技术领域
本发明涉及一种牛血清白蛋白的制备方法，属于蛋白制备技术领域。
背景技术
牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。
BSA牛血清中白蛋白一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入BSA后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加BSA后能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不会受到什么影响。对多数底物DNA而言，BSA可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，BSA可以使酶更加稳定，因为在不含BSA的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活10"20min甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。
牛血清中白蛋白的制备方法很多，主要采用盐析法、有机溶剂沉淀法和热激法提取。盐析法用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得；有机溶剂沉淀法最早用于人血液制品的生产，利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中的溶解度不同分离血浆蛋白质，可以生产出多种血浆蛋白；热激法是取牛血用枸橼酸钠抗凝离心后得到血浆，加热，加入辛酸钠，调pH值后加乙醇，再经过滤、脱盐、浓缩、冻干后得牛血清中白蛋白。盐析法原理简单，但硫酸铵对设备有一定的腐蚀性，整个工艺比较耗时，且硫酸铵用量很多，所得产品纯度只有80～90%，收率为0.8～1%，生产效率低，成本偏高；乙醇是一种非特异性沉淀剂，尽管牛血清中白蛋白生产效率显著，但产品纯度不高，作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集和变性，设备和厂房投入很大，能源消耗大，费时费力，所得产品纯度在90～95%，收率为10%左右，相对成本较高；单纯使用热激法，虽料少省时，但收率只有1.8～2.0%，且纯度不高，只能达到90%。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前牛血清中白蛋白制备方法纯度低、生产效率低、收率低、成本高的弊端，提供了一种牛血清白蛋白的制备方法，该方法首先通过向新鲜牛血液加入水蛭素防止血液凝固，然后将其离心分离，去除血液中部分杂质，再将血浆与氯化钠、氯化钾等混合，通过半透膜获得牛血清白蛋白，再将离心残留液与半透膜下部溶液混合，加入低温无水乙醇，搅拌析出牛血清白蛋白，将两次获得的牛血清白蛋白进行干燥，得纯度高的牛血清白蛋白。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
（1）取600～800mL新鲜牛血液放入容器中，向其中加入400～600mg水蛭素，缓慢搅拌5～10min，转速设定为100～200r/min，再将转速增加至2100～2500r/min，搅拌40～50min，温度设定为30～35℃，然后将其放入离心机中进行离心分离，收集血浆，残留液收集备用；
（2）取8～10g氯化钠、0.4～0.8g氯化钾、0.2～0.4g磷酸二氢钾和1.6～2.0g磷酸二氢钾放入容器中，向其中加入400～600mL去离子水，搅拌均匀，使用质量分数为15%的盐酸溶液调节pH为7.0～7.3，将上述所收集的血浆倒入容器中，搅拌均匀，温度设定为30～35℃，静置10～15min，得混合液；
（3）将上述的混合液放入离心机中离心分离10～15min，转速设定为4000～5000r/min，取上清液，在容器中部安装一半透膜，将上清液倒在半透膜上方，密封，对容器顶部加压至1～2MPa，温度设定为40～45℃，待无液体从半透膜析出时，停止加压，收集半透膜上部残留物备用；
