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1、10申请公布号CN102115770A43申请公布日20110706CN102115770ACN102115770A21申请号201010527359622申请日20101028C12P7/5220060171申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号72发明人郑建仙74专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人李卫东54发明名称从咖啡果中分离24甲氧基苯氧基丙酸的工业化方法57摘要本发明公开了从咖啡果中分离24甲氧基苯氧基丙酸的工业化方法。先选择咖啡子叶作为外植体，诱导愈伤组织产生，将经过原生质诱变育种的咖啡树所结的咖啡果实干燥、粉碎，用含水乙醇回流热。
2、提，滤去滤渣，提取液真空浓缩至无醇味；后经溶剂脱脂，水层再用水饱和的正丁醇萃取，减压浓缩并干燥得粗提物；待用热水溶解后，上大孔吸附树脂柱，先后用水和乙醇洗脱；减压回收乙醇，真空干燥或喷雾干燥，最后在酸性条件下进行23次重结晶，产品纯度高达999以上。24甲氧基苯氧基丙酸对各种糖和甜味物质都有很好的甜味抑制作用，可作为新型食品添加剂应用于月饼、糖果、蜜饯中以抑制过高的甜味。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页CN102115772A1/1页21从咖啡果中分离24甲氧基苯氧基丙酸的方法，其特征在于包括如下步骤1选择咖啡子叶作为外植体，诱导愈伤组织产。
3、生咖啡子叶经过消毒，接种于添加110MOL/L2，4二氯苯氧乙酸作为生长素和0405MOL/L6呋喃甲基腺嘌呤作为细胞分裂素的MS基础培养基上，温度为2530，培养35周，产生愈伤组织，愈伤组织经过继代培养后，挑选优选质地松散、颜色黄白、表面湿润的颗粒状愈伤组织，生长良好的愈伤组织培养形成细胞悬浮培养体系，用CO60R射线以4000R、7000R、10000R、15000R、20000R和25000R五个不同辐射剂量进行辐射处理，筛选出24甲氧基苯氧基丙酸含量高的培养物，分离出原生质，近一步培养获得完整植株，获得遗传性稳定一致的突变咖啡种苗品种PK；该品种咖啡果实中的24甲氧基苯氧基丙酸平均含。
4、量达到0208；2将经过步骤1原生质诱变育种的咖啡树所结的咖啡果实干燥、粉碎，过6080目筛，用重量浓度为6095的乙醇回流提取25次，每次回流14H；滤去滤渣，提取液真空浓缩至不含乙醇，用6090热水溶解后溶剂萃取25次；所述的溶剂为石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、氯仿和/或二氯甲烷；3水层用水饱和的正丁醇萃取25次，合并萃取液，减压浓缩并干燥得24甲氧基苯氧基丙酸粗提物；4将粗提物用6090热水溶解，上大孔吸附树脂柱，先用25倍柱体积的水洗，弃去洗脱液，再用25倍柱体积的重量浓度为1040的乙醇洗脱，弃去洗脱液，最后用25倍柱体积的质量浓度为4080的乙醇洗脱，收集洗脱液；5减压回。
5、收乙醇，真空干燥或喷雾干燥得24甲氧基苯氧基丙酸精提物；6精提物在PH26的酸性条件下进行23次重结晶，制得24甲氧基苯氧基丙酸。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的咖啡果实包括外皮、果肉、内果皮、银皮和咖啡豆。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于愈伤组织继代培养方法是优选生长良好，祛除发黄的愈伤组织，接种于与愈伤组织诱导相同的培养基中，温度为2530，暗培23周，期间更换培养基13次。4根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞悬浮培养体系的形成是在愈伤组织继代培养后，将筛选出的愈伤组织放入与愈伤组织诱导相同的液体培养基中，温度为2530，转速为120R/MIN，暗培养812天，。
