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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710351851.4 (22)申请日 2017.05.18 (71)申请人 舟山医院 地址 316000 浙江省舟山市定海区临城街 道定沈路739号 (72)发明人 竺王玉何松彬方可欣陈冬冬 (74)专利代理机构 宁波市鄞州甬致专利代理事 务所(普通合伙) 33228 代理人 王树镛 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称 无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法 (57)摘要 无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法， 其 特征有以下步骤。
2、： a.进行牙龈组织样本取样， 样 本为牙龈切除术的牙龈健康的患者， 年龄2062 岁， 对患者口腔进行局部麻醉， 清洗口腔， 用碘伏 全面消毒后， 做出切口标记线， 角形切口， 按标记 线切开后， 切除牙龈； 本发明的优点是： 最小化疾 病传播的风险。 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 CN 107287157 A 2017.10.24 CN 107287157 A 1.无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法， 其特征在于： a.进行牙龈组织样本取样， 样本为牙龈切除术的牙龈健康的患者， 年龄2062岁， 对患 者口腔进行局部麻醉， 清洗口腔， 用碘伏全面消毒后， 做出切口标记线， 角形切口。
3、， 按标记线 切开后， 切除牙龈， 将其置入10mL无菌1640 RPMI 培养液中， 进行充分的摇晃后静止， 送于 实验室培养； b.准备好材料： MesenGro无血清培养基、 MEM- 培养基、 RPMI1640培养基、 谷氨酰胺、 胰 蛋白酶、 胎牛血清、 鼠抗人CD3抗体， 丝裂霉素C、 地塞米松、 吲哚美辛、 IBMX、 胰岛素、 抗坏血 酸Vit C和 -甘油磷酸钠； c.获取健康成人的健康牙龈组织， 用RPMI 1640冲洗干净， 利用终浓度2 mg/mL 的 dispase消化812h后， 加终浓度4 mg/mL 的collagenase 在37温度下消化2 h， 获取 单个。
4、核细胞， 10%浓度的 FBS MEM- 培养基培养牙龈间充质干细胞， 当细胞长至80%90%融 合后， 用0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA 37消化2 min， 传代培养逐渐转移至MesenGro无血清 完全培养基中， 台盼蓝未染色细胞存活率95%； d.利用FACSCalibur流式细胞仪鉴定牙龈间充质干细胞表型， 包括HLA-DR、 CD29、 CD33、 CD34、 CD73、 CD105、 CD90、 CD86， 在生长良好的牙龈间充质干细胞中加入标准的含有含地塞 米松0.5 umol/L、 吲哚美辛100 mmol/L、 IBMX 0.5 mmol/L、 胰岛素10 mg/L。
5、、 10% FBS MEM- 培养基成分的成脂诱导剂， 在第21天进行油红O染色， 相差显微镜下观察脂肪小滴形成情 况； 加入含有含抗坏血酸Vit C50 ug/mL， 地塞米松107 mol/L， -甘油磷酸钠10 mmol/L、 10% FBS MEM- 培养基的矿化诱导液， 第21天用0.1 %茜红染色， 相差显微镜下观察矿化结 节形成情况； e.先用紫外光照射96孔酶标板， 对96孔酶标板进行杀菌处理， 取对数生长期的10% FBS MEM- 、 MesenGro无血清培养的GMSCs以103 cells/孔接种于96孔板内， 每孔0.1 mL， 24 h、 48 h、 72 h、 9。
