一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因及其抗低温应用 技术领域 本发明属分子生物学与基因工程领域，具体涉及一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋 白的基因克隆及其应用。
背景技术 干旱、盐渍和低温都能引起植物水分亏缺，在这期间植物细胞积累一系列的蛋 白质来保护细胞免受脱水伤害。 环境胁迫除了引起代谢变化和低分子量保护性化合物 的积累外，植物的许多基因可被激活转录，并导致植物营养组织中新蛋白的积累，特别 是植物干旱、低温诱导蛋白的研究已受到普遍关注，其中胚胎发育晚期丰富蛋白 (late embryogenesis abundantprotein， LEA) 是指胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白 质，其具有亲水性和热稳定性，广泛存在于高等植物中，且受发育阶段、脱落酸 (ABA) 和脱水信号的调节，因此成为当前在逆境研究方面的一个重要课题。
LEA 蛋白是一类亲水性大家族，共同特点是由极性氨基酸组成，为亲水性的多 肽，甘氨酸含量＞ 6％，亲水指数＞ 1.0，大多数 LEA 蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸残基。 根据 LEA 蛋白氨基酸序列同源性和特定的序列单元， LEA 蛋白被分为 6 组。 由于各组 LEA 蛋白序列和可能的蛋白质结构不同，每一组 LEA 蛋白在水分胁迫下有不同的功能。
LEA 蛋白表达受发育阶段控制，但它们也能在施加外源 ABA 的离体胚中表达， 许多营养组织在外源 ABA、渗透和低温胁迫的诱导下能产生特异的 LEA mRNA 和 LEA 蛋 白。 LEA 蛋白表达无组织特异性，可以在转录水平上被 ABA、高渗透浓度和水分胁迫所 诱导。 植物在受到干旱胁迫时， LEA 基因的高水平表达和 LEA 蛋白的大量积累，表明 LEA 具有干旱保护功能。 种子在自然成熟过程中发生自燃的干化作用，LEA 蛋白的作用 是保护种子细胞免受由干化引起的伤害，并且在部分种类耐受寒冷冻的生理作用中具有 重要意义。
LEA 蛋白最显著的物理化学特性是具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸 条件下也能保持水溶状态，同时可能形成一种离子载体为那些即将干化失水的组织细胞 中的离子凝结 / 结晶作好准备。 在干旱脱水过程中细胞液的离子浓度会迅速升高，高强 度的离子浓度会造成细胞的不可逆伤害。 第 3 组 LEA 蛋白中的 11 个氨基酸残基组成的 基元序列可形成兼性 a2 螺旋结构，提供一个具疏水条区的亲水表面，螺旋的疏水面可形 成同型二聚体，处在亲水表面的带电基团可鳌合细胞脱水过程中浓缩的离子，如 Na+ 和 PO3+。 此外，组成该蛋白的大多数氨基酸残基为碱性、亲水性氨基酸，无半胱氨酸和色 氨酸，这些高电荷的氨基酸残基可以重新定向细胞内的水分子，束缚盐离子，从而避免 干旱胁迫时细胞内高浓度离子的累积所引起的损伤，同时也可防止组织过度脱水。 目 前，在多种植物中都有关于第 3 组 LEA 蛋白或基因的研究报道，这些基因的表达或蛋白 累积与植物的渗透胁迫抗性呈正相关。 萌芽 3 天的大麦幼苗经 ABA 或干旱处理后，幼苗 的所有器官中均有高水平的 HVA1 mRNA 和蛋白质出现，它可被干旱等环境胁迫和 ABA 诱导表达。 Xu 等将 HVA1 cDNA 全序列导入水稻，获得了抗旱、抗盐的转基因水稻，从
而直接证实了第 3 组 LEA 基因可能具有干旱保护功能。
LEA 广泛存在于高等植物种子中，首先是在棉花中被发现，后来相继在大麦、 胡萝卜、小麦、大豆、番茄和向日葵植物中检测到此类蛋白。
在众多的研究中，并没有看到在多抗植物腊梅中有关 LEA 的相关报道，而腊梅 【Chimonanthus praecox】 作为一种具有多抗特性的物种，对外界环境的适应能力比较 强，并且腊梅耐旱、耐寒、病虫害较少，在腊梅中一定存在多抗基因。 发明人利用本实 验室构建的腊梅花 ESTs 序列，从腊梅花 cDNA 文库中克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因 (CpLEA3)。 构建了腊梅 LEA 基因的表达载体，使表达菌株表达该基因的编码蛋白，通 过低温胁迫后测菌落生物活性以及细胞膜通透性损伤情况，发现 CpLEA3 基因能提高菌 株的抗低温能力，因而本发明具有创新性。 发明内容