6、培养出悬浮单细胞系。5根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用的是大孔吸附树脂包括ZTC1、XAD4、AB8、X5、D101、D16、DA201、S8、H103、NK107、CAD40和SIP系列各种规格和型号大孔吸附树脂。权利要求书CN102115770ACN102115772A1/7页3从咖啡果中分离24甲氧基苯氧基丙酸的工业化方法技术领域0001本发明属于食品添加剂中的24甲氧基苯氧基丙酸，特别是涉及一种具有抑制甜味、从咖啡果中分离24甲氧基苯氧基丙酸的方法，产品纯度高达999以上，24甲氧基苯氧基丙酸可作为新型食品添加剂应用于月饼、糖果、蜜饯等高糖食品中用以抑制过高的甜味。背景技术00。
7、02甜味抑制剂是通过阻塞甜度和味觉的受体，从而控制或降低含糖食品的甜度的一类新型添加剂。国内很多传统食品，如蜜饯、月饼、巧克力等，都是以蔗糖作为防腐剂的，在达到防腐的同时，不同程度的存在着过甜的问题。而使用了甜味抑制剂后，既能发挥蔗糖的防腐、改善质构等功能，又不会使食品过甜而影响口感。因此甜味抑制剂的应用前景十分广泛。0003我们在中国发明专利ZL2005101013211已报道过一种天然甜味抑制剂三萜烯糖苷的工业化生产方法。它是从森林匙羹藤酸GLYMNEMICACID、HODULCIN存在于鼠李科植物HOVENIADULCISTHUMB的叶子中及某些枣属植物如大枣、酸枣叶、种子、果实中分离出。
8、来的。0004本专利报道的24甲氧基苯氧基丙酸是另一种对蔗糖、葡萄糖及其他所有甜味物质都有效的甜味抑制剂。目前，国内外生产24甲氧基苯氧基丙酸主要采用化学合成法，该过程易产生有毒副产物及有毒化学异构体，给食品安全造成隐患。已知24甲氧基苯氧基丙酸天然存在于咖啡豆中，但天然咖啡豆中的24甲氧基苯氧基丙酸含量仅为05512MG/KG，显然没有经济价值。0005世界上第一株咖啡树是在非洲之角发现的，咖啡的种植始于15世纪。它在植物分类学中属于茜草科常绿灌木，侧枝水平伸展，对生，偶有三枝轮生者；单叶对生，花是210朵丛生于叶腋。果实是核果椭圆形，初果为深绿色，成熟时黄红色或紫红色，咖啡的果实是由外皮、。
9、果肉、内果皮、银皮，和被上述几层包在最里面的种子咖啡豆所形成，种子位于果实中心部份。0006到目前为止，尚未发现以咖啡果实为原料，生产出具有抗甜活性的24甲氧基苯氧基丙酸的专利文献报道。本发明中采用溶剂提取和大孔树脂纯化相结合的方法，制得高纯度的天然24甲氧基苯氧基丙酸提取物。发明内容0007本发明所要解决的技术问题在于针对上述问题，利用植物细胞培养技术，通过咖啡豆细胞悬浮培养法生产24甲氧基苯氧基丙酸，具有生产周期短，产率高，成本低等特点。0008本发明涉及一种抑制甜味、天然高纯度24甲氧基苯氧基丙酸的工业化生产方法。该提取物中抗甜活性的24甲氧基苯氧基丙酸含量达999以上。制成的产说明书C。
10、N102115770ACN102115772A2/7页4品可用于抑制某些食品如糖果、蜜饯、月饼等过高的甜度。0009本发明的目的通过如下技术方案实现0010从咖啡果中分离24甲氧基苯氧基丙酸的方法，包括如下步骤00111选择咖啡子叶作为外植体，诱导愈伤组织产生咖啡子叶经过消毒，接种于添加110MOL/L2，4二氯苯氧乙酸作为生长素和0405MOL/L6呋喃甲基腺嘌呤作为细胞分裂素的MS基础培养基上，温度为2530，培养35周，产生愈伤组织，愈伤组织经过继代培养后，挑选优选质地松散、颜色黄白、表面湿润的颗粒状愈伤组织，生长良好的愈伤组织培养形成细胞悬浮培养体系，用CO60R射线以4000R、70。