6、6 h、 108 h后， 每孔加入10 L CCK8， 继续培养2 h后， 酶标仪波长450 nm处检 测吸光度 （A） 值， 实验重复3次； f.将第3代10%FBS MEM- 、 MesenGro无血清培养GMSCs接种于96孔板， 培养24小时， 第2 日取新鲜外周血10 mL， 利用密度1.0770.001 g/mL的淋巴细胞分离液， 分离获得单个核 细胞2107， 将细胞重悬于10% FBS RPMI 1640培养基， 将贴壁的GMSCs与PBMC按梯度比例 共培养， 梯度比例分别为GMSCs： PBMC为1:1、 1:5、 1:25、 1:50、 1:100、 1:200， 经过 。
7、mitomycin处理的APC细胞和人CD3抗体刺激3 d后， 将悬浮的PBMC转移至新的96孔培养板 中， 细胞悬液加入10 L CCK-8， 继续培养2 h后， 450 nm波长下测量OD值确定增殖后的PBMC 量， 并计算GMSCs对PBMC增殖的抑制率， 抑制率= （对照组-实验组） /对照组100%。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107287157 A 2 无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法 技术领域 0001 本发明涉及无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法， 属于细胞培养技术领域。 背景技术 0002 2009年Zhang等从人牙龈组织中分离培养出一种新牙龈来源的间充质干细胞之。
8、 后， 多项研究发现， 该细胞具有间充质干细胞的基本特性， 并且生长迅速、 均一、 无致瘤性， 经多次传代后仍保持有间充质干细胞的表型及端粒酶活性， 优于骨髓来源间充质干细胞。 GMSCs不仅在再生医学发挥作用， 而且已成为细胞免疫治疗的种子细胞， 然而， 目前用于 GMSCs培养基多为胎牛血清作为营养来源， 若将其应用于人体， 存在较大风险， 如阮病毒感 染， 人体内抗牛血清蛋白的产生等， 因此， 迫切需要应用无血清培养基培养齿龈间充质干细 胞， 并保持干细胞分化及免疫调节功能， 最小化疾病传播的风险。 0003 新型内容 本发明的目的是提供无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法。 0004 本。
9、发明要解决的问题是目前用于GMSCs培养基多为胎牛血清作为营养来源， 若将 其应用于人体， 存在较大风险的问题。 0005 为实现本发明的目的， 本发明采用的技术方案是： 无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法， 其特征有以下步骤： a.进行牙龈组织样本取样， 样本为牙龈切除术的牙龈健康的患者， 年龄2062岁， 对患 者口腔进行局部麻醉， 清洗口腔， 用碘伏全面消毒后， 做出切口标记线， 角形切口， 按标记线 切开后， 切除牙龈， 将其置入10mL无菌1640 RPMI 培养液中， 进行充分的摇晃后静止， 送于 实验室培养； b.准备好材料： MesenGro无血清培养基、 MEM- 培养基、 。
10、RPMI1640培养基、 谷氨酰胺、 胰 蛋白酶、 胎牛血清、 鼠抗人CD3抗体， 丝裂霉素C、 地塞米松、 吲哚美辛、 IBMX、 胰岛素、 抗坏血 酸Vit C和 -甘油磷酸钠。 0006 获取健康成人的健康牙龈组织， 用RPMI 1640冲洗干净， 利用终浓度2 mg/mL 的 dispase消化812h后， 加终浓度4 mg/mL 的collagenase 在37温度下消化2 h， 获取 单个核细胞， 10%浓度的 FBS MEM- 培养基培养牙龈间充质干细胞， 当细胞长至80%90%融 合后， 用0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA 37消化2 min， 传代培养逐渐转移至Mese。
