技术领域
本发明涉及选配砧穗组合的植物嫁接方法，尤其涉及利用遗传系数选配老油 茶树高效嫁接山茶花的砧穗组合的方法，属于生物技术领域。
背景技术
油茶与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料植物，其主要产品 茶油是一种高级食用油，色清味香，耐储藏，营养比例合理，有“东方橄榄油” 之称。我国油茶产区存在大量的低产油茶林,其部分植株的产量低、效益差，作 为产油树价值不高，如何充分利用其剩余价值以帮助油茶产区农民脱贫致富是一 个重要问题。山茶花是庭院、园林、居家装饰绿化、美化环境的优良珍贵花木， 但其生长速度慢、形成高价值大树一般需数十年。以老油茶树高冠嫁接山茶花可 集二者的优势于一体，既可在2～3年内培育出高大优美的山茶花，又可改造低产 老油茶树，充分发挥其残值效益，增加茶农收入。随着市场对高品质、大型山茶 花需求的日益增加，老油茶树高冠嫁接山茶花已在我国产茶区被广泛应用，并已 培育出许多珍贵山茶花桩景，尽管在嫁接时间、嫁接方法、接后管理及出圃措施 等方面已形成一系列成熟技术，但缺乏高接亲和力、低高接病发生率的砧穗组合 早期诊断评价和优选技术，嫁接不亲和导致的高接病在不同砧穗组合中都有发 现，嫁接3年后，高接病导致整株死亡的发病率高达80％，这严重限制了利用老油 茶树嫁接名贵山茶花产业的健康持续发展。
梁英荣在2006年介绍了嫁接时间、生长势选择砧枝和砧穗组合、接穗采集、 嫁接操作及接后管理等对成年油茶嫁接山茶花技术的影响因素；康志坚在2006 年介绍了油茶树桩采集、移植及嫁接方法和生长势选择山茶花品种的组合方式及 其养护、管护等大桩油茶换冠山茶花的实用技术措施；曹汉雄在2012年介绍了油 茶桩换接山茶花操作过程的技术要点。本发明人按照梁英荣、康志坚和曹汉雄等 提供的方法以老油茶树嫁接山茶花，但并没能有效防止高接病的发生，一些园区 高接病发病率达80％以上。目前，在油茶树嫁接山茶花领域仅有一项名称为油茶 嫁接山茶花嫁接切口(伤口)处理方法(公开号为CN103109682A)的发明专利， 并没有砧穗组合选配方面的启示；而且，现有技术中也没有油茶树嫁接山茶花的 砧穗组合分子识别技术的相关报道。
发明内容
针对上述问题，本发明以老油茶树为砧木，以山茶花为穗条，根据不同老油 茶树和山茶花种质间的Dice遗传系数设计不同的砧穗组合，根据其嫁接成活率和 高接病发病率选出最适的砧穗组合，可有效避免高接病发生，实现老油茶树高效 嫁接名贵山茶花，为山茶花产业提供技术依托。本发明的技术方案如下：一种老 油茶树高效嫁接山茶花砧穗组合选择的分子识别方法，包括以下顺序的步骤：
(1)选择不同品种的老油茶树和山茶花，分别提取其DNA；
(2)筛选适用于老油茶树和山茶花的SSR标记引物；
(3)利用筛选出的SSR标记引物，计算不同品种老油茶树和山茶花间的Dice 遗传系数；
(4)将Dice遗传系数划分为8个级别；在每个Dice遗传系数级别内，以老油 茶树为砧木，山茶花为穗条，设计不同的砧穗组合；
(5)根据步骤(4)设计的砧穗组合，以老油茶树嫁接山茶花。
进一步的，所述步骤(1)获得DNA的方法为：改良CTAB方法。
进一步的，所述步骤(2)筛选SSR标记引物的方法包括如下步骤：
1)利用RNA-Seq技术开发老油茶树的SSR标记序列；
2)采用Primer Premier 5.0软件设计特异引物：参数为：引物长度(20～ 24nt)、3’端稳定性(-6.0～-9.0kal/mol)、引物Tm值(55～60℃)、GC含量 (45～55％)、引物rating值＞90。以老油茶树和山茶花的DNA为模板，进行PCR 扩增，根据聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳结果，筛选出SSR标记引物。
进一步的，所述步骤(5)老油茶树嫁接山茶花所使用的方法为撕皮嵌接法。
本发明以SSR标记检测老油茶树和山茶花间遗传系数技术为基础，再根据不 同遗传系数的砧穗组合间的嫁接成活率和高接病发生率，选配出最适砧穗组 合，有效地降低高接病发病率，保证老油茶树高效嫁接山茶花。
本发明的有益效果如下:
(1)本发明的分子识别方法操作简单，易推广扩大使用；
(2)使用本发明方法提供的分子识别方法，筛选出Dice遗传系数范围 0.551～0.600及0.751～0.800的老油茶树和山茶花作为嫁接砧穗组合，其嫁接 成活率分别为86％和84％，高接病发病率分别低到3.5％和2.7％，保证了老油茶树高 效嫁接山茶花。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明：
图1为SSR标记引物垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中1～19为山茶花；20～25 为老油茶树；