11、00R、10000R、15000R、20000R和25000R五个不同辐射剂量进行辐射处理，筛选出24甲氧基苯氧基丙酸含量高的培养物，分离出原生质，近一步培养获得完整植株，获得遗传性稳定一致的突变咖啡种苗品种PK；该品种咖啡果实中的24甲氧基苯氧基丙酸平均含量达到0208；00122将经过步骤1原生质诱变育种的咖啡树所结的咖啡果实干燥、粉碎，过6080目筛，用重量浓度为6095的乙醇回流提取25次，每次回流14H；滤去滤渣，提取液真空浓缩至不含乙醇，用6090热水溶解后溶剂萃取25次；所述的溶剂为石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、氯仿和/或二氯甲烷；00133水层用水饱和的正丁醇萃取25。
12、次，合并萃取液，减压浓缩并干燥得24甲氧基苯氧基丙酸粗提物；00144将粗提物用6090热水溶解，上大孔吸附树脂柱，先用25倍柱体积的水洗，弃去洗脱液，再用25倍柱体积的重量浓度为1040的乙醇洗脱，弃去洗脱液，最后用25倍柱体积的质量浓度为4080的乙醇洗脱，收集洗脱液；00155减压回收乙醇，真空干燥或喷雾干燥得24甲氧基苯氧基丙酸精提物；00166精提物在PH26的酸性条件下进行23次重结晶，制得24甲氧基苯氧基丙酸。0017所述的咖啡果实包括外皮、果肉、内果皮、银皮和咖啡豆。0018愈伤组织继代培养方法是优选生长良好，祛除发黄的愈伤组织，接种于与愈伤组织诱导相同的培养基中，温度为253。
13、0，暗培23周，期间更换培养基13次。0019所述细胞悬浮培养体系的形成是在愈伤组织继代培养后，将筛选出的愈伤组织放入与愈伤组织诱导相同的液体培养基中，温度为2530，转速为120R/MIN，暗培养812天，培养出悬浮单细胞系。0020大孔吸附树脂包括ZTC1、XAD4、AB8、X5、D101、D16、DA201、S8、H103、NK107、CAD40和SIP系列各种规格和型号大孔吸附树脂。0021本发明涉及的抗甜活性的24甲氧基苯氧基丙酸的生产工艺如下00221将植物原料干燥、粉碎，过6080目筛，用6095的乙醇回流提取25次，每次回流14H；00232滤去滤渣，提取液真空浓缩至无醇味，用。
14、热水溶解后溶剂萃取25次；00243水层用水饱和的正丁醇萃取25次，合并萃取液，减压浓缩并干燥得24甲氧基苯氧基丙酸粗提物；00254将粗提物用热水溶解，上大孔吸附树脂柱，先用25倍柱体积的水洗，弃去洗说明书CN102115770ACN102115772A3/7页5脱液，再用25倍柱体积的1040的乙醇洗脱，弃去洗脱液，最后用25倍柱体积的4080的乙醇洗脱，收集4080乙醇洗脱液；00265减压回收乙醇，真空干燥或喷雾干燥得24甲氧基苯氧基丙酸精提物。00276精提物在PH26的酸性条件下进行3次重结晶。0028所使用的原料包括经特别育种的咖啡属植物的叶、种子、果实各个部位。回流提取剂乙醇的。
15、优选浓度为90，优选提取次数为3次，每次2H。热水溶解后萃取剂是石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、氯仿、二氯甲烷或它们的复合物如石油醚/乙酸乙酯、乙醚/乙酸乙酯，优选萃取次数为3次。水饱和的正丁醇的优选萃取次数为萃取3次。采用的大孔吸附树脂，包括ZTC1，XAD4，AB8，X5，D101，D16，DA201，S8，H103，NK107，CAD40，SIP系列等各种规格和型号，优选的型号为X5，D101，AB8。上大孔吸附树脂柱时，先用4倍柱体积的水洗，再用3倍柱体积的2030的乙醇洗脱，最后用3倍柱体积的7080的乙醇洗脱。制得的24甲氧基苯氧基丙酸精提物，其特征为白色至浅黄色，粉末状，。
