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一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用.pdf

上传人：小** 文档编号：867780 上传时间：2018-03-16 格式：PDF 页数：16 大小：453.78KB
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摘要
申请专利号：

CN201010580476.9

 申请日：

2010.12.09
公开号：

CN102080130A

 公开日：

2011.06.01
当前法律状态：

授权

 有效性：

有权
法律详情：

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20101209|||公开
IPC分类号：

C12Q1/68

 主分类号：

C12Q1/68
申请人：

湖北光芒能源植物有限公司
发明人：

刁英; 胡小虎; 胡中立; 郑兴飞; 游永宁; 余作平
地址：

430074 湖北省武汉市武汉东湖开发区珞瑜路加州阳光3栋2单元0203号
优先权：

专利代理机构：

武汉宇晨专利事务所 42001

 代理人：

王敏锋
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内容摘要

本发明公开了一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用，步骤：1）提取芒属植物五节芒的基因组DNA；2）利用限制性内切酶酶切上述所提取的总DNA，获得基因组DNA片断；3）探针与目的片断的杂交；4）利用磁珠对上述中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集；5）对含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化；6）将DNA片断进行克隆测序；7）SSR的侧翼序列设计SSR引物，运用引物设计软件设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。方法易行，操作简便，同时，SSR标记自身具有共显性、多态性高、多等位基因的特性等特点，不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以应用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制中。

