明所述的高产己酸菌株GK13在1000倍显微镜菌体形态图0029图4为本发明所述的高产己酸菌株GK13在16SRDNAPCR产物电泳图，其中1为D。

17、NAMARKER，2为16SRDNAPCR产物具体实施方式0030以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。0031实施例1己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13的制备0032己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13是一株分离于浓香型白酒优质老窖泥的梭说明书CN101942405ACN101942410A4/7页6状芽孢杆菌，分离培养基EAM培养基乙醇20灭菌后使用前加入、NAAC05、酵母01、MGSO47H2O002、K2HPO4004、。

18、NH42SO4005、CACO310，自然PH；固体培养基加入30的琼脂。取各窖泥样品通过80热处理方式，经富集培养做硫酸铜显色进行初筛，选取产酸产气情况较好的样品进一步筛选，对产物做气相色谱定性定量分析，选取产己酸水平最佳的试样进行分离纯化。取复筛试样液1ML，加无菌水10ML，振荡1MIN，接种环取少量液体在琼脂分离培养基上划线，每样4皿。在真空条件与CO2厌氧条件下，35培养3D4D，获得单菌落。该菌种在平板上纯化，确定为单一菌种后，经镜检观察选取梭状芽孢杆菌，接种于EAM液态培养基发酵培养2周，对产物做气相色谱分析，最终确定筛选菌株，对该菌株进行生理生化鉴定和性能实验，该菌最适生长温度。

19、35，最适PH范围PH65PH70在液体静止培养时利用乙醇、乙酸钠与各类微量因子等多种底物生长，生成己酸和丁酸为主的产物，经16SRDNA测序鉴定为己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUM，并命名为己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13，已于2010年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOM2010175。0033实施例2复合己酸菌系的制备0034取己酸菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMGK13菌种，复合甲烷菌与丁酸菌进行强化，采用80热处理方式对复合菌系进行复壮，制备成高浓度复合己酸菌菌系ZC21。经强化后，ZC21产酸水平与产芽孢总量。

20、菌有较大幅度的提升，并且经多次传代培养结果分析表明，该菌系产酸水平及芽孢菌体生长情况未出现退化现象，具有较好的稳定性。试验结果见表1。0035表1复合己酸菌菌系ZC21产酸、芽孢的水平00360037实施例3实施例2制备的复合己酸菌菌系ZC21在人工窖泥培养中的应用00381人工窖泥培养配方复合己酸菌液10，优质大曲粉20，优质母糟66，老窖泥44，豆饼粉13，骨粉13，尿素13，白糖13，磷酸氢二钾13，酒尾酒精28，黄泥100，底锅黄水250，黄土3621。00392人工窖泥培养工艺流程0040粘黄土粉、泥、窖皮泥等分层配料润料酯化液营养液翻拌复合己酸菌液酒尾等踩揉和泥堆积发酵入池发酵窖泥。

21、质量检测生产应用00413人工窖泥培养操作步骤0042步骤一先将鲜黄泥干细黄泥或优质泥、窖皮泥、活性淤泥、粮糟、泥碳等原辅料按配方一层层铺好，厚度控制在30CM50CM左右，然后加入由接种泥、己酸菌培养液、发酵液、大曲酒等的混合液体，充分拌匀、收堆，高约1M，再泼部分混合液，控制水分在3538，表面拍光，涂上一层黄泥浆。外用塑料薄膜盖住，边头处用黄泥密封。插上温度计，说明书CN101942405ACN101942410A5/7页7观察发酵变化情况。如温度不够，用热丢糟进行覆盖，使发酵温度保持在32以上。发酵25D30D，进行常规理化分析和感官鉴定。0043步骤二进行翻堆，断面色泽鲜艳，气味正常。

22、无明显的异杂味、泡气。根据检测结果，补充所需的营养成分。控制水分在3639，32以上堆积发酵2530D，处理方法同前。0044步骤三经过两轮的发酵，窖泥已基本成熟，感官上呈黄褐色或黑褐色，基本上无原料本色，有较明显的老窖泥气味。镜检中有较多的梭状芽孢杆菌，理化指标基本上能达到。处理得当，该轮结束就可以做为成品泥。此轮翻堆足将泥踩至柔熟，重点补充菌液及营养物质。收堆后表面上喷洒高浓度酒，保持温度于38，发酵25D30D。0045步骤四经过三个月的发酵，窖泥已经成熟。成熟的窖泥色泽呈乌黑、黑褐色，无原料本色，质地均匀，断面泡气，有明显的老窖泥气味，镜检含有丰富、健壮的梭状芽孢杆菌。00464人工窖。