(1) 提供一种 DNA 序列，其编码一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因，命 名为 CpLEA3 ；(2) 提供 一种 利用基因 工程 方法得到 CpLEA3 编码 的蛋 白 ；(3) 提 供 CpLEA3 在菌株抗低温基因工程方面的应用。
本发明提供了 CpLEA3 基因，它具有如序列表中 SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列。 从 腊 梅 花 冠 cDNA 文 库 中， 利 用 PCR 方 法 筛 选 克 隆 出 CpLEA3 基 因 ：利 用 RNAiso Reagent( 购自大连 Takara 公司 ) 提取腊梅花冠总 RNA，按照 SMARTTM cDNA Library Construction Kit 合成腊梅花冠 cDNA 文库，随机挑取 1000 个文库克隆测序和生物 信息学分析，获得腊梅花 ESTs 序列。 从腊梅花 ESTs 序列中，发现编码 CpLEA3 的 cDNA 序列，根据此序列设计上下游引物，并以腊梅花 cDNA 文库为模板进行 PCR 扩增，克隆 出 CpLEA3 的全长基因。
CpLEA3 的基因由 288 个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架，为序列表中 的 SEQ IDNO ：1 序列。 开放读码框的起始密码子为 ATG，终止密码子为 TAG。
本 发 明 还 提 供 了 由 CpLEA3 基 因 序 列 编 码 的 蛋 白， 其 具 有 序 列 表 中 SEQ ID NO ：2 中 所 示 的 氨 基 酸 序 列， 是 含 有 95 个 氨 基 酸 残 基， 其 理 论 分 子 量 大 小 为 10.4129kDa，预测等电点为 9.98。 根据软件分析，CpLEA3 蛋白前 41 个左右氨基酸为叶 绿体运输肽，从第 4 个到第 25 个氨基酸为跨膜结构域，该蛋白为稳定蛋白。
重组原核表达载体含有 CpLEA3 基因，重组原核表达载体转化的宿主细胞为大 肠杆菌。
如实施例二所述，还可利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达 出具有生物活性的 CpLEA3 蛋白。
关于在菌株抗低温基因工程方面的应用 ：
CpLEA3 基因在菌株抗低温基因工程方面的应用，包括低温胁迫阳性克隆菌株和 空载菌株后观察菌株生物活性以及阳性克隆菌株和空载菌株细胞膜通透性。 通过低温胁 迫，阳性克隆菌株存活率比空载菌株高约 20％。 通过电导率测定，阳性克隆菌株细胞膜 损伤程度仅为空载菌株的 55％，阳性克隆菌株细胞膜遭到破坏的程度比空载菌株小，说 明 CpLEA3 基因能提高菌株的抗低温能力。
本发明的有益效果在于提供了一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因 (CpLEA3) 及蛋白，构建了原核表达载体，并将验证正确的原核表达载体转入 BL21 表达菌株中诱导 表达，通过低温胁迫后测菌落生物活性及菌株细胞膜通透性，分析 CpLEA3 基因可提高 菌株抗低温的能力。 附图说明
图 1 为以腊梅花冠 cDNA 为模板， PCR 扩增电泳图
其中 ：M ：marker 自上到下大小为 ：1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp1、2 ：目的条带
图 2 为 CpLEA3 原核表达载体的构建过程示意图
图 3 为 SDS-PAGE 原核表达全蛋白电泳图
其中 ：M ：Marker 从上至下为 97、66、43、31(kDa)
1、2 ：含有重组克隆质粒 pET-32a::CpLEA3 的 BL21 宿主菌全蛋白
CK ：含有空载体质粒 pET-32a 的 BL21 宿主菌全蛋白
图 4 为低温胁迫后菌株细胞活力平板菌落示意图
其中 ：pET32a ：空载菌株 ；pET32a-CpLEA3 ：转基因阳性克隆菌株
CK ：pET32a 和 pET32a-CpLEA3 未做低温胁迫处理
24h ：pET32a 和 pET32a-CpLEA3 在 -20℃胁迫处理 24h
48h ：pET32a 和 pET32a-CpLEA3 在 -20℃胁迫处理 48h