权利要求书

1： 一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其步骤是 ： 取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总 DNA ； 利用限制性内切酶酶切上述步骤 a） 所提取的总 DNA， 获得基因组 DNA 片断， 步骤如下 ： 取 125ng 基因组总 DNA5μL， 在 20μL 酶切体系中， 用限制性内切酶 Mse I 于 37℃酶切 3h， 然后 65℃温育 10min， 酶切结束后连接上接头， 连接反应为 25μL 体系， 反应在 16℃下连接 过夜， 连有接头的 DNA 经 PCR 预扩增获得拷贝， 预扩增引物为 MseI-N 5’ -GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’ ， PCR 反应体系 25μL ； PCR 反应程序为 ： 首先 95℃预变性 5min， 然后在 94 ℃变 性 30 s， 53℃退火 1 min， 72℃延伸 1 min ；循环次数 16-28 个， 最后 72℃终延伸 10min， 取 3μL 扩增产物产物使用 1% 质量体积比琼脂糖电泳检测， 判断产物分布范围及产物量， 余下 部分置 4℃保存备用 ； 探 针 与 目 的 片 断 的 杂 交， 步骤如下： 将预扩增产物与生物素标记的探针 biotin-(AG)13 在 分 子 杂 交 炉 内 65 ℃ 下 杂 交 2h， 杂 交 反 应 为 100μL 体 系 ： 20×SSC ： 0.7μL ； 0.1% 质 量 体 积 比 SDS ： 0.7μL ； 预扩增产物 ： 25μL ； Biotin-(AG)13 探 针 ： 6μL ； ddH2O ： 67.6μL， 获得的杂交液置 4℃保存备用 ； 利用磁珠对上述步骤 c） 中的含有 SSR 序列的杂交 DNA 分子进行富集， 具体如下 ： （1） 、 磁珠预处理 ： 取一管包被有链亲和素的磁珠， 拍打管底， 然后用枪吹打直至磁珠分离开， 用 磁力架收集， 磁珠悬停 30s， 吸走上清液 ； 用 0.5×SSC 洗涤磁珠 3 次， 每次 5min， 每次洗 涤完毕即用磁力架固定磁珠， 至磁珠光滑为止， 洗好的磁珠置于 100μL0.5×SSC 中备用 ； （2） 、 磁珠富集 ： 将备用杂交液加入到磁珠管中， 室温下放置 30min， 每 5min 用枪吹打 3 次， 每隔 1min 用手摇 ； 用磁力架收集去掉上清液 ； 用 0.1 X SSC 洗涤磁珠 3 次， 每次 5min， 然 后用 TEN1000 洗涤 3 次， 每次 5min， 再用 300ul TEN1000 于 65 ℃预热后， 洗涤 2min ； （3） 、 目的 DNA 片段的洗脱 ： 磁珠吸附完毕后， 用磁力架固定磁珠， 移去杂交混合液， 然后再加入 100μLTE95℃水浴 5min， 其间不时吹打均匀 ； 用磁力架固定磁珠后， 吸出上清液， 置于 EP 管 中标记， 再次用 150μL TE 进行第二次洗脱， 用磁力架固定磁珠后， 吸出上清液， 置于 EP 管 中标记， 最后将两次洗脱后的产物冻存于 -20℃冰箱备用 ； （4） 、 含有 SSR 序列的 DNA 片断 的 PCR 扩增 ： 对洗脱后的目的 DNA 进行 PCR 扩增， 扩增体系为 25μL， PCR 反应程序为 ： 首先 95℃预变性 2min， 然后在 94℃变性 30 s， 53℃退火 1 min， 72℃延伸 1 min ； 进行 30 个循环， 最后 72℃终延伸 10min， 取 3μL 扩增产物产物使用 0.8% 琼脂糖电泳检测， 判断产物分布范 围及产物量 ； 对上述步骤 d） 中所得含有 SSR 序列的 DNA 片断进行扩增并纯化， 具体如下 ： PCR 扩增 后的产物， 切取 200bp-750bp 的 DNA 片段范围内的琼脂糖凝胶装在 1.5mL 离心管中， 使用凝 胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产物， 回收后的 DNA 在 EB 染色的 0.8％质量体积比琼脂糖凝胶 上电泳， 检测回收 DNA 的质量， 置于 -20℃保存备用 ； 将上述步骤 e） 中所得的 DNA 片断进行克隆测序 ； 具体方法如下 ： （1） 、 目的 DNA 片断 的体外连接 ： 将回收纯化后的 PCR 产物， 使用连接试剂盒进行， 反应体系为 5μL， 16℃连接 过夜 ； （2） 、 连接产物的转化 ： 采用热激法将已连接目的片断的载体转化入 DH-5α 感受态细 胞； （3） 、 挑选阳性克隆并测序 ： 用菌落 PCR 技术筛选阳性克隆， 首先使用通用引物 SP6/T7 进行筛选， 排除非阳性克隆， 反应体系为 25μL， 对进行完第一次筛选后的菌液， 用 MseI-N 和不含生物素探针标记的 （AG） 反应体系为 25μL， 所得 13 为引物进行第二轮 PCR 扩增筛选， 2 PCR 产物在 0.8% 的琼脂糖凝胶上电泳， 用 DL2000 作为 marker， 挑选不同大小的阳性克隆送 样测序 ； 根据 SSR 的侧翼序列设计 SSR 引物， 在测序的基础上， 利用微卫星 DNA 两侧的序列的保 守性， 运用引物设计软件 Primer 5.0 设计特异性引物， 用于扩增该位点的微卫星片断， 引 物设计 ： 引物长度为 18-25bp， 退火温度为 50-68℃， GC 含量为 36%-67%， 预期 PCR 扩增产物 长度为 105-297bp， 所述的引物如下 ： Mf1 F:ATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT R:AGGTGATAGGTCTAGCCGATGC Mf2 F:GGTCGTCCGCTCTCCCTGT R:TCCACGAAGAACTCACTCCAATC Mf3 F:AAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT R:GGAGAAAGCGAGCGAAGA Mf4 F:GCAGGGAGTGAGACAGCT R:ACATCACATCCTCGTCCA Mf5 F:CCACACCAGCAGTACTCCAGC R:GAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT Mf6 F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT R:GAGCTGCACAACGGGGATTA Mf7 F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA Mf8 F:GACCATAGTCCAGAGTATTCGC R:CATCGACGTCACCAAGAAAT Mf9 F:TGGGGCGAAGCAGACATAG R:GTCTGTCCGTTGCCCTGC Mf10 F:CTGTCGTATGAGCTGCCATC R:AAACCGGTACGGGTGAATCT Mf11 F:CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG R:CATAAGTAAACGGCTGAACCAC 3 Mf12 F:TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT R:ACCTTTTTCAGTCAGCCACAC Mf13 F:GCGACGAGACAAGGCGCAAGT R:TAGGCCGGGAAGCGAAGACC Mf14 F:CAGTCCCAGACTGCATTGAA R:ATGTCAGCAGTGACCCACAA Mf15 F:CCAAGGGCTTAGGATTGACA R:GCCAAGGTACAAGCCGTAGA Mf16 CCCGCTATGAGCTACAGGAG CGAGTGCCTACCATCATCCT Mf17 F:TTCTTGTGCCTGGCTATGAG R:GACAGAGCAGTGAACCATTTACA Mf18 F:AGGAGGATAAGAATAATGAGGGTGA R:TGCTCACAACCACAGAACCG Mf19 F:ATTTGGCTCATGGGCTGGGT R:AGGTTAGCACTTAGGGTTTCATCAA Mf20 F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT R:GAGCTGCACAACGGGGATTA Mf21 F:CGACTGGAATTTGGGTAATATGA R:CCACATGAAGAGGAAGAAAAACTAT Mf22 F:TTCAACGTGATTAGTGTGAAAGC R:AGTGGTATGGACGAGATGGTG Mf23 F:GTGGCGACTCTCCGATACC R:GCAACCTATGTTCCAAACTTACT Mf24 F:ATGAAAGGATTAGCCAGAGGTTAG R:CTTTGCCTGTCTCTCACATCTTG 4 Mf25 F:ATCAGAGCAAGCAATCAAGAGA R:TTTATTGTATTTCTGAGCCTCTGTC Mf26 F:GCAAACGCACGAAGGTAGG R:CCTCCTTTTCTCACCATTGTCG Mf27 F:CTTAGAGCGAGAACAACAATTATCC R:GGCTTGATGAGAACTGAGAGAAAT Mf28 F:TGCCCGTATTGGATGAAACCTC R:TGCCACAGCGATGCCGAAT Mf29 F:AGGAAATGGGGCACAAAAACT R:GCAGGTGGTTTTCATAAGATTCC Mf30 F:ACTTCTACACTTCTCCCATGTCCTC R:CACGGTGAGATTCGGTAGCG Mf31 F:CCGGGGTGAGAAATCTGTG R:AAACCAGGGACGGCATAGAT Mf32 F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA Mf33 F:TAATGTCTTGTCAGCTTTGAGTTGG R:AAGAAGAGGTGGAAAGGCAAGTT Mf34 F:CGACTTTTATTGTAATCGTTATCTC R:GAGGAACAACTACTGCGGATAC。
2： 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 b 中扩增体系为 25μL ： 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTP ： 2μL ； 10× Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； Template DNA ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL。
3： 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其 特征在于 ： 所述的步骤 b 中酶切体系 ： DNA ： 5μL ； 10x Buffer R ： 5μL ； Mse I， 2.5U/μL ： 0.5μL ； ddH2O:9.5μL。
4： 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 d 中 PCR 反应体系 25μL ： 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 2.5mmol/L dNTPs ： 5 2μL ； 10× Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； 10 倍稀释连接液 ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL。 5. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特征 在于 ： 所述的步骤 c 中杂交反应为 100μL 体系 ： 20×SSC ： 0.7μL ； 0.1%SDS ： 0.7μL ； 预扩 增产物 ： 25μL ； Biotin-(AG)13 探针 ： 6μL ； ddH2O ： 67.6μL。 6. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 f 中反应体系为 25μL ： 10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5mmol/L SP6 ： 0.5μL ； 5mmol/L T7 ： 0.5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL ； 菌液 ： 2μL ； ddH2O ： 15.3μL。 7. 权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物五节芒 SSR 标记在分析芒属植物遗 传多样性中的应用。
5： 0 设计特异性引物， 用于扩增该位点的微卫星片断， 引 物设计 ： 引物长度为 18-25bp， 退火温度为 50-68℃， GC 含量为 36%-67%， 预期 PCR 扩增产物 长度为 105-297bp， 所述的引物如下 ： Mf1 F:ATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT R:AGGTGATAGGTCTAGCCGATGC Mf2 F:GGTCGTCCGCTCTCCCTGT R:TCCACGAAGAACTCACTCCAATC Mf3 F:AAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT R:GGAGAAAGCGAGCGAAGA Mf4 F:GCAGGGAGTGAGACAGCT R:ACATCACATCCTCGTCCA Mf5 F:CCACACCAGCAGTACTCCAGC R:GAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT Mf6 F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT R:GAGCTGCACAACGGGGATTA Mf7 F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA Mf8 F:GACCATAGTCCAGAGTATTCGC R:CATCGACGTCACCAAGAAAT Mf9 F:TGGGGCGAAGCAGACATAG R:GTCTGTCCGTTGCCCTGC Mf10 F:CTGTCGTATGAGCTGCCATC R:AAACCGGTACGGGTGAATCT Mf11 F:CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG R:CATAAGTAAACGGCTGAACCAC 3 Mf12 F:TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT R:ACCTTTTTCAGTCAGCCACAC Mf13 F:GCGACGAGACAAGGCGCAAGT R:TAGGCCGGGAAGCGAAGACC Mf14 F:CAGTCCCAGACTGCATTGAA R:ATGTCAGCAGTGACCCACAA Mf15 F:CCAAGGGCTTAGGATTGACA R:GCCAAGGTACAAGCCGTAGA Mf16 CCCGCTATGAGCTACAGGAG CGAGTGCCTACCATCATCCT Mf17 F:TTCTTGTGCCTGGCTATGAG R:GACAGAGCAGTGAACCATTTACA Mf18 F:AGGAGGATAAGAATAATGAGGGTGA R:TGCTCACAACCACAGAACCG Mf19 F:ATTTGGCTCATGGGCTGGGT R:AGGTTAGCACTTAGGGTTTCATCAA Mf20 F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT R:GAGCTGCACAACGGGGATTA Mf21 F:CGACTGGAATTTGGGTAATATGA R:CCACATGAAGAGGAAGAAAAACTAT Mf22 F:TTCAACGTGATTAGTGTGAAAGC R:AGTGGTATGGACGAGATGGTG Mf23 F:GTGGCGACTCTCCGATACC R:GCAACCTATGTTCCAAACTTACT Mf24 F:ATGAAAGGATTAGCCAGAGGTTAG R:CTTTGCCTGTCTCTCACATCTTG 4 Mf25 F:ATCAGAGCAAGCAATCAAGAGA R:TTTATTGTATTTCTGAGCCTCTGTC Mf26 F:GCAAACGCACGAAGGTAGG R:CCTCCTTTTCTCACCATTGTCG Mf27 F:CTTAGAGCGAGAACAACAATTATCC R:GGCTTGATGAGAACTGAGAGAAAT Mf28 F:TGCCCGTATTGGATGAAACCTC R:TGCCACAGCGATGCCGAAT Mf29 F:AGGAAATGGGGCACAAAAACT R:GCAGGTGGTTTTCATAAGATTCC Mf30 F:ACTTCTACACTTCTCCCATGTCCTC R:CACGGTGAGATTCGGTAGCG Mf31 F:CCGGGGTGAGAAATCTGTG R:AAACCAGGGACGGCATAGAT Mf32 F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA Mf33 F:TAATGTCTTGTCAGCTTTGAGTTGG R:AAGAAGAGGTGGAAAGGCAAGTT Mf34 F:CGACTTTTATTGTAATCGTTATCTC R:GAGGAACAACTACTGCGGATAC。 2. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 b 中扩增体系为 25μL ： 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTP ： 2μL ； 10× Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； Template DNA ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL。 3. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其 特征在于 ： 所述的步骤 b 中酶切体系 ： DNA ： 5μL ； 10x Buffer R ： 5μL ； Mse I， 2.5U/μL ： 0.5μL ； ddH2O:9.5μL。 4. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 d 中 PCR 反应体系 25μL ： 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 2.5mmol/L dNTPs ： 5 2μL ； 10× Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； 10 倍稀释连接液 ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL。 5. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特征 在于 ： 所述的步骤 c 中杂交反应为 100μL 体系 ： 20×SSC ： 0.7μL ； 0.1%SDS ： 0.7μL ； 预扩 增产物 ： 25μL ； Biotin-(AG)13 探针 ： 6μL ； ddH2O ： 67.6μL。
6： 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 f 中反应体系为 25μL ： 10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5mmol/L SP6 ： 0.5μL ； 5mmol/L T7 ： 0.5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL ； 菌液 ： 2μL ； ddH2O ： 15.3μL。 7. 权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物五节芒 SSR 标记在分析芒属植物遗 传多样性中的应用。
7： 6μL， 获得的杂交液置 4℃保存备用 ； 利用磁珠对上述步骤 c） 中的含有 SSR 序列的杂交 DNA 分子进行富集， 具体如下 ： （1） 、 磁珠预处理 ： 取一管包被有链亲和素的磁珠， 拍打管底， 然后用枪吹打直至磁珠分离开， 用 磁力架收集， 磁珠悬停 30s， 吸走上清液 ； 用 0.5×SSC 洗涤磁珠 3 次， 每次 5min， 每次洗 涤完毕即用磁力架固定磁珠， 至磁珠光滑为止， 洗好的磁珠置于 100μL0.5×SSC 中备用 ； （2） 、 磁珠富集 ： 将备用杂交液加入到磁珠管中， 室温下放置 30min， 每 5min 用枪吹打 3 次， 每隔 1min 用手摇 ； 用磁力架收集去掉上清液 ； 用 0.1 X SSC 洗涤磁珠 3 次， 每次 5min， 然 后用 TEN1000 洗涤 3 次， 每次 5min， 再用 300ul TEN1000 于 65 ℃预热后， 洗涤 2min ； （3） 、 目的 DNA 片段的洗脱 ： 磁珠吸附完毕后， 用磁力架固定磁珠， 移去杂交混合液， 然后再加入 100μLTE95℃水浴 5min， 其间不时吹打均匀 ； 用磁力架固定磁珠后， 吸出上清液， 置于 EP 管 中标记， 再次用 150μL TE 进行第二次洗脱， 用磁力架固定磁珠后， 吸出上清液， 置于 EP 管 中标记， 最后将两次洗脱后的产物冻存于 -20℃冰箱备用 ； （4） 、 含有 SSR 序列的 DNA 片断 的 PCR 扩增 ： 对洗脱后的目的 DNA 进行 PCR 扩增， 扩增体系为 25μL， PCR 反应程序为 ： 首先 95℃预变性 2min， 然后在 94℃变性 30 s， 53℃退火 1 min， 72℃延伸 1 min ； 进行 30 个循环， 最后 72℃终延伸 10min， 取 3μL 扩增产物产物使用 0.8% 琼脂糖电泳检测， 判断产物分布范 围及产物量 ； 对上述步骤 d） 中所得含有 SSR 序列的 DNA 片断进行扩增并纯化， 具体如下 ： PCR 扩增 后的产物， 切取 200bp-750bp 的 DNA 片段范围内的琼脂糖凝胶装在 1.5mL 离心管中， 使用凝 胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产物， 回收后的 DNA 在 EB 染色的 0.8％质量体积比琼脂糖凝胶 上电泳， 检测回收 DNA 的质量， 置于 -20℃保存备用 ； 将上述步骤 e） 中所得的 DNA 片断进行克隆测序 ； 具体方法如下 ： （1） 、 目的 DNA 片断 的体外连接 ： 将回收纯化后的 PCR 产物， 使用连接试剂盒进行， 反应体系为 5μL， 16℃连接 过夜 ； （2） 、 连接产物的转化 ： 采用热激法将已连接目的片断的载体转化入 DH-5α 感受态细 胞； （3） 、 挑选阳性克隆并测序 ： 用菌落 PCR 技术筛选阳性克隆， 首先使用通用引物 SP6/T7 进行筛选， 排除非阳性克隆， 反应体系为 25μL， 对进行完第一次筛选后的菌液， 用 MseI-N 和不含生物素探针标记的 （AG） 反应体系为 25μL， 所得 13 为引物进行第二轮 PCR 扩增筛选， 2 PCR 产物在 0.8% 的琼脂糖凝胶上电泳， 用 DL2000 作为 marker， 挑选不同大小的阳性克隆送 样测序 ； 根据 SSR 的侧翼序列设计 SSR 引物， 在测序的基础上， 利用微卫星 DNA 两侧的序列的保 守性， 运用引物设计软件 Primer 5.0 设计特异性引物， 用于扩增该位点的微卫星片断， 引 物设计 ： 引物长度为 18-25bp， 退火温度为 50-68℃， GC 含量为 36%-67%， 预期 PCR 扩增产物 长度为 105-297bp， 所述的引物如下 ： Mf1 F:ATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT R:AGGTGATAGGTCTAGCCGATGC Mf2 F:GGTCGTCCGCTCTCCCTGT R:TCCACGAAGAACTCACTCCAATC Mf3 F:AAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT R:GGAGAAAGCGAGCGAAGA Mf4 F:GCAGGGAGTGAGACAGCT R:ACATCACATCCTCGTCCA Mf5 F:CCACACCAGCAGTACTCCAGC R:GAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT Mf6 F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT R:GAGCTGCACAACGGGGATTA Mf7 F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA Mf8 F:GACCATAGTCCAGAGTATTCGC R:CATCGACGTCACCAAGAAAT Mf9 F:TGGGGCGAAGCAGACATAG R:GTCTGTCCGTTGCCCTGC Mf10 F:CTGTCGTATGAGCTGCCATC R:AAACCGGTACGGGTGAATCT Mf11 F:CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG R:CATAAGTAAACGGCTGAACCAC 3 Mf12 F:TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT R:ACCTTTTTCAGTCAGCCACAC Mf13 F:GCGACGAGACAAGGCGCAAGT R:TAGGCCGGGAAGCGAAGACC Mf14 F:CAGTCCCAGACTGCATTGAA R:ATGTCAGCAGTGACCCACAA Mf15 F:CCAAGGGCTTAGGATTGACA R:GCCAAGGTACAAGCCGTAGA Mf16 CCCGCTATGAGCTACAGGAG CGAGTGCCTACCATCATCCT Mf17 F:TTCTTGTGCCTGGCTATGAG R:GACAGAGCAGTGAACCATTTACA Mf18 F:AGGAGGATAAGAATAATGAGGGTGA R:TGCTCACAACCACAGAACCG Mf19 F:ATTTGGCTCATGGGCTGGGT R:AGGTTAGCACTTAGGGTTTCATCAA Mf20 F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT R:GAGCTGCACAACGGGGATTA Mf21 F:CGACTGGAATTTGGGTAATATGA R:CCACATGAAGAGGAAGAAAAACTAT Mf22 F:TTCAACGTGATTAGTGTGAAAGC R:AGTGGTATGGACGAGATGGTG Mf23 F:GTGGCGACTCTCCGATACC R:GCAACCTATGTTCCAAACTTACT Mf24 F:ATGAAAGGATTAGCCAGAGGTTAG R:CTTTGCCTGTCTCTCACATCTTG 4 Mf25 F:ATCAGAGCAAGCAATCAAGAGA R:TTTATTGTATTTCTGAGCCTCTGTC Mf26 F:GCAAACGCACGAAGGTAGG R:CCTCCTTTTCTCACCATTGTCG Mf27 F:CTTAGAGCGAGAACAACAATTATCC R:GGCTTGATGAGAACTGAGAGAAAT Mf28 F:TGCCCGTATTGGATGAAACCTC R:TGCCACAGCGATGCCGAAT Mf29 F:AGGAAATGGGGCACAAAAACT R:GCAGGTGGTTTTCATAAGATTCC Mf30 F:ACTTCTACACTTCTCCCATGTCCTC R:CACGGTGAGATTCGGTAGCG Mf31 F:CCGGGGTGAGAAATCTGTG R:AAACCAGGGACGGCATAGAT Mf32 F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA Mf33 F:TAATGTCTTGTCAGCTTTGAGTTGG R:AAGAAGAGGTGGAAAGGCAAGTT Mf34 F:CGACTTTTATTGTAATCGTTATCTC R:GAGGAACAACTACTGCGGATAC。 2. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 b 中扩增体系为 25μL ： 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTP ： 2μL ； 10× Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； Template DNA ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL。 3. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其 特征在于 ： 所述的步骤 b 中酶切体系 ： DNA ： 5μL ； 10x Buffer R ： 5μL ； Mse I， 2.5U/μL ： 0.5μL ； ddH2O:9.5μL。 4. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 d 中 PCR 反应体系 25μL ： 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 2.5mmol/L dNTPs ： 5 2μL ； 10× Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； 10 倍稀释连接液 ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL。 5. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特征 在于 ： 所述的步骤 c 中杂交反应为 100μL 体系 ： 20×SSC ： 0.7μL ； 0.1%SDS ： 0.7μL ； 预扩 增产物 ： 25μL ； Biotin-(AG)13 探针 ： 6μL ； ddH2O ： 67.6μL。 6. 根据权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其特 征在于 ： 所述的步骤 f 中反应体系为 25μL ： 10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5mmol/L SP6 ： 0.5μL ； 5mmol/L T7 ： 0.5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL ； 菌液 ： 2μL ； ddH2O ： 15.3μL。 7. 权利要求 1 所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物五节芒 SSR 标记在分析芒属植物遗 传多样性中的应用。

