一种人肿瘤干细胞系及其用途.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200910177379.2

申请日:

2009.09.29

公开号:

CN101659940A

公开日:

2010.03.03

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

专利权的转移IPC(主分类):C12N 5/095登记生效日:20160918变更事项:专利权人变更前权利人:中日友好医院变更后权利人:苏州博聚华生物医药科技有限公司变更事项:地址变更前权利人:100037 北京市朝阳区樱花东街2号变更后权利人:215103 江苏省苏州市吴中区横泾街道天鹅荡路2011号10幢|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/08申请日:20090929|||公开

IPC分类号:

C12N5/08; C12Q1/02; C12R1/91(2006.01)N

主分类号:

C12N5/08

申请人:

中日友好医院

发明人:

刘虹麟; 张文健; 叶丽亚; 娄晋宁

地址:

100037北京市朝阳区樱花东街2号

优先权:

专利代理机构:

北京正理专利代理有限公司

代理人:

王德桢

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内容摘要

本发明提供一种人肿瘤干细胞系T3A-A3,该人肿瘤干细胞系从原发肝癌患者手术切除的肝癌组织中分离获得,该细胞能够在体外长期传代培养,已传代超过100次,细胞仍然生长迅速,并保持干细胞性质。该细胞既表达多种干细胞的标志、具有干细胞的自我更新能力、具有向不同肿瘤细胞定向分化的潜能;同时也具有肿瘤性质,成瘤能力和转移能力。由于其在体外长期培养而保持性质不变,并且在免疫缺陷鼠体内成瘤能力和转移能力强,是研制靶向肿瘤干细胞药物的有力工具。

权利要求书

1: 一种人肿瘤干细胞系,其特征在于:于2009年9月21日在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCC No.3291。
2: 权利要求1所述的人肿瘤干细胞系T3A-A3在制备或筛选靶向肿瘤干细胞药物 中的应用。

说明书


一种人肿瘤干细胞系及其用途

    【技术领域】

    本发明属于肿瘤生物学领域,具体涉及一种人肿瘤干细胞系及其用途。

    背景技术

    恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一。目前全球癌症状况日益严重,其发病率和死亡率均逐年上升。因此,开发更为有效的肿瘤治疗方案和治疗药物是非常重要的。

    近年来,越来越多的研究表明,在同一肿瘤组织中,肿瘤细胞在成瘤能力、分化程度和转移能力上具有异质性,其中只有数量很少的一部分细胞具有起始肿瘤的能力,这类细胞被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)或致瘤癌细胞(Tumogeniccancer cells)。肿瘤干细胞是既具有干细胞性质又具有肿瘤性质的细胞群体,它们与干细胞一样,均有无限增殖能力、自我更新能力、多向分化潜能、迁移能力,以及相似的生长调控机制。它们表达干细胞的标志,如CD133,CD90,CD44等;表达调节干细胞自我更新、多向分化和增殖路径的相关因子,如Wnt/β-catenin,Notch,Hedgehog/SMO,Bmi以及Oct3/4。同时,肿瘤干细胞也具有肿瘤性质,这是肿瘤干细胞不同于正常干细胞的根本所在。

    肿瘤干细胞学说的提出及近年在这一领域所取得的研究进展,从一个全新的角度认识了肿瘤。人们发现肿瘤干细胞虽然数量极少,却能在免疫缺陷小鼠体内成瘤,并维持肿瘤生长,CSCs可能是肿瘤转移的“种子细胞”,在肿瘤转移和复发中起重要作用。因此,肿瘤干细胞可能在肿瘤的发生、发展、和转移中起关键的作用。

    肿瘤干细胞与肿瘤的发生发展密切相关。当将原代分离的肿瘤细胞移植到免疫缺陷鼠体内,仅有表达干细胞标志的少数细胞能够成瘤,从而启动肿瘤的发生,维持肿瘤的生长,而大部分肿瘤细胞经历分化过程后会丢失这种潜能。因此,大多数学者认为,肿瘤的发生可能源于肿瘤干细胞。到目前为止,除白血病外,已在乳腺癌、恶性胶质瘤,前列腺癌等多种实体肿瘤中证实了CSCs的存在。肿瘤干细胞也参与肿瘤的进展,虽然肿瘤干细胞也可以象正常干细胞一样处于休眠状态,但是受到生长因子等因素刺激后,休眠的CSCs被激活,将导致细胞的快速增殖和疾病的快速进展。