11、nGro无血清 完全培养基中， 台盼蓝未染色细胞存活率95%； d.利用FACSCalibur流式细胞仪鉴定牙龈间充质干细胞表型， 包括HLA-DR、 CD29、 CD33、 CD34、 CD73、 CD105、 CD90、 CD86， 在生长良好的牙龈间充质干细胞中加入标准的含有含地塞 米松0.5 umol/L、 吲哚美辛100 mmol/L、 IBMX 0.5 mmol/L、 胰岛素10 mg/L、 10% FBS MEM- 培养基成分的成脂诱导剂， 在第21天进行油红O染色， 相差显微镜下观察脂肪小滴形成情 况； 加入含有含抗坏血酸Vit C50 ug/mL， 地塞米松107 mol/L。
12、， -甘油磷酸钠10 mmol/L、 10% FBS MEM- 培养基的矿化诱导液， 第21天用0.1 %茜红染色， 相差显微镜下观察矿化结 节形成情况。 说明书 1/3 页 3 CN 107287157 A 3 0007 先用紫外光照射96孔酶标板， 对96孔酶标板进行杀菌处理， 取对数生长期的10% FBS MEM- 、 MesenGro无血清培养的GMSCs以103 cells/孔接种于96孔板内， 每孔0.1 mL， 24 h、 48 h、 72 h、 96 h、 108 h后， 每孔加入10 L CCK8， 继续培养2 h后， 酶标仪波长450 nm处 检测吸光度 （A） 值， 实验。
13、重复3次； f.将第3代10%FBS MEM- 、 MesenGro无血清培养GMSCs接种于96孔板， 培养24小时， 第2 日取新鲜外周血10 mL， 利用密度1.0770.001 g/mL的淋巴细胞分离液， 分离获得单个核 细胞2107， 将细胞重悬于10% FBS RPMI 1640培养基， 将贴壁的GMSCs与PBMC按梯度比例 共培养， 梯度比例分别为GMSCs： PBMC为1:1、 1:5、 1:25、 1:50、 1:100、 1:200， 经过 mitomycin处理的APC细胞和人CD3抗体刺激3 d后， 将悬浮的PBMC转移至新的96孔培养板 中， 细胞悬液加入10 L 。
14、CCK-8， 继续培养2 h后， 450 nm波长下测量OD值确定增殖后的PBMC 量， 并计算GMSCs对PBMC增殖的抑制率， 抑制率= （对照组-实验组） /对照组100%。 0008 本发明的优点是： 应用无血清或10% FBS培养GMSC在形态上并无明显区别， 均呈梭 形， 鱼群样生长， 有明显的漩涡状， 具有克隆形成能力， 流式细胞仪对间充质干细胞的表面 标志物检测显示， 与10%FBS培养GMSC一致， 无血清培养GMSC高表达CD29、 CD73、 CD90、 CD105， 而不表达CD33、 CD34、 CD86、 HLA-DR， 该细胞为非造血干细胞来源， 与间充质干细胞的。
15、表型一 致， 无血清培养GMSC成脂和成骨能力均与10%FBS培养GMSC相似， 可见， 无血清培养GMSC符合 间充质干细胞的鉴定标准， 并与10%FBS培养GMSC在形状、 表型、 诱导分化能力等方面一致， 可用于GMSC培养。 具体实施方式 0009 下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。 0010 图1为第3代牙龈间充质干细胞形态； 图2为第3代10% FBS或无血清培养牙龈间充质干细胞流式表型； 图3为第3代10% FBS或无血清培养牙龈间充质干细胞增殖情况， aP0.05 本发明无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法， 其特征有以下步骤： a.进行牙龈组织样本取样， 样本为牙龈切。
16、除术的牙龈健康的患者， 年龄2062岁， 对患 者口腔进行局部麻醉， 清洗口腔， 用碘伏全面消毒后， 做出切口标记线， 角形切口， 按标记线 切开后， 切除牙龈， 将其置入10mL无菌1640 RPMI 培养液中， 进行充分的摇晃后静止， 送于 实验室培养； b.准备好材料： MesenGro无血清培养基、 MEM- 培养基、 RPMI1640培养基、 谷氨酰胺、 胰 蛋白酶、 胎牛血清、 鼠抗人CD3抗体， 丝裂霉素C、 地塞米松、 吲哚美辛、 IBMX、 胰岛素、 抗坏血 酸Vit C和 -甘油磷酸钠。 0011 获取健康成人的健康牙龈组织， 用RPMI 1640冲洗干净， 利用终浓度2 。