说明书


一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法及应用

    【技术领域】
     本发明属于芒属植物育种技术领域， 更具体涉及一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 同时还涉及一种磁珠富集法筛选的芒属植物 SSR 标记的用途。背景技术
     芒属 (Miscanthus) 植物俗称芒草， 属禾本科多年生高大草类。由于芒草不属于 粮食作物， 同时其主要生长在荒地上， 所以作为能源植物的芒草就受到世界范围的广泛关 注。各国纷纷出台相应的政策措施， 以期在能源植物的开发和研究上走在前列。美国总统 奥巴马在公布一项旨在复兴美国生物燃料生产的新型战略时， 就 “誓言决不让中国等国家 在构建新能源经济时跑在前列” 。中国是世界芒类植物资源的分布中心， 因此， 更应该重视 和加强芒类资源的研究利用工作。芒属植物不仅在生物能源领域拥有巨大的经济价值， 同 时在生态环保、 农业、 工业方面都具有很大的开发潜力和市场价值。五节芒 (Miscanthus floridulus) 是日常生活之中最常见的野外群生禾本科植物， 是目前芒属植物中研究较多 的一种。它在山坡土、 道路边、 溪流旁及开阔地成群滋长， 其地下茎发达， 能适应各种土壤。 但是对于五节芒的遗传学研究较少， 特别是 DNA 分子水平的研究极为有限。 微 卫 星 (Microsatelltie)DNA 又 称 简 单 重 复 序 列 (simple sequence repeat， SSR)， 是一种由 1-6 个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列， 微卫星具 有十分丰富的多态性， 且重复性好、 呈共显性遗传、 数量丰富和遍布整个基因组等优点。这 些优点使得 SSR 标记成为广泛使用的分子标记之一。分离微卫星的位点有许多种方法， 例 如部分文库法、 富集文库法、 微卫星序列 PCR 分离法、 EST-SSR 法等。由于磁珠富集法具有 高效富集微卫星 DNA 的作用， 且不需要较多的因而被广泛地运用于微卫星位点的筛选。
     为了研究芒属植物的遗传多样性， 申请人利用磁珠法富集分离了芒属植物五节芒 的 SSR 序列， 并从中开发了 SSR 引物序列， 并明确了这些 SSR 序列的特征及其在芒属植物遗 传多样性研究中的应用。
     发明内容 本发明的目的是在于提供了一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 方法易行， 所需设备简单， 操作简便， 在不需要了解测试样品较多的遗传背景信息的情况 下， 能够高效富集和分离微卫星 DNA， 从而分析获得其特异的 SSR 序列引物序列。
     本发明的另一个目的是在于提供了一种磁珠富集法从芒属植物五节芒筛选的 SSR 标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用， 在芒属植物分子遗传学研究中所需的一种新的 DNA 分子标记， 所得到的 SSR 引物为芒属植物特异的引物， 具有较高的针对性， 同时由于 SSR 标记自身具有的优点如数量丰富， 具有多等位基因的特性， 呈共显性等， 不仅能够用于芒属 植物遗传多样性和亲缘关系分析， 还可以运用到芒属植物遗传图谱的构建、 目标基因的标 定、 指纹图的绘制等研究中。
     为了达到上述的目的， 本发明采用以下技术措施 ：
     一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其步骤是 ：
     1、 取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总 DNA ； 具体方法参照 1998 年顾红雅等 ( 顾红 雅， 瞿礼嘉 . 植物分子生物学实验手册 [M]. 北京 ： 高等教育出版社， 1998， 3 ～ 12.) 报道的 方法提取。
     2、 利用限制性内切酶酶切上述步骤 1) 所提取的总 DNA， 获得基因组 DNA 片断， 具 体步骤如下 ： 取约 125ng 基因组总 DNA(5μL)， 在 20μL 酶切体系 (DNA ： 5μL ； 10x Buffer R： 5μL ； Mse I (2.5U/μL) ： 0.5μL ； ddH2O ： 9.5μL) 中， 用限制性内切酶 Mse I 于 37℃酶 切 3h， 然后 65℃温育 10min。酶切结束后连接上接头 (Oligo-MseI A 5’ -TAC TCA GGA CTC AT-3’ ； Oligo-MseI B5’ -6AC ATG AGT CCT GAG-3’ )， 连接反应为 25μL 体系 (DNA 酶切产物 ： 12.5μL ； 10X 连接缓冲液 (ligase buffer) ： 3μL ； T4DNA 连接酶 (DNA Ligase)(5U/μL) ： 0.4μL ； MseI 接头 ： 2μL ； ddH2O ： 7.1μL)， 反应在 16℃下连接过夜。连有接头的 DNA 经 PCR 预扩增获得多个拷贝， 预扩增引物为 MseI-N(5’ -GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’ )， PCR 反 应体系 25μL(25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 2.5mmol/L dNTPs ： 2μL ； 10×Taq 缓冲液 (Buffer) ： 2.5μL ； 5mmol/L 引物 (MseI-N) ： 1μL ； 10 倍稀释连接液 ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； 无菌 水 (ddH2O) ： 11.5μL) ； PCR 反应程序为 ： 首先 95℃预变性 5min， 然后在 94℃变性 30s， 53℃ 退火 1min， 72℃延伸 1min ； 循环次数 16-28 个为宜， 最后 72℃终延伸 10min。取 3μL 扩增 产物产物使用 1％ ( 质量体积比 ) 琼脂糖电泳检测， 判断产物分布范围及产物量， 余下部分 置 4℃保存备用。
     3、 探针与目的片断的杂交， 具体步骤如下 ： 将预扩增产物与生物素标记的探针 biotin-(AG)13 在分子杂交炉内 65℃下杂交 2h， 杂交反应为 100μL 体系 (20×SSC ： 0.7μL ； 0.1 ％ ( 质量体积比 )SDS ： 0.7μL ； 预扩增产物 ： 25μL ； Biotin-(AG)13 探针 ： 6μL ； ddH2O ： 67.6μL)， 获得的杂交液置 4℃保存备用。
     4、 利用磁珠对上述步骤 3) 中的含有 SSR 序列的杂交 DNA 分子进行富集， 具体如 下： (1) 磁珠预处理 ： 取 1-2mg 包被有链亲和素的磁珠， 用 0.5×SSC 洗涤磁珠 3 次， 每次 5min(300μL/ 次 )， 每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠， 至磁珠光滑为止， 洗好的磁珠置于 100μL0.5×SSC 中备用。(2) 磁珠富集 ： 将备用杂交液加入到磁珠管中， 室温 (20-25 ℃， 以下相同 ) 下放置 30min， 每 5min 用枪吹打 3 次， 每隔 1min 用手轻摇， 动作要轻， 避免磁珠 沉淀。(3) 磁珠的洗脱 ： 磁珠吸附完毕后， 用磁力架固定磁珠， 移去杂交混合液。然后再加 入 100μLTE(PH ＝ 8.0)95℃水浴 5min。其间不时吹打均匀， 避免磁珠沉淀 ； 用磁力架固定 磁珠后， 迅速吸出上清液， 置于 EP 管中标记为 “1” ； 再次用 150μL TE 进行第二次洗脱， 用 磁力架固定磁珠后， 迅速吸出上清液， 置于 EP 管中标记为 “2” 。一股不要合并两次洗脱液， 最后将两次洗脱后的产物冻存于 -20℃冰箱备用。(4) 含有 SSR 序列的 DNA 片断的 PCR 扩 增： 对洗脱后的目的 DNA 进行 PCR 扩增， 扩增体系为 25μL(25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/ LdNTP ： 2μL ； 10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； TemplateDNA ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL)。PCR 反应程序为 ： 首先 95℃预变性 2min， 然后在 94℃变性 30s， 53℃退火 1min， 72℃延伸 1min ； 进行 30 个循环， 最后 72℃终延伸 10min。取 3μL 扩增 产物产物使用 0.8％ ( 质量体积比， 以下相同 ) 琼脂糖电泳检测， 判断产物分布范围及产物 量。
     5、 对上述步骤 4) 中所得含有 SSR 序列的 DNA 片断进行扩增并纯化， 具体如下 ： PCR扩增后的产物， 切取 200bp-750bp 的 DNA 片段范围内的琼脂糖凝胶装在 1.5mL 小离心管中， 使用 TIANGEN 公司的凝胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产物， 回收后的 DNA 在 EB 染色的 0.8％ ( 质量体积比 ) 琼脂糖凝胶上电泳， 检测回收 DNA 的质量， 置于 -20℃保存备用。
     6、 将上述步骤 5) 中所得的 DNA 片断进行克隆测序 ； 具体方法如下 ： (1) 目的 DNA 片 断的体外连接 ： 将回收纯化后的 PCR 产物， 使用 PROMEGA 公司的连接试剂盒进行， 反应体系 为 5μL( 纯化产物 ： 2μL ； ligase buffer ： 2μL ； T4DNA Ligase ： 0.5μL ； pGEM-T ： 0.5μL)， 16℃连接过夜。(2) 连接产物的转化 ： 采用热激法 ( 黄培堂等译， 分子克隆实验指南 ( 第三 版 )( 中译版 )， 2002) 将已连接目的片断的载体转化入 DH-5α 感受态细胞。(3) 挑选阳性 克隆并测序 ： 用菌落 PCR 技术筛选阳性克隆， 首先使用通用引物 SP6/T7 进行筛选， 以初步 排除非阳性克隆。反应体系为 25μL(10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 25mmol/L MgCl 2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5mmol/L SP6 ： 0.5μL ； 5mmol/LT7 ： 0.5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL ； 菌液 ( 进行了质粒转化并培养过夜的 DH-5α 菌液 ) ： 2μL ； ddH2O ： 15.3μL)。对进行完第 一次筛选后的菌液， 用 MseI-N 和不含生物素探针标记的 (AG)13 为引物进行第二轮 PCR 扩增 筛选， 反应体系为 25μL(10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/LdNTPs ： 2μL ； 5mmol/L MseI-N ： 0.5μL ； 5mmol/L(AG)13 ： 1.6μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL ；菌 液 ： 2μL ； ddH2O ： 14.2μL)。所得 PCR 产物在 0.8 ％ ( 质量体积比 ) 的琼脂糖凝胶上电泳， 用 DL2000 作为 marker， 判断产物有无及其大小， 挑选不同大小的阳性克隆送样测序。
     7、 根 据 SSR 的 侧 翼 序 列 设 计 SSR 引 物， 主 要 是 在 测 序 的 基 础 上， 利用微卫 星 DNA 两侧的序列的保守性， 运用引物设计软件 Primer Primer 5.0(Primer Biosoft International 公司生产 ) 设计特异性引物， 用于扩增该位点的微卫星片断， 引物设计采用 以下严谨度 ： 引物长度为 18-25bp， 退火温度为 50-68℃， GC 含量为 36％ -67％， 预期 PCR 扩 增产物长度为 105-297bp。 总共设计获得了 34 对 SSR 引物序列， 所述的引物 ( 请见下表 1) ；
     表1： 上游、 下游引物序列
     一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用， 其 应用过程是 ：
     1) 用所设计的 SSR 引物扩增 5 种芒属植物材料 ；
     从芒属的 5 个种 ( 请见表 2) 共计 66 份材料的幼嫩叶片中提取总 DNA， 并进行 PCR 扩增 ； PCR 反应的总体积为 25μL(DNA ： 25ng ； 5mmol/L 上下游引物 ： 各 1μL ； 10×Taq Buffer ： 2μL ； 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL)。 PCR 扩增反应程序为 ： 首先 94℃预变性 3min， 然后在 94℃变性 30s， 54℃退火 45sec， 72℃延伸 1min ； 进行 34 个循环， 最后 72℃终延伸 10min。PCR 产物通过 6％ ( 质量体积比 ) 常规聚丙 烯酰胺 - 尿素凝胶电泳按分子量大小分离， 电泳条件为 1800V80W 1.5-2.0h。 电泳后的凝胶 有带或无带分别记录为 1 或 0。 采用常规的银染染色，
     表 2 芒属植物材料名称
     编号 1-47名称 五节芒 (M.floridulus)来源 武汉大学11102080130 A CN 102080133说48-54 55-61 62-64 65-66明书武汉大学 武汉大学 武汉大学 武汉大学6/10 页芒 (M.sinensis) 荻 (M.sacchariflora) 南荻 (M.lutarioriparia) 奇岗 (Miscanthus xgiganteus)
     2) 计算每对引物的多态性信息含量， 利用 popgene32 软件 (Yeh FC and others， 2000 对步骤 1) 所示的材料进行遗传多样性的分析， 主要包括 ： 等位基因 NA， 表观杂合度 Ho， 期望杂合度 HE。
     3) 具体结果为 ： 本发明中步骤 7) 的引物长度为引物长度为 18-25bp， 退火温度为 50-68℃， GC 含量为 36％ -67％， 预期 PCR 扩增产物长度为 105-297bp。通过筛选和优化， 本 发明步骤 7) 的最适引物长度为 18-25bp， 退火温度为 50-68℃， GC 含量为 36％ -67％， 预期 PCR 扩增产物长度为 105-297bp。 在对 4 个芒属植物材料进行遗传多样性分析时， 12 对引物 具有多态性， 其中五节芒共扩增 93 对等位基因， 表观杂合度 Ho 在 0-0.851 之间， 期望杂合 度 HE 在 0.351-0.855 之间 ； 芒共扩增 67 对等位基因， 表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合 度 HE 在 0.375-0.844 之间 ； 荻共扩增 44 对等位基因， 表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合 度 HE 在 0-0.84 之间 ； 南荻共扩增 30 对等位基因， 表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合度 HE 在 0-0.72 之间 ； 奇岗共扩增 21 对等位基因， 表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合度 HE 在 0-0.5 之间。
     4)12 对引物具有多态性的引物如下 ：