    目前恶性肿瘤难以治愈的主要原因是转移和复发。近来有学者提出:CSCs可能是肿瘤转移的根本原因,并提出CSCs是肿瘤转移的“种子”细胞的观点。CSCs具有强大的增殖潜能,它们一旦到达远隔部位就能迅速发生克隆增殖,而非CSCs即使迁移到远隔部位,也很少有细胞会形成集落或克隆。对乳腺癌骨转移的研究发现,在转移灶中表达乳腺癌干细胞表型CD44+CD24-/Low的细胞占到72%,而原发灶中,同一细胞表型的细胞数只有<10%,推测肿瘤中只有CSCs才能形成转移灶。除了具有转移能力,CSCs还是肿瘤复发的根源,由于CSCs可以处于相对静止的休眠状态,而且通常表达药泵,因此使其不容易被放化疗治疗所杀灭。同时CSCs处于的低氧龛环境和周围的细胞外基质对其起到保护作用,其自身高效的DNA修复机制,对DNA损伤反应的选择性激活,也会导致肿瘤干细胞对放化疗产生耐受。

    CSCs大部分处于休眠状态,具有较低的分裂和增殖能力,而目前的放化疗主要是针对高增殖分裂期的细胞,因此不能有效靶向CSCs,最终导致肿瘤复发、转移和治疗失败。因此,将来的治疗策略应该是靶向清除CSCs,从而获得对肿瘤的有效治疗。开发靶向CSCs的药物首先需要有一个性质稳定的肿瘤干细胞系,以此肿瘤干细胞系为工具才容易开发出特异靶向CSCs的药物,但目前这种细胞系尚未见报道。

    【发明内容】

    本发明所要解决的一个技术问题是提供一种能够在体外长期传代培养的人肿瘤干细胞系。

    本发明提供一种人肿瘤干细胞系,该人肿瘤干细胞系T3A-A3已于2009年9月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC),其保藏编号为CGMCC No.3291。保藏地址为北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮政编码100101。

    本发明所述的人肿瘤干细胞系T3A-A3是发明人从肝癌患者的肿瘤组织中分离人肝癌微血管内皮细胞过程中得到的,该细胞经过在免疫缺陷小鼠二次成瘤分离和体外单细胞克隆纯化筛选出的增殖能够最强的细胞克隆,在体外经过超过100次的传代培养,细胞仍然生长迅速,并保持干细胞性质。该细胞系既表达多种干细胞的标志、具有干细胞的自我更新、具有向不同肿瘤细胞定向分化地潜能;同时也具有肿瘤性质,成瘤能力和转移能力。

    通过RT-PCR方法证实,本发明所述的人肿瘤干细胞系表达多种干细胞的标志:CD34、ABCG2、Nestin、C-kit和SCF,也表达与干细胞增殖和自我更新有关的基因Notch-1、Bmi-1、β-catenin、SMO和Oct-4,同时T3A-A3细胞系也表达iPS细胞相关转录因子:Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Oct-4和KLF4。这些iPS细胞相关转录因子对维持干细胞性质非常重要,据报道向已分化成熟的人类成纤维细胞中转染其中4个基因Oct-4,Sox2,C-myc及KLF4或Oct-4,Sox2,Nanog,和Lin28,将导致终末分化的人成纤维细胞转变成多潜能干细胞。

    本发明所述的人肿瘤干细胞系染色体呈多倍体核型,而且接种免疫缺陷鼠后具有很强的成瘤能力和转移能力。最低1000个细胞即能在NOD/SCID鼠皮下成瘤,而且接种于肝脏后能发生肺、结肠、胃等部位的远处转移。

    本发明所述的人肿瘤干细胞系具有多向分化潜能。当该细胞处于不同肿瘤环境下(肿瘤组织或肿瘤细胞的条件培养基),具有向相应类型肿瘤分化的能力。当培养时加入黑色素瘤或淋巴瘤的培养上清或组织匀浆时,可以使T3A-A3向相应肿瘤细胞分化。