（4）将上述半透膜下部的溶液及步骤（1）所收集的残留液放入容器中，使用质量分数0.2%的磷酸氢二钾溶液调节pH为7.6～8.0，冷却至0～2℃，快速搅拌，然后向其中加入温度为－25～－20℃的无水乙醇直至其质量分数达到30～40%，保持温度为－6～－4℃，搅拌均匀，待无沉淀产生后停止搅拌，静置5～10min，过滤；
（5）将上述所得的过滤物与步骤（3）中所收集的残留物混合均匀，将其放入喷雾干燥机中，进行喷雾干燥，再将干燥后所得的粉末放在紫外灯下照射10～15s，紫外线强度为1000～1600μw/cm2、波长为260～280nm，得到牛血清白蛋白，装瓶在温度为2～5℃下，保存即可。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）该方法所得的产品纯度高，收率高，纯度在98～99%，收率为20～30%；
（2）成本低、生产效率高，满足相关行业对牛血清白蛋白的质量要求。
具体实施方式
首先取600～800mL新鲜牛血液放入容器中，向其中加入400～600mg水蛭素，缓慢搅拌5～10min，转速设定为100～200r/min，再将转速增加至2100～2500r/min，搅拌40～50min，温度设定为30～35℃，然后将其放入离心机中进行离心分离，收集血浆，残留液收集备用；取8～10g氯化钠、0.4～0.8g氯化钾、0.2～0.4g磷酸二氢钾和1.6～2.0g磷酸二氢钾放入容器中，向其中加入400～600mL去离子水，搅拌均匀，使用质量分数为15%的盐酸溶液调节pH为7.0～7.3，将上述所收集的血浆倒入容器中，搅拌均匀，温度设定为30～35℃，静置10～15min，得混合液；然后将上述的混合液放入离心机中离心分离10～15min，转速设定为4000～5000r/min，取上清液，在容器中部安装一半透膜，将上清液倒在半透膜上方，密封，对容器顶部加压至1～2MPa，温度设定为40～45℃，待无液体从半透膜析出时，停止加压，收集半透膜上部残留物备用；再将上述半透膜下部的溶液及步骤（1）所收集的残留液放入容器中，使用质量分数0.2%的磷酸氢二钾溶液调节pH为7.6～8.0，冷却至0～2℃，快速搅拌，然后向其中加入温度为－25～－20℃的无水乙醇直至其质量分数达到30～40%，保持温度为－6～－4℃，搅拌均匀，待无沉淀产生后停止搅拌，静置5～10min，过滤；最后将上述所得的过滤物与步骤（3）中所收集的残留物混合均匀，将其放入喷雾干燥机中，进行喷雾干燥，再将干燥后所得的粉末放在紫外灯下照射10～15s，紫外线强度为1000～1600μw/cm2、波长为260～280nm，得到牛血清白蛋白，装瓶在温度为2～5℃下，保存即可。
实例1
首先取600mL新鲜牛血液放入容器中，向其中加入400mg水蛭素，缓慢搅拌5min，转速设定为100r/min，再将转速增加至2100r/min，搅拌40min，温度设定为30℃，然后将其放入离心机中进行离心分离，收集血浆，残留液收集备用；取8g氯化钠、0.4g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾和1.6g磷酸二氢钾放入容器中，向其中加入400mL去离子水，搅拌均匀，使用质量分数为15%的盐酸溶液调节pH为7.0，将上述所收集的血浆倒入容器中，搅拌均匀，温度设定为30℃，静置10min，得混合液；然后将上述的混合液放入离心机中离心分离10min，转速设定为4000r/min，取上清液，在容器中部安装一半透膜，将上清液倒在半透膜上方，密封，对容器顶部加压至1MPa，温度设定为40℃，待无液体从半透膜析出时，停止加压，收集半透膜上部残留物备用；再将上述半透膜下部的溶液及所收集的残留液放入容器中，使用质量分数0.2%的磷酸氢二钾溶液调节pH为7.6，冷却至0℃，快速搅拌，然后向其中加入温度为－25℃的无水乙醇直至其质量分数达到30%，保持温度为－6℃，搅拌均匀，待无沉淀产生后停止搅拌，静置5min，过滤；最后将上述所得的过滤物与所收集的残留物混合均匀，将其放入喷雾干燥机中，进行喷雾干燥，再将干燥后所得的粉末放在紫外灯下照射10s，紫外线强度为1000μw/cm2、波长为260nm，得到牛血清白蛋白，装瓶在温度为2℃下，保存即可。