72h ：pET32a 和 pET32a-CpLEA3 在 -20℃胁迫处理 72h
图 5 为低温胁迫后菌株细胞活力曲线图
图 6 为 -20℃低温胁迫 60min 后菌株细胞膜通透性的差异示意图
其中 ：pET32a ：空载菌株 ；pET32a-CpLEA3 ：转基因阳性克隆菌株 具体实施方式
实施例一 ：克隆 CpLEA3 基因
1. 提取 RNA ：
取 500mg 腊梅花冠用 RNAiso Reagent 提取腊梅花总 RNA。
2. 构建 cDNA 文库 ：
取总 RNA，按照 SMARTTM cDNA Library Construction Kit 合成腊梅花 cDNA 文 库，随机挑取 1000 个文库克隆测序和生物信息学分析，获得腊梅花 ESTs 序列。
3.CpLEA3 基因片段的克隆 ：
根据腊梅花 ESTs 序列中找出的编码 CpLEA3 的 cDNA 序列，设计上下游引物， 并以腊梅花 cDNA 文库为模板进行 PCR 扩增。
特异性引物如下 ：
CpLEA3-P1 ：5’ -CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3’， 斜 体 碱 基 为 BamH I 酶切位点 ；
CpLEA3-P2 ：5’ -CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3’，斜体碱基为 Sac I 酶切位点。克隆 PCR 反应条件为 ：94 ℃预变性 3min ；94 ℃变性 50sec ；54 ℃退火 30sec ； 72℃延伸 1min，30 个循环 ；72℃延伸 10min。 扩增产物经 1％琼脂糖凝胶电泳检测，在 288bp 位置上有一特异性的条带 ( 图 1)。 按常规方法将片段克隆到 pMD18-T Vector( 购 自大连 Takara 公司 ) 中，并经上海生物工程公司进行测序。
CpLEA3 基因的序列分析
经测序该基因 cDNA 序列开放阅读框包含 288bp，含有一个完整的开放阅读框 架，为序列表中的 SEQ ID NO ：1 序列。 编码 95 个氨基酸，具有序列表中 SEQ ID NO ： 2 中所示的氨基酸序列，分子量大小为 10.41299kDa，预测等电点为 9.98，结果表明获得 了全长基因的 cDNA 序列。
利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 对该基因编码 的氨基酸进行保守区域分析，结果表明 ：该蛋白属胚胎发育晚期丰富蛋白 (LEA)。 对 CpLEA3 基因编码的氨基酸序列进行 BLAST，显示的几乎都为 LEA3 家族，与已确定功能 的其他物种氨基酸序列进行进化分析和同源性分析 ：CpLEA3 与柑橘 LEA 基因编码的氨 基酸进化距离最近。
利用 SOPMA 对 CpLEA3 进行二级结构预测，发现含有 61.11％的 α 螺旋 (h)， 6.32％的延伸链 (e)，31.58％的随机卷曲 (c)。 用 TMpred 软件对蛋白质结构进行分析， 预测该基因从第 4 个到第 25 个氨基酸为跨膜结构域。 根据 CHLOROP 软件分析 CpLEA3 前 41 个左右氨基酸为叶绿体运输肽，是稳定蛋白。 实施例二 ：CpLEA3 在菌株中的高效表达
1. 原核表达载体的构建 ：
为了表明 CpLEA3 基因的编码功能，将 CpLEA3 基因连接到 pET-32a(+) 的 Sac I 和 BamH I 位点之间，并转化大肠杆菌 BL21，获得高效表达。
设计并合成一对特异性引物 ：
5’ -CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3’，斜体碱基为 BamH I 酶切位 点；
5’ -CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3’， 斜 体 碱 基 为 Sac I 酶 切 位 点。
按分子克隆常规实验程序，用 PCR 的方法扩增出两端带有特定酶切位点的基 因编码序列，将基因和载体 pMD18-T( 购于上海鼎国生物公司 ) 连接，验证正确。 取 pMD18::CpLEA3 质粒和 pET-32a(+) 质粒 ( 购于上海鼎国生物公司 ) 分别用 BamHI、Sac I 双酶切、再连接 ( 构建过程见图 2)，将连接产物转化大肠杆菌 BL21 菌株 ( 购于凯基生 物公司 ) 中，并用含 100ug/ml Amp 的 LB 培养基筛选重组子。 经质粒酶切鉴定和 PCR 鉴 定后，将连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的 DNA 序列的阅读框架是正确的。 将构建成带有 CpLEA3 基因的表达载体，命名 pET-32a::CpLEA3，用于诱导表达分析。