    本发明所述的人肿瘤干细胞系的另一个特点是在临床肿瘤组织中具有普遍存在的可能。将本发明所述的人肿瘤干细胞系作为免疫原制备单克隆抗体,然后通过在正常细胞、肿瘤细胞和T3A-A3细胞上进行细胞免疫荧光染色进行筛选,挑选出T3A-A3特异的抗体。然后用这株抗T3A-A3特异的抗体在不同的人肿瘤组织上(肝癌、巨细胞胶质瘤、乳腺癌、胶质肉瘤、食管癌和胃印戒细胞癌)及正常组织上(肝脏、脑、食道、胃)进行免疫组织化学染色。结果发现:在所检测的6种人肿瘤组织中都存在不同程度的染色阳性细胞,而正常组织中未见到染色阳性细胞。这一结果提示,不同肿瘤组织中可能存在具有与T3A-A3共同特征的肿瘤干细胞。

    本发明所要解决的另一个技术问题是提供人肿瘤干细胞系在制备或筛选靶向肿瘤干细胞药物中的应用。将本发明所述的人肿瘤干细胞系用于开发靶向CSCs的药物。例如,制备并筛选出T3A-A3特异的抗体,通过体外实验挑选出具有抑制和杀伤T3A-A3细胞的抗体,可以将此抗体作为抗肿瘤干细胞药物的主要成分;或挑选出特异识别T3A-A3的抗体作为靶向工具,制备抗肿瘤干细胞的靶向药物。

    本发明所述的人肿瘤干细胞系主要的优势在于:

    1.本发明所述的人肿瘤干细胞系T3A-A3既表达多种干细胞的标志、具有干细胞的自我更新、具有向不同肿瘤细胞定向分化的潜能;同时也具有肿瘤性质,成瘤能力和转移能力。

    2.本发明所述的人肿瘤干细胞系可以体外长期传代培养而保持肿瘤干细胞性质不变,适合作为研发肿瘤干细胞相关药物的细胞材料。

    3.本发明所述的人肿瘤干细胞系在多种临床肿瘤组织中具有普遍存在的可能,因此用其开发的抗肿瘤干细胞药物具有潜在的巨大应用价值。

    下面结合附图和具体实施方式进一步说明本发明,但是应当指出,附图和实施例仅作为说明本发明的例子,不限制本发明的范围。

    【附图说明】

    图1.人肿瘤干细胞系T3A-A3的建立;A:人肿瘤干细胞的分离;1:分离培养的肝癌微血管内皮细胞传至第8代时出现小细胞克隆(T3A细胞);2:经亚细胞克隆纯化后的T3A细胞;3:从T3A成瘤组织中二次分离细胞时仍存在小细胞克隆;4.单细胞克隆纯化后的T3A-A3细胞;B:MTT法从T3A细胞中筛选增殖能力最强的单细胞克隆,其中T3A-A3增殖速度最快。

    图2.RT-PCR分析T3A-A3细胞干细胞标志和干细胞相关基因的表达;A:T3A-A3细胞上干细胞标志的表达;B:T3A-A3细胞上与干细胞自我更新和增殖能力相关基因的表达;C:iPS细胞相关转录子在T3A-A3细胞的表达;

    图3.T3A-A3的染色体核型分析,A:正常对照的胎肝细胞,为二倍体核型;B:对照的肿瘤细胞,为多倍体核型;C:T3A-A3细胞,呈多倍体核型;

    图4.检测黑色素瘤细胞(SK-MEL-1细胞)或组织条件培养基诱导后T3A-A3细胞的gp100表达;A:RT-PCR的检测结果;B:Western blot检测结果;

    各图中1:SK-MEL-1细胞;2:T3A-A3细胞;3:黑色素瘤细胞条件培养基诱导后的T3A-A3细胞;4:黑色素瘤组织条件培养基诱导后的T3A-A3细胞;

    图5.检测淋巴瘤细胞(Daudi细胞)或组织条件培养基诱导后T3A-A3细胞的CD10表达;A:RT-PCR的检测结果;B:Western blot检测结果;

    各图中1:Daudi细胞;2:T3A-A3细胞;3:淋巴瘤细胞条件培养基诱导后的T3A-A3细胞;4:淋巴瘤组织条件培养基诱导后的T3A-A3细胞;

    图6.T3A-A3单克隆抗体在不同人肿瘤组织切片上的免疫组织化学染色;A:肝癌;B:巨细胞型胶质母细胞瘤;C:乳腺癌;D:胶质肉瘤;E:食道癌;F:胃印戒细胞癌。