图2为老油茶树嫁接山茶花成活示意图；
图3为老油茶树嫁接山茶花死亡示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但这不限制本发明的范围，实施 例以在玉屏县大面积种植的7种无性系老油茶树，48种山茶花为材料；老油茶树 品种分别为：湘210、湘林5号、长林27、岑软11、Y-41、Y-44、Y-1；山茶花品 种分别为：大松子、大叶桂、大紫袍、丹顶鹤、杜丹魁、凤山茶、鹤顶鹤、黑牡 丹、恨天高、花露珍、花仙子、火瀑布、娇美人、金芯芙蓉、锦袍红、靖安茶、 菊瓣、宽彩带、六角大红、六角银丝、玛瑙1、玛瑙2、美布尔、美国大红、魔术 城、南天武士、农香、乔伊、秋杜丹、上海女士、师子头、松子魁、童子面、午 夜飘云、新松花、雪娇、早杜丹、早桃红、正黄旗、织女、朱沙紫袍、紫蝴蝶； NaAc溶液的浓度为3mol/L，PH为5.2。
实施例1
(1)以7种无性系老油茶树及48种山茶花为材料，利用改良CTAB方法分别提取其 DNA，步骤如下：
1)将老油茶树叶片或山茶花叶片10克放入研钵，倒入适量液氮研磨后，移入预 先加有700μL 2×CTAB的离心管中，置于65℃水浴处理45～60min，离心 (4℃,1000rpm，10min)获得上清液Ⅰ；
2)取步骤1)离心管中的上清液Ⅰ600μL于新离心管中，加入总体积为600μL的 酚、氯仿和异戊醇混合液(体积比为25：24：1)，摇匀后离心(4℃,1000rpm， 10min)得上清液Ⅱ；
3)取上清液Ⅱ550μL于新离心管中，加入500μL 10×CTAB，摇匀后置于65℃水 浴中溶解2～3min，再加入总体积为50μL的酚：氯仿：异戊醇混合液(体积比为 25：24：1)，摇匀后离心(4℃,1000rpm，10min)，得上清液Ⅲ；
4)取上清液Ⅲ加入其体积2倍的无水乙醇，再加入其体积1/10的NaAc溶液，静置 2小时以上，得沉淀；
5)将步骤4)所得沉淀洗涤后烘干，烘干温度为37℃，时间为8～10min；
6)将步骤5)烘干后的沉淀溶解后常温静置2小时，即得老油茶树DNA样品或山茶 花DNA样品；
(2)以老油茶树叶片和果实为材料，以公知任意一种方法提取其RNA，并采用 RNA-Seq技术进行RNA测序，然后根据序列搜索简单重复序列，共检测到8564个 SSR标记序列；
(3)采用Primer Premier 5.0软件设计特异引物：参数为：引物长度(20～24nt)、 3’端稳定性(-6.0～-9.0kal/mol)、引物Tm值(55～60℃)、GC含量(45～55％)、 引物rating值＞90。以4个不同油茶和山茶花品种的DNA为模板，进行PCR扩增， 根据聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳结果，选取能扩增出条带、位点条带清晰，且有 多态性的引物对，共筛选出38对SSR标记引物，见表1；
(4)利用步骤(3)筛选出的38对SSR标记引物分别对步骤(1)提取得到的老油 茶树DNA和山茶花DNA进行PCR扩增，扩增产物利用8％聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检 测；
(5)以电泳检测结果条带的有无进行计数，有记为“1”，无记为“0”，利用 NTYsys2.0软件计算Dice遗传系数；
(6)将Dice遗传系数分为8个级别，分别为0.400～0.450，0.451～0.500、 0.501～0.550，0.551～0.600，0.601～0.650，0.651～0.700，0.701～0.750 和0.751～0.800；在每个Dice遗传系数级别内，以老油茶树为砧木，山茶花为 穗条，设计不同的砧穗组合，组合如下表2；
(7)根据步骤(6)设计的砧穗组合，采用撕皮嵌接法以老油茶树嫁接山茶花， 每个组合均是在300个砧木上嫁接300个穗条；
(8)嫁接完成24个月后，分别调查观测不同砧穗组合的生长情况，计算嫁接成 活率，计算公式为：嫁接成活率＝穗条成活数/穗条嫁接数；
(9)嫁接完成48个月后，分别调查观测砧木的高接病发生情况，计算高接病发 病率，计算公式为：高接病发病率＝发生高接病砧木/嫁接总砧木。
计算不同砧穗组合的嫁接成活率和高接病发病率，统计结果如下表2：
表1 38对SSR标记引物
表2 不同砧穗组合的嫁接成活率和高接发病率统计表
由表2知，使用本发明提供的利用Dice遗传系数选配砧穗组合的方法，可得 到嫁接成活率高、高接病发病率低的砧穗组合范围为0.551～0.600及0.751～ 0.800，其嫁接成活率高达84％以上，高接病发病率低于4％，其中嫁接亲和力最 好，高接病发病率最低的组合为以“Y-41”为砧木，“南天武士”为穗条，在300 个“Y-41”上嫁接300个“南天武士”，嫁接成活率为87.52％，高接病发病率为 2.78％。