     Mf1
     F： ATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT
     R： AGGTGATAGGTCTAGCCGATGC
     Mf2
     F： GGTCGTCCGCTCTCCCTGT
     R： TCCACGAAGAACTCACTCCAATC
     Mf3
     F： AAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT
     R： GGAGAAAGCGAGCGAAGA
     Mf4
     F： GCAGGGAGTGAGACAGCT
     R： ACATCACATCCTCGTCCA
     Mf5
     F： CCACACCAGCAGTACTCCAGC
     R： GAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT
     Mf6
     F： GCGATGTTGACTTTTGCTGCT
     R： GAGCTGCACAACGGGGATTA
     Mf7
     F： AATCTGTATGTCCCAAACTCACC
     R： GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA
     Mf8
     F： GACCATAGTCCAGAGTATTCGC
     R： CATCGACGTCACCAAGAAAT
     Mf9
     F： TGGGGCGAAGCAGACATAG
     R： GTCTGTCCGTTGCCCTGC
     Mf10
     F： CTGTCGTATGAGCTGCCATC
     R： AAACCGGTACGGGTGAATCT
     Mf11
     F： CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG
     R： CATAAGTAAACGGCTGAACCAC
     Mf12
     F： TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT
     R： ACCTTTTTCAGTCAGCCACAC
     本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果 ：
     开发 SSR 引物有两大类方法， 一是从基因组文库开发 SSR 引物 ； 二是从 EST 中开发 SSR 引物。从 EST 中开发 SSR 引物需要大量已知的 EST 序列， 因此， 对于分子遗传学研究开 展得较少的物种不适合， 而基于文库开发 SSR 引物适用性更广泛。在所有常见的利用文库 开发 SSR 的方法中， 磁珠富集法具有高效富集微卫星 DNA 的特点， 被广泛应用于微卫星位点 的筛选， 其富集文库中含 SSR 的克隆率在 50％ -95％之间， 获得有用序列的概率也比较高。 本研究中建立的以磁珠富集法为基础筛选芒属植物五节芒 SSR 序列并开发其相应的 SSR 引 物的方法， 便捷高效， 通用性较好， 虽然 SSR 引物是基于五节芒的 SSR 序列所开发的， 但这 些引物在芒、 荻、 南荻等芒属植物中也表现出较好的通用性， 因此， 这种方法特别适合遗传 学研究相对滞后的资源植物。方法易行， 操作简便， 同时， SSR 标记自身具有共显性、 多态性 高、 多等位基因的特性等特点， 不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析， 还可以 应用到芒属植物遗传图谱的构建、 目标基因的标定、 指纹图的绘制中。
     与其它分子标记相比， SSR 具有许多优点。它具有等位基因变异多、 单基因座、 信 息含量高、 多态性高 ； 稳定性好、 重复性好 ； 种族特异性强、 进化所受选择压小 ； 以孟德尔方 式分离、 呈共显性遗传 ； 可利用 PCR 进行分析、 操作简便 ； 而且在种属间有良好的通用性等 优点。因此， SSR 标记已被作为重要的遗传标记， 广泛应用于遗传连锁图谱构建、 群体遗传 学研究、 开展交配系统分析、 进行分子标记辅助选择育种、 系谱分析、 基因定位、 种质遗传多 样性研究和物种起源与进化分析、 比较基因组学、 品种指纹图谱绘制、 品种纯度检测、 目标 性状分子标记筛选等领域中 (SSR 的优点参见张增翠， 侯喜林 ： SSR 分子标记开发策略及评 价。遗传， 2004， 26(5) ： 763-768)。芒属植物作为新型能源植物， 具有巨大的应用前景， 但至今为止， 国际上还没有开发出芒属植物的专有分子标记， 本发明的工作在国际上是第一次 公布芒属的专有 DNA 分子标记， 将为芒属植物的遗传育种研究提供强有力的技术支持。 具体实施方式
     实施例 1 ：
     以下结合说明书对本发明作进一步的进行描述 ：
     一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记的制备方法， 其制备步骤是 ：
     1、 供试材料 ： 如表 1 所示的 5 种芒属植物共计 66 株， 其中五节芒 47 株， 芒 7 株， 荻 7 株， 南荻 3 株， 奇岗 2 株。
     2、 总 DNA 提取方法 ： 从上述材料中取幼嫩叶片提取其总 DNA， 具体方法参照 1998 年顾红雅等 ( 顾红雅， 瞿礼嘉 . 植物分子生物学实验手册 [M]. 北京 ： 高等教育出版社， 19983 ～ 12.) 报道的方法提取。
     3、 探针与目的片断的杂交， 具体方法如下 ：
     (1) 五节芒基因组 DNA 片段的获得 ： 取约 125ng 基因组总 DNA(5μL)， 在 20μL 酶 切 体 系 (DNA ： 5μL ； 10x Buffer R ： 5μL ； Mse I(2.5U/μL) ： 0.5μL ； ddH2O ： 9.5μL) 中， 用限制性内切酶 Mse I 于 37 ℃酶切 3h， 然后 65 ℃温育 10min。酶切结束后连接上 接头 (Oligo-MseI A 5’ -TAC TCA GGA CTC AT-3’ ； Oligo-MseIB 5’ -GAC ATG AGT CCT GAG-3’ )， 连 接 反 应 为 25μL 体 系 (DNA 酶 切 产 物 ： 12.5μL ； 10X ligase buffer ： 3μL ； T4DNA Ligase(5U/μL) ： 0.4μL ； MseI 接头 ： 2μL ； ddH2O ： 7.1μL)， 反应在 16 ℃下连接过 夜。连有接头的 DNA 经 PCR 预扩增获得多个拷贝， 预扩增引物为 MseI-N(5’ -GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’ )， PCR 反 应 体 系 25μL(25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 2.5mmol/L dNTPs ： 2μL ； 10×TaqBuffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； 10 倍稀释连接液 ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL) ； PCR 反应程序为 ： 首先 95℃预变性 5min， 然后在 94℃变性 30s， 53℃ 退火 1min， 72℃延伸 1min ； 循环次数 16-28 个为宜， 最后 72℃终延伸 10min。取 3μL 扩增 产物产物使用 1％ ( 质量体积比 ) 琼脂糖电泳检测， 判断产物分布范围及产物量， 余下部分 置 4℃保存备用。
     (2) 基因组片断与探针杂交 ： 将预扩增产物与生物素标记的探针 biotin-(AG)13 在分子杂交炉内 65 ℃下杂交 2h， 杂交反应为 100μL 体系 (20×SSC ： 0.7μL ； 0.1 ％ SDS ： 0.7μL ； 预扩增产物 ： 25μL ； Biotin-(AG)13 探针 ： 6μL ； ddH2O ： 67.6μL)， 获得的杂交液置 4℃保存备用。
     4、 磁珠富集含有 SSR 序列的 DNA 片断， 方法如下 ：
     (1) 磁珠预处理 ： 取 1-2mg 包被有链亲和素的磁珠， 用 0.5×SSC 洗涤磁珠 3 次， 每 次 5min(300μL/ 次 )， 每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠， 至磁珠光滑为止， 洗好的磁珠置 于 100μL0.5×SSC 中备用。
     (2) 磁珠富集 ： 将备用杂交液加入到磁珠管中， 室温下放置 30min， 每 5min 用枪吹 打 3 次， 每隔 1min 用手轻摇， 动作要轻， 避免磁珠沉淀。
     (3) 磁珠的洗脱 ： 磁珠吸附完毕后， 用磁力架固定磁珠， 移去杂交混合液。然后再 加入 100μLTE(PH ＝ 8.0)95℃水浴 5min。其间不时吹打均匀， 避免磁珠沉淀 ； 用磁力架固 定磁珠后， 迅速吸出上清液， 置于 EP 管中标记为 “1” ； 再次用 150μLTE 进行第二次洗脱， 用磁力架固定磁珠后， 迅速吸出上清液， 置于 EP 管中标记为 “2” 。一股不要合并两次洗脱液， 最后将两次洗脱后的产物冻存于 -20℃冰箱备用。
     (4) 含有 SSR 序列的 DNA 片断的 PCR 扩增 ： 对洗脱后的目的 DNA 进行 PCR 扩增， 扩 增体系为 25μL(25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTP ： 2μL ； 10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 5mmol/L MseI-N ： 1μL ； Template DNA ： 5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 1μL ； ddH2O ： 11.5μL)。PCR 反应程序为 ： 首先 95℃预变性 2min， 然后在 94℃变性 30s， 53℃退火 1min， 72℃延伸 1min ； 进行 30 个循环， 最后 72℃终延伸 10min。取 3μL 扩增产物产物使用 0.8％ ( 质量体积比 ) 琼脂糖电泳检测， 判断产物分布范围及产物量。
     (5) 扩增产物的纯化 ： PCR 扩增后的产物， 切取 200bp-750bp 的 DNA 片段范围内的 琼脂糖凝胶装在 1.5mL 小离心管中， 使用 TIANGEN 公司的凝胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产 物， 回收后的 DNA 在 EB 染色的 0.8％ ( 质量体积比 ) 琼脂糖凝胶上电泳， 检测回收 DNA 的质 量， 置于 -20℃保存备用。
     5、 含有 SSR 序列的 DNA 片断的克隆测序， 具体方法如下 ：
     (1) 目的 DNA 片断的体外连接 ： 将回收纯化后的 PCR 产物， 使用 PROMEGA 公司的 连接试剂盒进行， 反应体系为 5μL( 纯化产物 ： 2μL ； ligase buffer ： 2μL ； T4DNALigase ： 0.5μL ； pGEM-T ： 0.5μL)， 16℃连接过夜。
     (2) 连接产物的转化 ： 采用热激法将已连接目的片断的载体转化入 DH-5α 感受态细胞。 (3) 挑选阳性克隆并测序 ： 用菌落 PCR 技术筛选阳性克隆， 首先使用通用引物 SP6/T7 进行筛选， 以初步排除非阳性克隆。反应体系为 25μL(10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 25mmol/L MgCl 2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5mmol/L SP6 ： 0.5 μ L ； 5mmol/L T7 ： 0.5μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL ； 菌液 ： 2μL ； ddH2O ： 15.3μL)。对进行完第一次筛选后的 菌液， 用 MseI-N 和不含生物素探针标记的 (AG)13 为引物进行第二轮 PCR 扩增筛选， 反应 体 系 为 25μL(10×Taq Buffer ： 2.5μL ； 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5mmol/L MseI-N ： 0.5μL ； 5mmol/L(AG)13 ： 1.6μL ； 5U/μL Taq 酶 ： 0.2μL ； 菌液： 2μL ； ddH2O ： 14.2μL)。所得 PCR 产物在 0.8％ ( 质量体积比 ) 的琼脂糖凝胶上电泳， 用 DL2000 作为 marker， 判断产物有无及其大小， 挑选不同大小的阳性克隆送样测序。
     6、 设计引物扩增基因组 DNA ： 主要是在测序的基础上， 利用微卫星 DNA 两侧的序 列的保守性， 运用引物设计软件 Primer 5.0 设计特异性引物， 用于扩增该位点的微卫星 片断， 引物设计采用以下严谨度 ： 引物长度为 18-25bp， 退火温度为 50-68 ℃， GC 含量为 36％ -67％， 预期 PCR 扩增产物长度为 105-297bp。获得了 34 对引物， 其中 12 对引物 PCR 扩增条带具有多态性。
     一种磁珠富集法筛选芒属植物 SSR 标记在分析芒属植物遗传多样性中的用途， 其 应用过程是 ：
     1、 SSR 引物标记分析 ：
     PCR 反 应 的 总 体 积 为 25μL(DNA ： 25ng ； 5mmol/L 上 下 游 引 物 ： 各 1μL ； 10×Taq Buffer ： 2μL ； 25mmol/L MgCl2 ： 2μL ； 10mmol/L dNTPs ： 2μL ； 5U/μLTaq 酶 ： 0.2μL)。PCR 扩增反应程序为 ： 首先 94℃预变性 3min， 然后在 94℃变性 30s， 54℃退火 45sec， 72℃延伸 1min ； 进行 34 个循环， 最后 72℃终延伸 10min。PCR 产物通过 6％ ( 质量体积比 ) 常规聚丙
     烯酰胺 - 尿素凝胶电泳按分子量大小分离， 电泳条件为 1800V80W 1.5-2.0h。 电泳后的凝胶 采用常规的银染染色， 有带或无带分别记录为 1 或 0。
     2、 数据整理及分析 ：
     计算每对引物的多态性信息含量， 利用 popgene32 软件对步骤 1) 所示的材料进行 遗传多样性的分析， 主要包括 ： 等位基因 NA， 表观杂合度 Ho， 期望杂合度 HE。
     3、 SSR 引物扩增情况 ：
     在对 5 个种的芒属植物材料进行遗传多样性分析时， 12 对 (Mf1-Mf12) 引物具有多 态性， 其中五节芒共扩增 93 对等位基因 ； 芒共扩增 67 对等位基因 ； 荻共扩增 44 对等位基 因； 南荻共扩增 30 对等位基因 ； 奇岗共扩增 21 对等位基因。
     4、 多态性信息分析 ：
     其中五节芒表观杂合度 Ho 在 0-0.851 之间， 期望杂合度 HE 在 0.351-0.855 之间 ； 芒表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合度 HE 在 0.375-0.844 之间 ； 荻表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合度 HE 在 0-0.84 之间 ； 南荻表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合度 HE 在 0-0.72 之间 ； 奇岗表观杂合度 Ho 在 0-1 之间， 期望杂合度 HE 在 0-0.5 之间。16