    【具体实施方式】

    实施例1.人肿瘤干细胞系的建立

    原代分离:本发明所述的人肿瘤干细胞系是在从人肝癌组织分离培养微血管内皮细胞的过程中得到的。肿瘤组织取自中国医学科学院肿瘤医院的一位住院肝癌患者的手术标本,病理诊断为肝细胞肝癌。最初按照文献描述方法(Wu LQ,et al.Phenotypic andfunctional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidalendothelial cells.J Vasc Res 2008;45:78-86)从临床手术切下的人肝癌组织中分离培养微血管内皮细胞,当该微血管内皮细胞传至第8代时出现一群增殖迅速的细胞克隆。细胞体积小,折光性强,增殖迅速(图1A-1)。我们通过亚细胞克隆的方法把这些细胞分离出来,具体地,将培养瓶中的培养液倒掉,用DMEM基础培养基洗数次,除去漂浮细胞,然后在显微镜下,用弯头吸管将小细胞克隆刮下并吸起,接种到另一培养瓶中,使用干细胞培养基培养,具体成分为添加了以下物质的DMEM中:5%干细胞专用胎牛血清、LIF(10ng/ml)、bFGF(100μg/ml)、肝素(40u/ml)。纯化后的T3A细胞增殖迅速(图1A-2)。

    二次成瘤和细胞分离:将上述T3A细胞接种免疫缺陷小鼠,待成瘤后,将瘤组织切下并剪碎,用0.01%的I型胶原酶,37℃消化肿瘤组织。20min后用FCS终止消化,基础培养基洗3次。然后将细胞接种于干细胞培养基中。二次分离的T3A培养过程中再次出现增殖迅速、折光性强的小细胞克隆(图1A-3),然后如下述经单细胞克隆纯化和成瘤能力筛选得到生长最快和成瘤能力最强的克隆T3A-A3(图1A-4)。

    单细胞克隆筛选:将二次成瘤组织中分离的细胞计数,按0.5细胞/孔的密度接种于96孔板。待细胞贴壁后挑出只含一个细胞的孔,作好标记。每3天换一次液,待细胞长至80%汇合时,将其一对一传至24孔板继续培养,80%汇合后再将其传至T25培养瓶,80%汇合后再传至T75培养瓶,最终得到的单细胞克隆共20个,在T75培养瓶中长至汇合后,取部分细胞进行MTT增殖能力测定,余冻存备用。

    MTT测定:将所获得的所有单细胞克隆分别接种于96孔细胞培养板中,接种密度为5×102个细胞/孔,培养过夜后用MTT法分别测定0天,1天,3天,5天,7天的细胞增殖情况,每个时间点设置3个复孔。分别在相应的时间点取出培养板,每孔加入0.5mg/ml MTT 50ul,继续培养4h,然后小心吸走孔内培养液后加入二甲基亚砜150ul,轻轻振荡使结晶紫完全溶解后,在酶标仪波长492nm处测光密度值(OD值)。结果发现克隆T3A-A3生长最快(图1B)。

    成瘤能力筛选:根据MTT结果,选择不同的细胞克隆分别按500,1000,2500,5000,10000,50000个细胞/接种点的六种不同浓度接种NOD/SCID鼠。结果发现,在相同的细胞接种浓度下,MTT法测出的生长最快的T3A-A3克隆成瘤能力最强,表现在同等细胞数时形成肿瘤的潜伏期最短,而且成瘤所需的最低细胞数最少,仅1000个细胞即能成瘤。

    人肿瘤干细胞系的确认:应用RT-PCR方法检测,发现T3A-A3细胞表达干细胞的标志和干细胞的相关基因(如实施例2所述)。并且T3A-A3多次传代后仍表达这些基因。因此确认T3A-A3为人肿瘤干细胞系(命名为T3A-A3)。该人肿瘤干细胞系T3A-A3已于2009年9月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC),其保藏编号为CGMCC No.3291。保藏地址为北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮政编码100101。

    实施例2RT-PCR检测干细胞相关基因在T3A-A3细胞的表达

    使用干细胞培养基将T3A-A3培养于T25培养瓶中,长至90%汇合后,以0.1%胰蛋白酶-0.1%EDTA消化收集细胞,加入10ml无菌PBS,1200rpm/min,室温离心8min,细胞沉淀用Qiagen公司的总RNA提取试剂盒进行总RNA的提取。然后取2ug总RNA,使用Qiagen公司的逆转录试剂盒进行逆转录。然后用PCR方法检测干细胞增殖、自我更新相关和分化的基因表达情况。所扩增的目的基因及其引物序列如下表,所述引物由上海生工生物工程有限公司合成:

    表1.PCR扩增反应中各基因特异的引物序列

      目的基因  引物序列  退火温度  产物长度(bp)  β-actin  上游:5’-TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3’  下游:5’-GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC-3’  55℃  396  Notch-1  上游:5’-ATCGGGCACCTGAACGTGGCG-3’  下游:5’-CACGTCTGCCTGGCTCGGCTC-3’  60℃  600  Bmi-1  上游:5’-GGAGACCAGCAAGTATTGTCCTTTTG-3’  下游:5’-CATTGCTGCTGGGCATCGTAAG-3’  55℃  370  β-catenin  上游:5’-ACTGGCAGCAACAGTCTTACC-3’  下游:5’-TTTGAAGGCAGTCTGTCGTAAT-3’  60℃  836  SMO  上游:5’-ATCTCCACAGGAGAGACTGGTTCGG-3’  下游:5’-AAAGTGGGGCCTTGGGAACATG-3’  57℃  242  Oct-4  上游:5’-CGACCATCTGCCGCTTTGAG-3’  下游:5’-CCCCCTGTCCCCCATTCCTA-3’  60℃  573  CD34  上游:5’-ACAACCTTGAAGCCTAGCCTG-3’  55℃  348

      下游:5’-CAAGACCAGCAGTAGACACTG-3’  ABCG2  上游:5’-GGCCTCAGGAAGACTTATGT-3’  下游:5’-AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT-3’  55℃  342  Nestin  上游:5’-AGAGGGGAATTCCTGGAG-3’  下游:5’-CTGAGGACCAGGACTCTCTA-3’  55℃  495  C-kit  上游:5’-GGCTCTTCTCAACCATCTGTG-3’  下游:5’-ATTTGCCGGTGTTGGTGGCTT-3’  56℃  217  SCF  上游:5’-CTCCTATTTAATCCTCTCGTC-3’  下游:5’-TACTACCATCTCGCTTATCCA-3’  52℃  177  Sox2  上游:5’-GGCAGCTACAGCATGATGCAGGAGC-3’  下游:5’-CTGGTCATGGAGTTGTACTGCAGG-3’  60℃  131  Nanog  上游:5’-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3’  下游:5’-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3’  55℃  256  Lin28  上游:5’-GGAGGCCAAGAAAGGGAATA-3’  下游:5’-CCGCCCCATAAATTCAAGAT-3’  55℃  178  C-myc  上游:5’-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3’  下游:5’-TACCCTCTCAACGACAGCAG-3’  60℃  478  Oct-4  上游:5’-GAGCAAAACCCGGAGGAGT-3’  下游:5’-TTCTCTTTCGGGCCTGCAC-3’  55℃  310  KLF4  上游:5’-CCAGCCAGAAAGCACTAC-3’  下游:5’-GACTCACCAAGCACCATC-3’  55℃  409

    PCR反应条件为预变性94℃2min,循环反应40次,循环条件为:变性94℃15s,退火30s,退火温度见上表,延伸72℃45s。末轮延伸为72℃,8min。最后,PCR产物经2%琼脂糖电泳检测扩增产物,在Alphaimager 2200凝胶成像系统上观察。结果如图2所示,T3A-A3细胞表达干细胞标志分子CD34、ABCG2、Nestin、C-kit和SCF(图2A);表达与干细胞的增殖和自我更新相关的基因Notch-1、Bmi-1、β-catenin、SMO、Oct-4(图2B);表达iPS细胞相关转录因子Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Oct-4和KLF4(图2C)。

    实施例3.T3A-A3细胞的自我更新能力的评价

    集落形成实验及二次集落形成实验  无水乙醇配制10g/L的poly-HEMA(P3932,sigma),包被96孔板,以抑制细胞粘附。将T3A-A3细胞按20个细胞/孔接种于96孔板,设9个复孔。培养基为0.9%甲基纤维素(H4100,stemcell公司)(培养基中各添加物的终浓度分别为5%干细胞专用胎牛血清、10ng/ml LIF、100μg/ml FGF、40u/ml肝素),培养体积为0.2ml/孔。置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养。倒置显微镜下观察,超过50个细胞的计为一个集落。培养于0.9%甲基纤维素的T3A-A3细胞,14天后能见到集落形成;将集落挑出,基础培养基洗2次,配成单细胞悬液,再按上述步骤进行第二次集落形成实验,14天后仍能见到集落形成,说明二次集落形成实验阳性,也即体外实验证实T3A-A3细胞具有自我更新能力。