23、泥的应用效果检验0047对比分析退化窖泥、人工窖泥及优质窖泥营养成分和微生物指标，以及将经复合己酸菌系培育的人工窖泥应用实际生产酿造过程，同经退化窖池与优质老窖池发酵产酒质量对比分析其理化指标。结果见表24。0048表2三种窖泥成分比较00490050表3窖泥感官比较0051说明书CN101942405ACN101942410A6/7页80052表4产酒理化指标比较00530054从表24实验结果表明，应用复合己酸菌ZC21菌液于人工培养的老窖泥，能够有效的维护老窖池中窖泥的营养平衡，稳定并增强窖内优势菌群，感官评定、理化和微生物指标均与优质老窖泥质量相接近。应用于扩建的新窖池中能快速形成窖内。

24、有益微生物生态环境，窖泥质量在短期内接近于成熟窖池，第三排便所产原酒的四大酯比例为己酸乙酯乳酸乙酯乙酸乙酯丁酸乙酯10630590096，其比例协调，感官评定完全达到了优质基酒的标准。0055实施例4复合己酸菌菌系ZC21在退化老窖池复壮中的应用00561复壮培养液配方及制备方式0057ZC21复合己酸菌液2530KG，优质窖泥常压杀菌半个小时1015KG，黄土30KG，20酒尾1520KG，洗糟水煮沸去渣1320KG，大曲粉6KG，生香酵母3235温水活化2个小时300G，乙酸钠130G，磷酸氢二钾50G，磷酸铵50G，酯化红曲475G。0058将上述原料拌和成糊状，酒度调整为2，PH6PH。

25、65，培养品温3235，第2D搅拌一次，密封培养7D左右，即可使用。00592退化窖池复壮方法说明书CN101942405ACN101942410A7/7页90060对老化窖池的窖泥进行认真化验分析。测定窖泥水分、PH值、N，P，K含量、腐植质、厌氧芽孢杆菌总数、己酸含量等指标。0061先将窖壁，窖底残糟清扫干净，铲除老化窖泥和窖壁受杂菌感染的窖泥。窖壁30角打孔，孔径为810MM，孔距68CM。孔打好后将培养好的糊状培养液，由上往下浇灌。浇灌后，将剩余的培养液与窖底泥拌和成柔泥，用柔泥将浇灌后的窖壁抹平。窖底撒大曲粉1525KG，翻窖底15CM左右。翻底后将窖底泥、大曲粉和窖泥培养液拌匀、蹂。

26、柔铺平窖底，全窖撒大曲粉58KG，即可按正常工艺入窖。00623窖池复壮效果检验0063表5复合己酸菌菌系ZC21对老化窖池的复壮效果00640065表5数据结果表明，复合己酸菌菌系ZC21能有效补充了窖内优势菌群，提高了窖泥的生香功能。采用窖泥培养液复壮窖池，激活和增加了有益微生物菌群，使己酸乙酯含量显著提高。四大酯比例较为协调，窖内发酵能力增强，生香功能明显提高。0066从上述实施例3、4可以看出，利用复合己酸菌菌系ZC21能有效增强窖泥中功能菌数量，提高产酒中己酸乙酯的含量，可提高出酒率和优质率，缩短窖池老熟周期，提高经济效益。该操作简单，效果明显，不改变原有的生产流程，且酒的质量和风味。

27、都稳定。0067本发明中所描述的具体实施例仅仅对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采取类似的方式替代，但是并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书保护的范围。0068尽管对本发明已作出了详细的说明，并引证了一些具体的实施例，但是对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或者修正是显然的。说明书CN101942405ACN101942410A1/3页10图1说明书附图CN101942405ACN101942410A2/3页11图2说明书附图CN101942405ACN101942410A3/3页12图3图4说明书附图CN101942405A。