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1、10申请公布号CN102080130A43申请公布日20110601CN102080130ACN102080130A21申请号201010580476922申请日20101209C12Q1/6820060171申请人湖北光芒能源植物有限公司地址430074湖北省武汉市武汉东湖开发区珞瑜路加州阳光3栋2单元0203号72发明人刁英胡小虎胡中立郑兴飞游永宁余作平74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用57摘要本发明公开了一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用，步骤1）提取芒属植物五节芒的基因组DNA；2）。

2、利用限制性内切酶酶切上述所提取的总DNA，获得基因组DNA片断；3）探针与目的片断的杂交；4）利用磁珠对上述中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集；5）对含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化；6）将DNA片断进行克隆测序；7）SSR的侧翼序列设计SSR引物，运用引物设计软件设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。方法易行，操作简便，同时，SSR标记自身具有共显性、多态性高、多等位基因的特性等特点，不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以应用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制中。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书5。

3、页说明书10页CN102080133A1/5页21一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其步骤是取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总DNA；利用限制性内切酶酶切上述步骤A）所提取的总DNA，获得基因组DNA片断，步骤如下取125NG基因组总DNA5L，在20L酶切体系中，用限制性内切酶MSEI于37酶切3H，然后65温育10MIN，酶切结束后连接上接头，连接反应为25L体系，反应在16下连接过夜，连有接头的DNA经PCR预扩增获得拷贝，预扩增引物为MSEIN5GATGAGTCCTGAGTAAN3，PCR反应体系25L；PCR反应程序为首先95预变性5MIN，然后在94变性30S，53退火1。

4、MIN，72延伸1MIN；循环次数1628个，最后72终延伸10MIN，取3L扩增产物产物使用1质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4保存备用；探针与目的片断的杂交，步骤如下将预扩增产物与生物素标记的探针BIOTINAG13在分子杂交炉内65下杂交2H，杂交反应为100L体系20SSC07L；01质量体积比SDS07L；预扩增产物25L；BIOTINAG13探针6L；DDH2O676L，获得的杂交液置4保存备用；利用磁珠对上述步骤C）中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集，具体如下（1）、磁珠预处理取一管包被有链亲和素的磁珠，拍打管底，然后用枪吹打直至磁珠分离开，。

5、用磁力架收集，磁珠悬停30S，吸走上清液；用05SSC洗涤磁珠3次，每次5MIN，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100L05SSC中备用；（2）、磁珠富集将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置30MIN，每5MIN用枪吹打3次，每隔1MIN用手摇；用磁力架收集去掉上清液；用01XSSC洗涤磁珠3次，每次5MIN，然后用TEN1000洗涤3次，每次5MIN，再用300ULTEN1000于65预热后，洗涤2MIN；（3）、目的DNA片段的洗脱磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，然后再加入100LTE95水浴5MIN，其间不时吹打均匀；用磁力架固定磁珠后。

6、，吸出上清液，置于EP管中标记，再次用150LTE进行第二次洗脱，用磁力架固定磁珠后，吸出上清液，置于EP管中标记，最后将两次洗脱后的产物冻存于20冰箱备用；（4）、含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25L，PCR反应程序为首先95预变性2MIN，然后在94变性30S，53退火1MIN，72延伸1MIN；进行30个循环，最后72终延伸10MIN，取3L扩增产物产物使用08琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量；对上述步骤D）中所得含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化，具体如下PCR扩增后的产物，切取200BP750BP的DNA片段范围内的。

7、琼脂糖凝胶装在15ML离心管中，使用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的08质量体积比琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA的质量，置于20保存备用；将上述步骤E）中所得的DNA片断进行克隆测序；具体方法如下（1）、目的DNA片断的体外连接将回收纯化后的PCR产物，使用连接试剂盒进行，反应体系为5L，16连接过夜；（2）、连接产物的转化采用热激法将已连接目的片断的载体转化入DH5感受态细胞；（3）、挑选阳性克隆并测序用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，排除非阳性克隆，反应体系为25L，对进行完第一次筛选后的菌液，用MSEIN和不含生物素探针标记。

8、的（AG）13为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25L，所得权利要求书CN102080130ACN102080133A2/5页3PCR产物在08的琼脂糖凝胶上电泳，用DL2000作为MARKER，挑选不同大小的阳性克隆送样测序；根据SSR的侧翼序列设计SSR引物，在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件PRIMER50设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计引物长度为1825BP，退火温度为5068，GC含量为3667，预期PCR扩增产物长度为105297BP，所述的引物如下MF1FATATGCGTATGGTGTGTATGATGATRAGGTGA。

9、TAGGTCTAGCCGATGCMF2FGGTCGTCCGCTCTCCCTGTRTCCACGAAGAACTCACTCCAATCMF3FAAGTTTGTTGATGTGGCGTGATRGGAGAAAGCGAGCGAAGAMF4FGCAGGGAGTGAGACAGCTRACATCACATCCTCGTCCAMF5FCCACACCAGCAGTACTCCAGCRGAAAACCTAATAAAAGGGCACGATMF6FGCGATGTTGACTTTTGCTGCTRGAGCTGCACAACGGGGATTAMF7FAATCTGTATGTCCCAAACTCACCRGTGTTTTGTTCTGGGTGGCTAMF8FGA。

10、CCATAGTCCAGAGTATTCGCRCATCGACGTCACCAAGAAATMF9FTGGGGCGAAGCAGACATAGRGTCTGTCCGTTGCCCTGCMF10FCTGTCGTATGAGCTGCCATCRAAACCGGTACGGGTGAATCTMF11FCTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGGRCATAAGTAAACGGCTGAACCAC权利要求书CN102080130ACN102080133A3/5页4MF12FTCAAGGAAACAGGTGATAGGTCTRACCTTTTTCAGTCAGCCACACMF13FGCGACGAGACAAGGCGCAAGTRTAGGCCGGGA。

11、AGCGAAGACCMF14FCAGTCCCAGACTGCATTGAARATGTCAGCAGTGACCCACAAMF15FCCAAGGGCTTAGGATTGACARGCCAAGGTACAAGCCGTAGAMF16CCCGCTATGAGCTACAGGAGCGAGTGCCTACCATCATCCTMF17FTTCTTGTGCCTGGCTATGAGRGACAGAGCAGTGAACCATTTACAMF18FAGGAGGATAAGAATAATGAGGGTGARTGCTCACAACCACAGAACCGMF19FATTTGGCTCATGGGCTGGGTRAGGTTAGCACTTAGGGTTTCATCAAMF2。

12、0FGCGATGTTGACTTTTGCTGCTRGAGCTGCACAACGGGGATTAMF21FCGACTGGAATTTGGGTAATATGARCCACATGAAGAGGAAGAAAAACTATMF22FTTCAACGTGATTAGTGTGAAAGCRAGTGGTATGGACGAGATGGTGMF23FGTGGCGACTCTCCGATACCRGCAACCTATGTTCCAAACTTACTMF24FATGAAAGGATTAGCCAGAGGTTAGRCTTTGCCTGTCTCTCACATCTTG权利要求书CN102080130ACN102080133A4/5页5MF25FATCAGAGCAAGC。

13、AATCAAGAGARTTTATTGTATTTCTGAGCCTCTGTCMF26FGCAAACGCACGAAGGTAGGRCCTCCTTTTCTCACCATTGTCGMF27FCTTAGAGCGAGAACAACAATTATCCRGGCTTGATGAGAACTGAGAGAAATMF28FTGCCCGTATTGGATGAAACCTCRTGCCACAGCGATGCCGAATMF29FAGGAAATGGGGCACAAAAACTRGCAGGTGGTTTTCATAAGATTCCMF30FACTTCTACACTTCTCCCATGTCCTCRCACGGTGAGATTCGGTAGCGMF31FCCGGGGTGA。

14、GAAATCTGTGRAAACCAGGGACGGCATAGATMF32FAATCTGTATGTCCCAAACTCACCRGTGTTTTGTTCTGGGTGGCTAMF33FTAATGTCTTGTCAGCTTTGAGTTGGRAAGAAGAGGTGGAAAGGCAAGTTMF34FCGACTTTTATTGTAATCGTTATCTCRGAGGAACAACTACTGCGGATAC。2根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于所述的步骤B中扩增体系为25L25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTP2L；10TAQBUFFER25L；5MMOL/LMSE。

15、IN1L；TEMPLATEDNA5L；5U/LTAQ酶1L；DDH2O115L。3根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于所述的步骤B中酶切体系DNA5L；10XBUFFERR5L；MSEI，25U/L05L；DDH2O95L。4根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于所述的步骤D中PCR反应体系25L25MMOL/LMGCL22L；25MMOL/LDNTPS权利要求书CN102080130ACN102080133A5/5页62L；10TAQBUFFER25L；5MMOL/LMSEIN1L；10倍稀释连接液5L；5U/。