    二次成瘤实验为了检测T3A-A3细胞是否具有二次成瘤能力,取长至80%汇合的T3A-A3细胞,按50000细胞/接种点的浓度接种到NOD/SCID鼠,从成瘤后的肿瘤组织中分离肿瘤细胞,再次按50000细胞/点,接种5只NOD/SCID鼠。结果发现,1个月后,其中的两只鼠在50000细胞/点能成瘤,3个月时5只鼠均能在50000细胞/点成瘤,且肿瘤的病理类型与第一次成瘤的病理类型一致,说明T3A-A3细胞具有二次成瘤能力。该实验从体内实验的角度证实了T3A-A3细胞具有自我更新能力。

    实施例4.T3A-A3细胞的肿瘤性质的分析

    染色体核型分析将T3A-A3细胞培养在T25培养瓶中,收获前一天换液并加入秋水仙素工作液,终浓度为0.06μg/ml-0.16μg/ml,使细胞停止在分裂中期,16h后收获细胞。KCl(0.075M)低渗处理30min,新鲜配置的甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定细胞,将细胞制片后采用尼康显微镜(Nikon 80i型,日本),PCI图像采集分析卡,通过染色体图像分析工作站(CYTOSCAN,美国联合生物科技公司)进行染色体核型分析。同时以胎肝细胞和肿瘤细胞为对照。结果表明,作为正常干细胞对照的胎肝细胞是二倍体细胞(图3A),作为对照的肿瘤细胞为多倍体核型(图3B),而T3A-A3细胞也为多倍体细胞(图3C)。

    致瘤能力检测  为了检测T3A-A3细胞的成瘤能力,以500,1000,2500,5000,10000,50000细胞/接种点的浓度将T3A-A3细胞接种到NOD/SCID鼠皮下。接种后每周观察肿瘤生长情况,记录成瘤潜伏期、成瘤所需最低细胞数及肿瘤大小。连续观察动物6个月。结果发现T3A-A3细胞(2500-50000细胞/接种点)5-8周能成瘤。1000个细胞的接种点在13周可见到肿瘤形成。这些结果表明,T3A-A3细胞具有较强的致瘤性。

    转移能力检测  取10只NOD/SCID鼠,随机分成两组:实验组和对照组。实验组动物每只鼠肝脏接种T3A-A3细胞1×106,对照组动物每只鼠肝脏接种人肝癌细胞株Bel7402细胞1×106。接种后2个月处死动物,手术打开两组动物腹腔,接种T3A-A3的鼠肝脏均有肿瘤生长,并且发现3只鼠在远处出现了转移灶,说明T3A-A3细胞具有高转移的特性。而人肝癌细胞株Bel-7402细胞接种的NOD/SCID鼠肝脏上肿瘤生长明显,但均未发现转移灶形成。将形成的原发瘤和转移灶肿瘤组织分别固定,进行组织学检查后发现两者的病理类型一致。

    实施例5 T3A-A3细胞的多向分化潜能分析

    为了分析T3A-A3细胞的多向分化潜能,我们将T3A-A3细胞培养于不同的肿瘤微环境,观察其是否能向相应的肿瘤细胞定向分化。在选择用来进行定向诱导的肿瘤细胞时遵循两个原则:一是与T3A-A3来源的肿瘤类型差别大;二是该肿瘤具有独特的特殊标志物。据此,我们选择了两种肿瘤类型:黑色素瘤和淋巴瘤。所用细胞均为ATCC收藏的:黑素瘤细胞SK-MEL-1和淋巴瘤细胞Daudi,购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。

    为了给T3A-A3提供诱导分化的肿瘤微环境,我们将SK-MEL-1和Daudi细胞反复缺氧-复氧后的肿瘤细胞培养上清及超声破碎的肿瘤细胞,作为细胞条件培养基。同时,为了更好地模拟体内肿瘤生长的微环境,我们将肿瘤细胞接种免疫缺陷小鼠,成瘤后切下瘤组织制备匀浆作为组织条件培养基。