16、甜味，总得率0105，纯度8085。精提物在PH26的酸性条件下进行3次重结晶，纯度提高至999。本发明的甜味抑制试验显示该提取物具有很好的抗甜活性，比文献报道的效果要好。0029与现有技术相比，本发明具有如下优点00301、生产成本较低。育种后咖啡果实中的24甲氧基苯氧基丙酸平均含量达到0208，含量较自然咖啡果中的含量高很多，具备工业化生产的经济价值；00312、提取工艺简单。采用此提取工艺步骤少，提取过程中有效成分损失少，提取过程所用的有机溶剂，可以收集循环使用，不存在副产物污染环境问题。0032具体实施方法0033下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但是实施例并不构成对本发明要求保护。
17、范围的限制。0034实施例10035采用原生质诱变育种24甲氧基苯氧基丙酸含量高的咖啡种苗。首先选择咖啡子叶作为外植体，诱导愈伤组织产生，具体工艺为咖啡子叶经过消毒，接种于添加1MOL/L2，4二氯苯氧乙酸作为生长素和05MOL/L6呋喃甲基腺嘌呤作为细胞分裂素的MS基础培养基上以在培养基中的浓度计，MS基础培养基成分组成为单位MG/LKNO31900，NH4NO31650，K2HPO4170，MGSO47H2O370，CACL22H2O440，KI083，H3BO362，MNSO44H2O223，ZNSO47H2O86，NAMOO42H2O025，CUSO45H2O0025，COCL26H2。
18、O0025，NA2EDTA373，FESO47H2O278，蔗糖30000，肌醇100，盐酸05，盐酸吡哆醇05，盐酸硫胺素04，甘氨酸2，温度为28，培养4周，产生愈伤组织，愈伤组织经过继代培养后具体工艺为优选生长良好，祛除发黄的愈伤组织，接种于与愈伤组织诱导相同的培养基中，温度为28，暗培3周，期间更换培养基1次，挑选优选质地松散、颜色黄白、表面湿润的颗粒状愈伤组织，生长良好的愈伤组织培养形成细胞悬浮培养体系具体工艺为将筛选出的愈伤组织放入与愈伤组织诱导相同的液体培养基中，温度为28，转速为120R/MIN，暗培养10天，培养出悬浮单细胞系，用CO60R射线以不同辐射剂量4000R，700。
19、0R，10000R，15000R，20000R，25000R五个剂量进行辐射处理，筛选出24甲氧基苯氧基丙酸含量高的培养物，分离出原生质，近一步培养获得完整植株，从而获得遗传性稳定一致的说明书CN102115770ACN102115772A4/7页6突变咖啡种苗品种PK。经测试，该品种咖啡果实中的24甲氧基苯氧基丙酸平均含量达到0208，已达到工业化分离的经济要求。0036取PK品种的咖啡豆粗粉500KG，用90的乙醇回流提取3次，每次回流2H。滤去滤渣，提取液真空浓缩至无醇味；用70热水溶解后经乙醚萃取3次，所得水层再用水饱和的正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压浓缩并干燥得粗提物；将其用70热。
20、水溶解，上D101型大孔吸附树脂柱，先用4倍柱体积的水洗，再用3倍柱体积20质量浓度的乙醇洗脱，弃去洗液，最后用3倍柱体积80质量浓度的乙醇洗脱，收集80质量浓度的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥得24甲氧基苯氧基丙酸精提物22KG。精提物再在PH3，15的酸性条件重结晶3次，得到24甲氧基苯氧基丙酸结晶物19KG。全过程得率038，终产品为白色粉末，纯度999。0037实施例20038采用原生质诱变育种24甲氧基苯氧基丙酸含量高的咖啡种苗。首先选择咖啡子叶作为外植体，诱导愈伤组织产生，具体工艺为咖啡子叶经过消毒，接种于添加5MOL/L2，4二氯苯氧乙酸作为生长素和04MOL/L6呋喃甲基腺。