16、LTAQ酶1L；DDH2O115L。5根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于所述的步骤C中杂交反应为100L体系20SSC07L；01SDS07L；预扩增产物25L；BIOTINAG13探针6L；DDH2O676L。6根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于所述的步骤F中反应体系为25L10TAQBUFFER25L；25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTPS2L；5MMOL/LSP605L；5MMOL/LT705L；5U/LTAQ酶02L；菌液2L；DDH2O153L。7权利要求1所述的一种磁珠富集法。

17、筛选芒属植物五节芒SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用。权利要求书CN102080130ACN102080133A1/10页7一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用技术领域0001本发明属于芒属植物育种技术领域，更具体涉及一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，同时还涉及一种磁珠富集法筛选的芒属植物SSR标记的用途。背景技术0002芒属MISCANTHUS植物俗称芒草，属禾本科多年生高大草类。由于芒草不属于粮食作物，同时其主要生长在荒地上，所以作为能源植物的芒草就受到世界范围的广泛关注。各国纷纷出台相应的政策措施，以期在能源植物的开发和研究上走在前列。美国总统奥巴马。

18、在公布一项旨在复兴美国生物燃料生产的新型战略时，就“誓言决不让中国等国家在构建新能源经济时跑在前列”。中国是世界芒类植物资源的分布中心，因此，更应该重视和加强芒类资源的研究利用工作。芒属植物不仅在生物能源领域拥有巨大的经济价值，同时在生态环保、农业、工业方面都具有很大的开发潜力和市场价值。五节芒MISCANTHUSFLORIDULUS是日常生活之中最常见的野外群生禾本科植物，是目前芒属植物中研究较多的一种。它在山坡土、道路边、溪流旁及开阔地成群滋长，其地下茎发达，能适应各种土壤。但是对于五节芒的遗传学研究较少，特别是DNA分子水平的研究极为有限。0003微卫星MICROSATELLTIEDNA。

19、又称简单重复序列SIMPLESEQUENCEREPEAT，SSR，是一种由16个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列，微卫星具有十分丰富的多态性，且重复性好、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点。这些优点使得SSR标记成为广泛使用的分子标记之一。分离微卫星的位点有许多种方法，例如部分文库法、富集文库法、微卫星序列PCR分离法、ESTSSR法等。由于磁珠富集法具有高效富集微卫星DNA的作用，且不需要较多的因而被广泛地运用于微卫星位点的筛选。0004为了研究芒属植物的遗传多样性，申请人利用磁珠法富集分离了芒属植物五节芒的SSR序列，并从中开发了SSR引物序列，并明确了这些SSR。

20、序列的特征及其在芒属植物遗传多样性研究中的应用。发明内容0005本发明的目的是在于提供了一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，方法易行，所需设备简单，操作简便，在不需要了解测试样品较多的遗传背景信息的情况下，能够高效富集和分离微卫星DNA，从而分析获得其特异的SSR序列引物序列。0006本发明的另一个目的是在于提供了一种磁珠富集法从芒属植物五节芒筛选的SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用，在芒属植物分子遗传学研究中所需的一种新的DNA分子标记，所得到的SSR引物为芒属植物特异的引物，具有较高的针对性，同时由于SSR标记自身具有的优点如数量丰富，具有多等位基因的特性，呈共显性等，。

21、不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以运用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制等研究中。0007为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施说明书CN102080130ACN102080133A2/10页80008一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其步骤是00091、取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总DNA；具体方法参照1998年顾红雅等顾红雅，瞿礼嘉植物分子生物学实验手册M北京高等教育出版社，1998，312报道的方法提取。00102、利用限制性内切酶酶切上述步骤1所提取的总DNA，获得基因组DNA片断，具体步骤如下取约125NG基因组总DNA5L，在。

22、20L酶切体系DNA5L；10XBUFFERR5L；MSEI25U/L05L；DDH2O95L中，用限制性内切酶MSEI于37酶切3H，然后65温育10MIN。酶切结束后连接上接头OLIGOMSEIA5TACTCAGGACTCAT3；OLIGOMSEIB56ACATGAGTCCTGAG3，连接反应为25L体系DNA酶切产物125L；10X连接缓冲液LIGASEBUFFER3L；T4DNA连接酶DNALIGASE5U/L04L；MSEI接头2L；DDH2O71L，反应在16下连接过夜。连有接头的DNA经PCR预扩增获得多个拷贝，预扩增引物为MSEIN5GATGAGTCCTGAGTAAN3，PCR。

23、反应体系25L25MMOL/LMGCL22L；25MMOL/LDNTPS2L；10TAQ缓冲液BUFFER25L；5MMOL/L引物MSEIN1L；10倍稀释连接液5L；5U/LTAQ酶1L；无菌水DDH2O115L；PCR反应程序为首先95预变性5MIN，然后在94变性30S，53退火1MIN，72延伸1MIN；循环次数1628个为宜，最后72终延伸10MIN。取3L扩增产物产物使用1质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4保存备用。00113、探针与目的片断的杂交，具体步骤如下将预扩增产物与生物素标记的探针BIOTINAG13在分子杂交炉内65下杂交2H，杂交反应为。

24、100L体系20SSC07L；01质量体积比SDS07L；预扩增产物25L；BIOTINAG13探针6L；DDH2O676L，获得的杂交液置4保存备用。00124、利用磁珠对上述步骤3中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集，具体如下1磁珠预处理取12MG包被有链亲和素的磁珠，用05SSC洗涤磁珠3次，每次5MIN300L/次，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100L05SSC中备用。2磁珠富集将备用杂交液加入到磁珠管中，室温2025，以下相同下放置30MIN，每5MIN用枪吹打3次，每隔1MIN用手轻摇，动作要轻，避免磁珠沉淀。3磁珠的洗脱磁珠吸附完毕后，用磁。

25、力架固定磁珠，移去杂交混合液。然后再加入100LTEPH8095水浴5MIN。其间不时吹打均匀，避免磁珠沉淀；用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“1”；再次用150LTE进行第二次洗脱，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“2”。一股不要合并两次洗脱液，最后将两次洗脱后的产物冻存于20冰箱备用。4含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25L25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTP2L；10TAQBUFFER25L；5MMOL/LMSEIN1L；TEMPLATEDNA5L；5U/LTAQ酶1L；D。

26、DH2O115L。PCR反应程序为首先95预变性2MIN，然后在94变性30S，53退火1MIN，72延伸1MIN；进行30个循环，最后72终延伸10MIN。取3L扩增产物产物使用08质量体积比，以下相同琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。00135、对上述步骤4中所得含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化，具体如下PCR说明书CN102080130ACN102080133A3/10页9扩增后的产物，切取200BP750BP的DNA片段范围内的琼脂糖凝胶装在15ML小离心管中，使用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的08质量体积比琼脂糖凝胶上。

27、电泳，检测回收DNA的质量，置于20保存备用。00146、将上述步骤5中所得的DNA片断进行克隆测序；具体方法如下1目的DNA片断的体外连接将回收纯化后的PCR产物，使用PROMEGA公司的连接试剂盒进行，反应体系为5L纯化产物2L；LIGASEBUFFER2L；T4DNALIGASE05L；PGEMT05L，16连接过夜。2连接产物的转化采用热激法黄培堂等译，分子克隆实验指南第三版中译版，2002将已连接目的片断的载体转化入DH5感受态细胞。3挑选阳性克隆并测序用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，以初步排除非阳性克隆。反应体系为25L10TAQBUFFER25。

28、L；25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTPS2L；5MMOL/LSP605L；5MMOL/LT705L；5U/LTAQ酶02L；菌液进行了质粒转化并培养过夜的DH5菌液2L；DDH2O153L。对进行完第一次筛选后的菌液，用MSEIN和不含生物素探针标记的AG13为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25L10TAQBUFFER25L；25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTPS2L；5MMOL/LMSEIN05L；5MMOL/LAG1316L；5U/LTAQ酶02L；菌液2L；DDH2O142L。所得PCR产物在08质量体积比的琼脂糖凝胶上电泳，用DL20。

29、00作为MARKER，判断产物有无及其大小，挑选不同大小的阳性克隆送样测序。00157、根据SSR的侧翼序列设计SSR引物，主要是在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件PRIMERPRIMER50PRIMERBIOSOFTINTERNATIONAL公司生产设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计采用以下严谨度引物长度为1825BP，退火温度为5068，GC含量为3667，预期PCR扩增产物长度为105297BP。总共设计获得了34对SSR引物序列，所述的引物请见下表1；0016表1上游、下游引物序列0017说明书CN102080130ACN102080。

30、133A4/10页100018说明书CN102080130ACN102080133A5/10页1100190020一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用，其应用过程是00211用所设计的SSR引物扩增5种芒属植物材料；0022从芒属的5个种请见表2共计66份材料的幼嫩叶片中提取总DNA，并进行PCR扩增；PCR反应的总体积为25LDNA25NG；5MMOL/L上下游引物各1L；10TAQBUFFER2L；25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTPS2L；5U/LTAQ酶02L。PCR扩增反应程序为首先94预变性3MIN，然后在94变性30S，54退火。

31、45SEC，72延伸1MIN；进行34个循环，最后72终延伸10MIN。PCR产物通过6质量体积比常规聚丙烯酰胺尿素凝胶电泳按分子量大小分离，电泳条件为1800V80W1520H。电泳后的凝胶采用常规的银染染色，有带或无带分别记录为1或0。0023表2芒属植物材料名称0024编号名称来源147五节芒MFLORIDULUS武汉大学说明书CN102080130ACN102080133A6/10页124854芒MSINENSIS武汉大学5561荻MSACCHARIFLORA武汉大学6264南荻MLUTARIORIPARIA武汉大学6566奇岗MISCANTHUSXGIGANTEUS武汉大学00250。

32、0262计算每对引物的多态性信息含量，利用POPGENE32软件YEHFCANDOTHERS，2000对步骤1所示的材料进行遗传多样性的分析，主要包括等位基因NA，表观杂合度HO，期望杂合度HE。00273具体结果为本发明中步骤7的引物长度为引物长度为1825BP，退火温度为5068，GC含量为3667，预期PCR扩增产物长度为105297BP。通过筛选和优化，本发明步骤7的最适引物长度为1825BP，退火温度为5068，GC含量为3667，预期PCR扩增产物长度为105297BP。在对4个芒属植物材料进行遗传多样性分析时，12对引物具有多态性，其中五节芒共扩增93对等位基因，表观杂合度HO在。