    肿瘤细胞条件培养基的制备 黑色素瘤细胞(SK-MEL-1)为悬浮生长的细胞,培养于添加了10%FCS和2mM谷氨酰胺的MEM培养基中。淋巴瘤细胞(Daudi)也为悬浮生长的细胞,培养于10%FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基中。将这两种细胞在37℃,常氧,5%CO2的环境中培养至对数生长状态,然后置于通有95%N2和5%CO2的缺氧装置缺氧24h,随后放回正常培养的环境复氧12h,如此缺氧-复氧反复3次,分别收集细胞和培养基。计数总的细胞数后用超声破碎仪破碎细胞,然后用少量缺氧-复氧的培养液洗细胞碎片,低温高速离心(12000转/分)20min,取上清,0.22μm滤器过滤除菌,-20℃冻存备用。

    肿瘤组织条件培养基的制备 将SK-MEL-1和Daudi分别接种NOD/SCID鼠皮下,2×106细胞/点。为获得较多肿瘤组织,在每只鼠上接种6点,每种细胞接种5只鼠。待肿瘤直径达1cm时手术切下肿瘤组织,称重后放入液氮中速冻,然后用研钵将组织研碎,边研磨边加液氮保持低温状态。将研磨后的组织粉末悬于DMEM基础培养基中(10mg/ml)进行超声,然后低温高速(12000转/分)离心20min。取上清,0.22μm滤器过滤除菌,-20℃冻存备用。

    T3A-A3向黑色素瘤的定向分化  进行诱导分化时,将前述制备的SK-MEL-1细胞条件培养基和含20%FCS的DMEM培养基1∶1混合使用,而组织条件培养基用20%FCS的DMEM培养基稀释至0.1mg/ml使用。用这两种条件培养基分别培养T3A-A3细胞21天。然后比较诱导前后T3A-A3细胞上黑色素瘤细胞特异标志(gp100)的表达,分别从mRNA和蛋白质水平进行了检测(图4)。

    首先利用RT-PCR方法在mRNA水平进行了检测。具体地,于诱导21天后,收集细胞,使用Qiagen公司的总RNA提取试剂盒进行总RNA的提取。然后取2ug总RNA,使用Qiagen公司的逆转录试剂盒进行逆转录。然后用PCR方法检测gp100的基因表达情况。使用的引物序列为:上游引物:5’-AGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCT-3’和下游引物:5’-GGGCCAGGCTCCAGGTAAGTAT-3’(由上海生工生物工程有限公司合成)。PCR反应条件为预变性94℃2min,循环反应40次,条件为94℃15s,64℃30s,72℃45s。末轮延伸为72℃,8min。以β-actin作为内参照。最后,PCR产物经2%琼脂糖电泳检测扩增产物,在Alphaimager 2200凝胶成像系统上观察。结果如图,诱导后的T3A-A3细胞表达黑色素瘤的特异标志gp100,而未诱导的T3A-A3无gp100表达(图4A)。

    随后,我们利用Western Blot分析了诱导后T3A-A3细胞gp100蛋白的表达情况。于诱导21天后,用细胞刮刮下培养瓶中的细胞(冰上操作)。将细胞转移到1.5ml无菌EP管中(约4×106个细胞/管),加入200μl预冷的1×细胞裂解液(Cell Signaling公司),置冰上反应15min;4℃,12000rpm/min,离心15min,取上清,弃沉淀。测定蛋白浓度,分装,-20℃贮存备用。然后将购自Invitrogen公司的NuPAGE Novex Bis-Tris Mini胶装入XCell SureLockTM Mini-Cell电泳槽,内槽加入200ml 1×NuPAGE MES SDS RunningBuffer(NP0002)(加入500μl NuPAGE抗氧化剂),外槽加入600ml 1×NuPAGE MESSDS Running Buffer。将准备好的蛋白样品与上样缓冲液混合,上样。200V,恒压,电泳35min。然后使用Invitrogen公司的iBlotTM干转系统进行转膜,具体步骤按照说明书进行。将膜用5%脱脂奶粉/TBST室温封闭2h后,依次与用封闭液稀释至1∶200的小鼠抗人gp100(ab15228,abcam)单克隆抗体和封闭液稀释至1∶60000的辣根过氧化物酶(Horse-radish peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠二抗室温摇床上孵育2h,内参照使用小鼠抗人β-actin单克隆抗体作为一抗,二抗相同。TBS洗3次后用millipore公司的化学发光试剂盒进行显色反应,并将膜与X光片曝光10-20sec,冲片观察结果。如图显示诱导后的T3A-A3细胞表达gp100,且组织条件培养基诱导后的T3A-A3细胞表达的gp100蛋白较细胞条件培养基诱导的强(图4B)。