21、嘌呤作为细胞分裂素的MS基础培养基以在培养基中的浓度计，MS基础培养基成分组成为单位MG/LKNO31900，NH4NO31650，K2HPO4170，MGSO47H2O370，CACL22H2O440，KI083，H3BO362，MNSO44H2O223，ZNSO47H2O86，NAMOO42H2O025，CUSO45H2O0025，COCL26H2O0025，NA2EDTA373，FESO47H2O278，蔗糖30000，肌醇100，盐酸05，盐酸吡哆醇05，盐酸硫胺素04，甘氨酸2上，温度为25，培养6周，产生愈伤组织。愈伤组织经过继代培养后具体工艺为优选生长良好，祛除发黄的愈伤组织，接。
22、种于与愈伤组织诱导相同的培养基中，温度为25，暗培3周，期间更换培养基2次，挑选优选质地松散、颜色黄白、表面湿润的颗粒状愈伤组织，生长良好的愈伤组织培养形成细胞悬浮培养体系具体工艺为将筛选出的愈伤组织放入与愈伤组织诱导相同的液体培养基中，温度为25，转速为120R/MIN，暗培养12天，培养出悬浮单细胞系，用CO60R射线以不同辐射剂量4000R，7000R，10000R，15000R，20000R，25000R五个剂量进行辐射处理，筛选出24甲氧基苯氧基丙酸含量高的培养物，分离出原生质，近一步培养获得完整植株，从而获得遗传性稳定一致的突变咖啡种苗品种PK。该品种咖啡果实中的24甲氧基苯氧基丙。
23、酸平均含量达到0208，已达到工业化分离的经济要求。0039取PK品种的咖啡果外层果肉粉500KG，用85的乙醇回流提取2次，每次回流2H。滤去滤渣，提取液真空浓缩至无醇味；用80热水溶解后经乙酸乙酯萃取2次，所得水层再用水饱和的正丁醇萃取2次，合并萃取液，减压浓缩并干燥得粗提物；将其用80热水溶解，上D101型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积的水洗，再用3倍柱体积15的乙醇洗脱，弃去洗液，最后用3倍柱体积75的乙醇洗脱，收集75乙醇洗脱液，减压回收乙醇，喷雾干燥得24甲氧基苯氧基丙酸精提物38KG。精提物再在PH2，10的酸性条件重结晶3次，得到24甲氧基苯氧基丙酸结晶物25KG。全过程得率0。
24、5，终产品为白色粉末，纯度999。0040实施例30041采用原生质诱变育种24甲氧基苯氧基丙酸含量高的咖啡种苗。首先选择咖啡子叶作为外植体，诱导愈伤组织产生，具体工艺为子叶经过消毒，接种于添加10MOL/说明书CN102115770ACN102115772A5/7页7L2，4二氯苯氧乙酸作为生长素和05MOL/L6呋喃甲基腺嘌呤作为细胞分裂素的MS基础培养基以在培养基中的浓度计，MS基础培养基成分组成为单位MG/LKNO31900，NH4NO31650，K2HPO4170，MGSO47H2O370，CACL22H2O440，KI083，H3BO362，MNSO44H2O223，ZNSO47H。
25、2O86，NAMOO42H2O025，CUSO45H2O0025，COCL26H2O0025，NA2EDTA373，FESO47H2O278，蔗糖30000，肌醇100，盐酸05，盐酸吡哆醇05，盐酸硫胺素04，甘氨酸20上，温度为30，培养3周，产生愈伤组织，愈伤组织经过继代培养后具体工艺为优选生长良好，祛除发黄的愈伤组织，接种于与愈伤组织诱导相同的培养基中，温度为30，暗培2周，期间更换培养基1次，挑选优选质地松散、颜色黄白、表面湿润的颗粒状愈伤组织，生长良好的愈伤组织培养形成细胞悬浮培养体系具体工艺为将筛选出的愈伤组织放入与愈伤组织诱导相同的液体培养基中，温度为30，转速为120R/MI。