33、00851之间，期望杂合度HE在03510855之间；芒共扩增67对等位基因，表观杂合度HO在01之间，期望杂合度HE在03750844之间；荻共扩增44对等位基因，表观杂合度HO在01之间，期望杂合度HE在0084之间；南荻共扩增30对等位基因，表观杂合度HO在01之间，期望杂合度HE在0072之间；奇岗共扩增21对等位基因，表观杂合度HO在01之间，期望杂合度HE在005之间。0028412对引物具有多态性的引物如下0029MF10030FATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT0031RAGGTGATAGGTCTAGCCGATGC0032MF20033FGGTCGTCCGCTC。

34、TCCCTGT0034RTCCACGAAGAACTCACTCCAATC0035MF30036FAAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT0037RGGAGAAAGCGAGCGAAGA0038MF40039FGCAGGGAGTGAGACAGCT0040RACATCACATCCTCGTCCA0041MF50042FCCACACCAGCAGTACTCCAGC0043RGAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT0044MF60045FGCGATGTTGACTTTTGCTGCT说明书CN102080130ACN102080133A7/10页130046RGAGCTGCACAACGGGGATTA0。

35、047MF70048FAATCTGTATGTCCCAAACTCACC0049RGTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA0050MF80051FGACCATAGTCCAGAGTATTCGC0052RCATCGACGTCACCAAGAAAT0053MF90054FTGGGGCGAAGCAGACATAG0055RGTCTGTCCGTTGCCCTGC0056MF100057FCTGTCGTATGAGCTGCCATC0058RAAACCGGTACGGGTGAATCT0059MF110060FCTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG0061RCATAAGTAAACGGCTGAACCAC0062MF1。

36、20063FTCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT0064RACCTTTTTCAGTCAGCCACAC0065本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果0066开发SSR引物有两大类方法，一是从基因组文库开发SSR引物；二是从EST中开发SSR引物。从EST中开发SSR引物需要大量已知的EST序列，因此，对于分子遗传学研究开展得较少的物种不适合，而基于文库开发SSR引物适用性更广泛。在所有常见的利用文库开发SSR的方法中，磁珠富集法具有高效富集微卫星DNA的特点，被广泛应用于微卫星位点的筛选，其富集文库中含SSR的克隆率在5095之间，获得有用序列的概率也比较高。本研究中建立的以磁珠富集。

37、法为基础筛选芒属植物五节芒SSR序列并开发其相应的SSR引物的方法，便捷高效，通用性较好，虽然SSR引物是基于五节芒的SSR序列所开发的，但这些引物在芒、荻、南荻等芒属植物中也表现出较好的通用性，因此，这种方法特别适合遗传学研究相对滞后的资源植物。方法易行，操作简便，同时，SSR标记自身具有共显性、多态性高、多等位基因的特性等特点，不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以应用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制中。0067与其它分子标记相比，SSR具有许多优点。它具有等位基因变异多、单基因座、信息含量高、多态性高；稳定性好、重复性好；种族特异性强、进化所受选择压小。

38、；以孟德尔方式分离、呈共显性遗传；可利用PCR进行分析、操作简便；而且在种属间有良好的通用性等优点。因此，SSR标记已被作为重要的遗传标记，广泛应用于遗传连锁图谱构建、群体遗传学研究、开展交配系统分析、进行分子标记辅助选择育种、系谱分析、基因定位、种质遗传多样性研究和物种起源与进化分析、比较基因组学、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、目标性状分子标记筛选等领域中SSR的优点参见张增翠，侯喜林SSR分子标记开发策略及评价。遗传，2004，265763768。芒属植物作为新型能源植物，具有巨大的应用前景，但至说明书CN102080130ACN102080133A8/10页14今为止，国际上还没有开发。

39、出芒属植物的专有分子标记，本发明的工作在国际上是第一次公布芒属的专有DNA分子标记，将为芒属植物的遗传育种研究提供强有力的技术支持。具体实施方式0068实施例10069以下结合说明书对本发明作进一步的进行描述0070一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其制备步骤是00711、供试材料如表1所示的5种芒属植物共计66株，其中五节芒47株，芒7株，荻7株，南荻3株，奇岗2株。00722、总DNA提取方法从上述材料中取幼嫩叶片提取其总DNA，具体方法参照1998年顾红雅等顾红雅，瞿礼嘉植物分子生物学实验手册M北京高等教育出版社，1998312报道的方法提取。00733、探针与目的片断的杂。

40、交，具体方法如下00741五节芒基因组DNA片段的获得取约125NG基因组总DNA5L，在20L酶切体系DNA5L；10XBUFFERR5L；MSEI25U/L05L；DDH2O95L中，用限制性内切酶MSEI于37酶切3H，然后65温育10MIN。酶切结束后连接上接头OLIGOMSEIA5TACTCAGGACTCAT3；OLIGOMSEIB5GACATGAGTCCTGAG3，连接反应为25L体系DNA酶切产物125L；10XLIGASEBUFFER3L；T4DNALIGASE5U/L04L；MSEI接头2L；DDH2O71L，反应在16下连接过夜。连有接头的DNA经PCR预扩增获得多个拷贝，。

41、预扩增引物为MSEIN5GATGAGTCCTGAGTAAN3，PCR反应体系25L25MMOL/LMGCL22L；25MMOL/LDNTPS2L；10TAQBUFFER25L；5MMOL/LMSEIN1L；10倍稀释连接液5L；5U/LTAQ酶1L；DDH2O115L；PCR反应程序为首先95预变性5MIN，然后在94变性30S，53退火1MIN，72延伸1MIN；循环次数1628个为宜，最后72终延伸10MIN。取3L扩增产物产物使用1质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4保存备用。00752基因组片断与探针杂交将预扩增产物与生物素标记的探针BIOTINAG13在分。

42、子杂交炉内65下杂交2H，杂交反应为100L体系20SSC07L；01SDS07L；预扩增产物25L；BIOTINAG13探针6L；DDH2O676L，获得的杂交液置4保存备用。00764、磁珠富集含有SSR序列的DNA片断，方法如下00771磁珠预处理取12MG包被有链亲和素的磁珠，用05SSC洗涤磁珠3次，每次5MIN300L/次，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100L05SSC中备用。00782磁珠富集将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置30MIN，每5MIN用枪吹打3次，每隔1MIN用手轻摇，动作要轻，避免磁珠沉淀。00793磁珠的洗脱磁珠吸附完毕后，。

43、用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液。然后再加入100LTEPH8095水浴5MIN。其间不时吹打均匀，避免磁珠沉淀；用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“1”；再次用150LTE进行第二次洗脱，用说明书CN102080130ACN102080133A9/10页15磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“2”。一股不要合并两次洗脱液，最后将两次洗脱后的产物冻存于20冰箱备用。00804含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25L25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTP2L；10TAQBUFFER25L；5。

44、MMOL/LMSEIN1L；TEMPLATEDNA5L；5U/LTAQ酶1L；DDH2O115L。PCR反应程序为首先95预变性2MIN，然后在94变性30S，53退火1MIN，72延伸1MIN；进行30个循环，最后72终延伸10MIN。取3L扩增产物产物使用08质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。00815扩增产物的纯化PCR扩增后的产物，切取200BP750BP的DNA片段范围内的琼脂糖凝胶装在15ML小离心管中，使用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的08质量体积比琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA的质量，置于20保存备用。008。

45、25、含有SSR序列的DNA片断的克隆测序，具体方法如下00831目的DNA片断的体外连接将回收纯化后的PCR产物，使用PROMEGA公司的连接试剂盒进行，反应体系为5L纯化产物2L；LIGASEBUFFER2L；T4DNALIGASE05L；PGEMT05L，16连接过夜。00842连接产物的转化采用热激法将已连接目的片断的载体转化入DH5感受态细胞。00853挑选阳性克隆并测序用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，以初步排除非阳性克隆。反应体系为25L10TAQBUFFER25L；25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTPS2L；5MMOL/LS。

46、P605L；5MMOL/LT705L；5U/LTAQ酶02L；菌液2L；DDH2O153L。对进行完第一次筛选后的菌液，用MSEIN和不含生物素探针标记的AG13为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25L10TAQBUFFER25L；25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTPS2L；5MMOL/LMSEIN05L；5MMOL/LAG1316L；5U/LTAQ酶02L；菌液2L；DDH2O142L。所得PCR产物在08质量体积比的琼脂糖凝胶上电泳，用DL2000作为MARKER，判断产物有无及其大小，挑选不同大小的阳性克隆送样测序。00866、设计引物扩增基因组DNA主要是在。

47、测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件PRIMER50设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计采用以下严谨度引物长度为1825BP，退火温度为5068，GC含量为3667，预期PCR扩增产物长度为105297BP。获得了34对引物，其中12对引物PCR扩增条带具有多态性。0087一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的用途，其应用过程是00881、SSR引物标记分析0089PCR反应的总体积为25LDNA25NG；5MMOL/L上下游引物各1L；10TAQBUFFER2L；25MMOL/LMGCL22L；10MMOL/LDNTPS。

48、2L；5U/LTAQ酶02L。PCR扩增反应程序为首先94预变性3MIN，然后在94变性30S，54退火45SEC，72延伸1MIN；进行34个循环，最后72终延伸10MIN。PCR产物通过6质量体积比常规聚丙说明书CN102080130ACN102080133A10/10页16烯酰胺尿素凝胶电泳按分子量大小分离，电泳条件为1800V80W1520H。电泳后的凝胶采用常规的银染染色，有带或无带分别记录为1或0。00902、数据整理及分析0091计算每对引物的多态性信息含量，利用POPGENE32软件对步骤1所示的材料进行遗传多样性的分析，主要包括等位基因NA，表观杂合度HO，期望杂合度HE。00923、SSR引物扩增情况0093在对5个种的芒属植物材料进行遗传多样性分析时，12对MF1MF12引物具有多态性，其中五节芒共扩增93对等位基因；芒共扩增67对等位基因；荻共扩增44对等位基因；南荻共扩增30对等位基因；奇岗共扩增21对等位基因。00944、多态性信息分析0095其中五节芒表观杂合度HO在00851之间，期望杂合度HE在03510855之间；芒表观杂合度HO在01之间，期望杂合度HE在03750844之间；荻表观杂合度HO在01之间，期望杂合度HE在0084之间；南荻表观杂合度HO在01之间，期望杂合度HE在0。

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