该方法所得的产品纯度高，收率高，纯度在98.8%，收率为22%；成本比其他方法的成本降低了15%，生产效率比其他方法提高了20%，满足相关行业对牛血清白蛋白的质量要求，适合大规模的生产。
实例2
首先取700mL新鲜牛血液放入容器中，向其中加入500mg水蛭素，缓慢搅拌8min，转速设定为150r/min，再将转速增加至2300r/min，搅拌45min，温度设定为32℃，然后将其放入离心机中进行离心分离，收集血浆，残留液收集备用；取9g氯化钠、0.6g氯化钾、0.3g磷酸二氢钾和1.8g磷酸二氢钾放入容器中，向其中加入500mL去离子水，搅拌均匀，使用质量分数为15%的盐酸溶液调节pH为7.2，将上述所收集的血浆倒入容器中，搅拌均匀，温度设定为32℃，静置12min，得混合液；然后将上述的混合液放入离心机中离心分离13min，转速设定为4500r/min，取上清液，在容器中部安装一半透膜，将上清液倒在半透膜上方，密封，对容器顶部加压至1.5MPa，温度设定为42℃，待无液体从半透膜析出时，停止加压，收集半透膜上部残留物备用；再将上述半透膜下部的溶液及所收集的残留液放入容器中，使用质量分数0.2%的磷酸氢二钾溶液调节pH为7.8，冷却至1℃，快速搅拌，然后向其中加入温度为－22℃的无水乙醇直至其质量分数达到35%，保持温度为－5℃，搅拌均匀，待无沉淀产生后停止搅拌，静置7min，过滤；最后将上述所得的过滤物与所收集的残留物混合均匀，将其放入喷雾干燥机中，进行喷雾干燥，再将干燥后所得的粉末放在紫外灯下照射13s，紫外线强度为1300μw/cm2、波长为270nm，得到牛血清白蛋白，装瓶在温度为4℃下，保存即可。
该方法所得的产品纯度高，收率高，纯度在99.2%，收率为27%；成本比其他方法的成本降低了18%，生产效率比其他方法提高了25%，满足相关行业对牛血清白蛋白的质量要求，适合大规模的生产。
实例3
首先取800mL新鲜牛血液放入容器中，向其中加入600mg水蛭素，缓慢搅拌10min，转速设定为200r/min，再将转速增加至2500r/min，搅拌50min，温度设定为35℃，然后将其放入离心机中进行离心分离，收集血浆，残留液收集备用；取10g氯化钠、0.8g氯化钾、0.4g磷酸二氢钾和2.0g磷酸二氢钾放入容器中，向其中加入600mL去离子水，搅拌均匀，使用质量分数为15%的盐酸溶液调节pH为7.3，将上述所收集的血浆倒入容器中，搅拌均匀，温度设定为35℃，静置15min，得混合液；然后将上述的混合液放入离心机中离心分离15min，转速设定为5000r/min，取上清液，在容器中部安装一半透膜，将上清液倒在半透膜上方，密封，对容器顶部加压至2MPa，温度设定为45℃，待无液体从半透膜析出时，停止加压，收集半透膜上部残留物备用；再将上述半透膜下部的溶液及所收集的残留液放入容器中，使用质量分数0.2%的磷酸氢二钾溶液调节pH为8.0，冷却至2℃，快速搅拌，然后向其中加入温度为－20℃的无水乙醇直至其质量分数达到40%，保持温度为－4℃，搅拌均匀，待无沉淀产生后停止搅拌，静置10min，过滤；最后将上述所得的过滤物与所收集的残留物混合均匀，将其放入喷雾干燥机中，进行喷雾干燥，再将干燥后所得的粉末放在紫外灯下照射15s，紫外线强度为1600μw/cm2、波长为280nm，得到牛血清白蛋白，装瓶在温度为5℃下，保存即可。
该方法所得的产品纯度高，收率高，纯度在99.9%，收率为30%；成本比其他方法的成本降低了20%，生产效率比其他方法提高了30%，满足相关行业对牛血清白蛋白的质量要求，适合大规模的生产。