17、mg/mL 的 dispase消化812h后， 加终浓度4 mg/mL 的collagenase 在37温度下消化2 h， 获取 单个核细胞， 10%浓度的 FBS MEM- 培养基培养牙龈间充质干细胞， 当细胞长至80%90%融 合后， 用0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA 37消化2 min， 传代培养逐渐转移至MesenGro无血清 完全培养基中， 台盼蓝未染色细胞存活率95%； d.利用FACSCalibur流式细胞仪鉴定牙龈间充质干细胞表型， 包括HLA-DR、 CD29、 CD33、 CD34、 CD73、 CD105、 CD90、 CD86， 在生长良好的牙龈间充质干细胞中加。
18、入标准的含有含地塞 说明书 2/3 页 4 CN 107287157 A 4 米松0.5 umol/L、 吲哚美辛100 mmol/L、 IBMX 0.5 mmol/L、 胰岛素10 mg/L、 10% FBS MEM- 培养基成分的成脂诱导剂， 在第21天进行油红O染色， 相差显微镜下观察脂肪小滴形成情 况； 加入含有含抗坏血酸Vit C50 ug/mL， 地塞米松107 mol/L， -甘油磷酸钠10 mmol/L、 10% FBS MEM- 培养基的矿化诱导液， 第21天用0.1 %茜红染色， 相差显微镜下观察矿化结 节形成情况。 0012 先用紫外光照射96孔酶标板， 对96孔酶标板进。
19、行杀菌处理， 取对数生长期的10% FBS MEM- 、 MesenGro无血清培养的GMSCs以103 cells/孔接种于96孔板内， 每孔0.1 mL， 24 h、 48 h、 72 h、 96 h、 108 h后， 每孔加入10 L CCK8， 继续培养2 h后， 酶标仪波长450 nm处 检测吸光度 （A） 值， 实验重复3次； f.将第3代10%FBS MEM- 、 MesenGro无血清培养GMSCs接种于96孔板， 培养24小时， 第2 日取新鲜外周血10 mL， 利用密度1.0770.001 g/mL的淋巴细胞分离液， 分离获得单个核 细胞2107， 将细胞重悬于10% FB。
20、S RPMI 1640培养基， 将贴壁的GMSCs与PBMC按梯度比例 共培养， 梯度比例分别为GMSCs： PBMC为1:1、 1:5、 1:25、 1:50、 1:100、 1:200， 经过 mitomycin处理的APC细胞和人CD3抗体刺激3 d后， 将悬浮的PBMC转移至新的96孔培养板 中， 细胞悬液加入10 L CCK-8， 继续培养2 h后， 450 nm波长下测量OD值确定增殖后的PBMC 量， 并计算GMSCs对PBMC增殖的抑制率， 抑制率= （对照组-实验组） /对照组100%； 图3中， 无血清培养GMSCs增殖情况应用CCK-8分别检测第3代10%FBS或无血清培。
21、养 GMSCs 24 h、 48 h、 72 h、 96 h、 108 h增殖情况， 结果显示10%FBS与无血清培养GMSCs在24 h 和48 h比较两者增殖情况无明显区别， 差异位为P0.05， 无统计学意义， 但是72 h、 96 h、 108 h后10%FBS培养GMSCs增殖明显高于无血清培养GMSCs， 差异位P = 0.0033、 0.0125、 0.0133； 应用无血清或10% FBS培养GMSC在形态上并无明显区别， 均呈梭形， 鱼群样生长， 有明 显的漩涡状， 具有克隆形成能力， 流式细胞仪对间充质干细胞的表面标志物检测显示， 与 10%FBS培养GMSC一致， 无血清。
22、培养GMSC高表达CD29、 CD73、 CD90、 CD105， 而不表达CD33、 CD34、 CD86、 HLA-DR， 该细胞为非造血干细胞来源， 与间充质干细胞的表型一致， 无血清培养 GMSC成脂和成骨能力均与10%FBS培养GMSC相似， 可见， 无血清培养GMSC符合间充质干细胞 的鉴定标准， 并与10%FBS培养GMSC在形状、 表型、 诱导分化能力等方面一致， 可用于GMSC培 养。 说明书 3/3 页 5 CN 107287157 A 5 图1 说明书附图 1/3 页 6 CN 107287157 A 6 图2 说明书附图 2/3 页 7 CN 107287157 A 7 图3 说明书附图 3/3 页 8 CN 107287157 A 8 。