26、N，暗培养8天，培养出悬浮单细胞系，用CO60R射线以不同辐射剂量4000R，7000R，10000R，15000R，20000R，25000R五个剂量进行辐射处理，分离出原生质，近一步培养获得完整植株，从而获得遗传性稳定一致的突变咖啡种苗品种PK。该品种咖啡果实中的24甲氧基苯氧基丙酸平均含量达到0208，已达到工业化分离的经济要求。0042取PK品种的咖啡果内果皮粗粉500KG，用95的乙醇回流提取2次，每次回流15H。滤去滤渣，提取液真空浓缩至无醇味；用90热水溶解后经石油醚/乙酸乙酯11，V/V萃取3次，所得水层再用水饱和的正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压浓缩并干燥得粗提物；将其用90。
27、热水溶解，上XAD4型大孔吸附树脂柱，先用4倍柱体积的水洗，再用3倍柱体积30的乙醇洗脱，弃去洗液，再用3倍柱体积70的乙醇洗脱，收集70乙醇洗脱液，减压回收乙醇，喷雾干燥得24甲氧基苯氧基丙酸精提物19KG。精提物再在PH2，10的酸性条件重结晶2次，得到24甲氧基苯氧基丙酸结晶物13KG。全过程得率026，终产品为白色粉末，纯度999。0043试验例10044本发明分离的24甲氧基苯氧基丙酸对各种甜味物质的甜度抑制作用。选定20名味觉良好的受试者，试验用的甜味剂为蔗糖、结晶果糖、阿斯巴甜三种，浓度分别为20、10、01，不加提取物时的甜度均设为100。向上述试验样中加入不同量的提取物50、。
28、100、150、200MG/KG，混匀后，受试者品尝并得出各样品相当于参照样甜度的分数。用甜度分数的平均值来评定抑制效果，结果见表1。在品尝任意两个样品或参照样之间，都用蒸馏水漱口，以保证不被前一次残留的味感干扰。0045结论本发明24甲氧基苯氧基丙酸提取物对蔗糖、结晶果糖、阿斯巴甜均有很好的甜度抑制作用。用量为100MG/KG时，即可使上述甜味剂的甜度下降一半左右；用量为200MG/KG时，甜度基本消失。该提取物对甜味的抑制不仅具有广泛性和高效性，而且不会引入任何杂味。0046表124甲氧基苯氧基丙酸对各种甜物质的甜度抑制作用0047说明书CN102115770ACN102115772A6/。
29、7页80048甜味抑制剂不仅能降低甜度、增强风味，而且能使蔗糖充分发挥其功能特性，因此它们在含糖食品中的应用前景很广。24甲氧基苯氧基丙酸提取物作为一种优良的天然甜味抑制剂已成功应用于月饼、糖果、巧克力、冰淇淋等各类食品中，如表2所示。含本发明24甲氧基苯氧基丙酸提取物食品的典型配方见表3、表4、表5。其中24甲氧基苯氧基丙酸首先用4050倍质量的水溶解后，加入到各种配料中，按常规方法生产。0049表224甲氧基苯氧基丙酸在食品中的典型应用00500051表3含甜味抑制剂的纯莲蓉月饼馅配方00520053配料用量/00540055白莲蓉3580056砂糖4450057花生油1150058植物油。
30、82说明书CN102115770ACN102115772A7/7页9005924甲氧基苯氧基丙酸100MG/KG00600061表4含甜味抑制剂的柠檬味硬糖配方00620063配料用量/00640065白砂糖5160066淀粉糖浆3280067水1480068柠檬酸0650069柠檬黄色素0050070柠檬香精01007124甲氧基苯氧基丙酸80MG/KG00720073表5含甜味抑制剂的巧克力配方00740075配料可可巧克力/00760077可可浆430078白砂糖450079子仁浆30080可可奶油80081卵磷脂060082食用香精04008324甲氧基苯氧基丙酸50MG/KG0084说明书CN102115770A。