    T3A-A3向淋巴瘤的定向分化使用前述制备的Daudi细胞和组织条件培养基,按照向黑色素瘤诱导分化时相同的方法配制诱导分化的培养基,分别培养T3A-A3细胞21天。然后比较诱导前后T3A-A3细胞上淋巴瘤细胞的特异标志(CD10)的表达,分别从mRNA和蛋白质水平进行了检测,具体方法与检测gp100时相同,其中RT-PCR使用CD10特异引物上游:5’-CTGGAGTTCATAATGGATCTTGTAAGC-3’和下游:5’-CATCCAAGTGAGGTCATCTAAAGTCTG-3’(上海生工生物工程有限公司合成)。Western blot使用小鼠抗人CD10作为一抗。(具体方法与试验条件与T3A-A3向黑色素瘤定向分化中所述的相同)

    结果显示,经细胞条件培养基和组织条件培养基诱导21天后,T3A-A3细胞在mRNA水平表达淋巴瘤的特异标志CD10,其中组织条件培养基诱导者强于细胞条件培养基诱导者(图5A);在蛋白质水平上,细胞条件培养基诱导后的T3A-A3细胞未见到明显的CD10蛋白的表达,但组织条件培养基诱导后的T3A-A3细胞表达CD10蛋白(图5B)。

    实施例6T3A-A3单抗在人正常组织和肿瘤组织切片上的染色

    为分析具有本发明所述的人肿瘤干细胞系样特征的细胞是否在人类肿瘤组织中普遍存在,我们制备了T3A-A3特异的单克隆抗体,并在多种临床肿瘤组织上进行了免疫组织化学染色分析。具体地,将T3A-A3细胞用4%多聚甲醛固定液于室温固定30min,基础培养基充分洗涤3次,取沉淀,悬于PBS中,以107/ml的浓度分多点接种至BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物中心)皮下,每只鼠接种量为0.5ml。2周后追加免疫一次,以后每隔一周追加免疫一次,共免疫8次,于末次加强免疫后第4天处死动物,取脾脏,分离脾细胞,与SP2/0细胞进行融合。将融合后的细胞按照每孔1个细胞的密度接种于96孔板。7天后标记只有一个克隆生长的孔,10天后检测这些孔的抗体效价。挑选效价高的孔再次按1个细胞/孔的密度接种96孔板。重复4次后挑选出效价高的单克隆杂交瘤细胞株。将此细胞株接种到石蜡油处理7天后的BALB/c小鼠腹腔,待腹水产生非常明显后处死动物,取腹水,利用亲和柱HiTrapTMrProtein A FF(购自AmershamBiosciences公司)纯化出抗体。随后利用得到的这些抗体在T3A-A3细胞、人正常细胞(脐静脉内皮细胞、肝细胞)、人肿瘤细胞(肝癌细胞、乳腺癌细胞)上进行细胞免疫荧光染色,最终挑选出只在T3A-A3上染色阳性的抗体。

    最后利用这株T3A-A3特异的单克隆抗体在不同的人类肿瘤组织上(肝癌、巨细胞胶质瘤、乳腺癌、胶质肉瘤、食管癌和胃印戒细胞癌)及正常组织上(肝脏、脑、食道、胃)进行免疫组织化学染色。结果发现:在所检测的6种临床肿瘤组织中都存在不同程度的染色阳性细胞(图6),而正常组织中未见到染色阳性细胞。该结果提示,不同肿瘤组织中可能存在具有共同特征的肿瘤干细胞。

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本发明提供一种人肿瘤干细胞系T3A-A3,该人肿瘤干细胞系从原发肝癌患者手术切除的肝癌组织中分离获得,该细胞能够在体外长期传代培养,已传代超过100次,细胞仍然生长迅速,并保持干细胞性质。该细胞既表达多种干细胞的标志、具有干细胞的自我更新能力、具有向不同肿瘤细胞定向分化的潜能;同时也具有肿瘤性质,成瘤能力和转移能力。由于其在体外长期培养而保持性质不变,并且在免疫缺陷鼠体内成瘤能力和转移能力强,是研。

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