2. 原核表达 ：
将含有 pET-32a::CpLEA3 重组子的菌株，接种于 LB 培养基 (1L ：蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCL10 克 )，37℃培养至菌液 OD600 ＝ 0.4-0.6。 将 BL21 重组表达菌 株研磨及超声破碎，我们得到了含有重组克隆质粒 pET-32a::CpLEA3 的 BL21 宿主菌粗酶 液。 进行 12％ SDS-PAGE 电泳检测，从图 3 中可以看出， CpLEA3 基因在 BL21 菌株中
高效表达。
实施例三 ：低温胁迫后菌株细胞活力测定
分别取阳性克隆和转空载体菌株的单菌落于 5mL 含 100μg/mL Amp 的 LB 液体 培养基中，37℃、200r/min 振荡培养至 OD600 为 0.5，加入 IPTG 至终浓度 1mmol/L，继 续培养 3h。 分别分成 2 份，第 1 份稀释 10000 倍后涂于含 100μg/mL Amp 的 LB 培养 基上，在 37℃培养过夜 ；第 2 份分别吸取 1mL 在 -20℃进行 24h、48h 和 72h 低温胁迫处 理，处理后分别稀释 10000 倍后涂于含 100μg/mL Amp 的 LB 培养基上，37℃培养过夜。 分别在次日统计菌落数 ( 如图 4)，以胁迫后生长的菌落数与未胁迫对照组比值来计算存 活率 ( 如图 5)。
存活率＝ ( 胁迫后生长的菌落数 / 未胁迫对照组生长的菌落数 )×100％
结果表明 ：低温胁迫下阳性克隆菌株存活率明显高于空载菌株，24h 后阳性克 隆菌株存活率比空载菌株高 21.19％，48h 后阳性克隆菌株存活率比空载菌株高 19.61％， 72h 后阳性克隆菌株存活率比空载菌株高 20.02％，说明 CpLEA3 基因能提高菌株的抗低 温能力。
实施例四 ：低温胁迫后菌株细胞膜通透性测定 采用电导率法测定，分别挑取阳性克隆和转空载体菌株的单菌落于 5mL 含 100μg/mL Amp 的 LB 液体培养基中，37 ℃、200r/min 振荡培养至 OD600 为 0.5，加入 IPTG 至终浓度 1mmol/L，继续培养 3h。 将诱导表达的阳性克隆和转空载体的菌体用去 离子水悬浮至 1*109du/mL，分别将其在 -20℃下处理 60min 后，取 10ml 菌体悬浮液离心 (4000g，10min)，上清液用于测定电导率 A。 菌体再用 10ml 去离子水悬浮，置于 100℃ 下煮 15min 后，离心 (4000g，10min)，上清液用于测定电导率 B。
相对电导率＝ ( 电导率 A/ 电导率 A+ 电导率 B)×100％
结果表明 ( 如图 6) ：低温胁迫下阳性克隆菌株电导率仅为空载菌株的 55％，说 明转 CpLEA3 基因阳性克隆菌株细胞膜遭到破坏的程度明显小于空载菌株，该基因可以 提高菌株的抗低温能力。
7CN 102010869 A CN 102010872 A序列 序列表表1/1 页SEQ ID NO.1 的序列 (i) 序列特征 ：(A) 长度 ：288bp ；(B) 类型 ：核苷酸 ；(C) 链性 ：单链。 (ii) 分子类型 ：核苷酸 (iii) 序列描述 ：SEQ ID NO. 1 ATGGCTCGCT CTCTGTTGAA GGCTAATCTT GCCGCTGCTA TCGCCGACGG CGTCTCCCTC 61 TCCATATCAA TGGCCAGGCG AGGTTTCTCA TCAGCAGCAC AAGGGAGAAG CAGGGTAGCA 121 A A AG C AG AG G AG A AG G T G A A G AT G G T G AT G AT G A A AG A A A GTGCTGATGC AAACTCTTGG 181 G T G C C C G AC C C C G T C AC C G G C TAC TAC C G A C C AG C A A AT C GTACCGCCGA TGTCGATGTG 241 GCCGAGCTGC GGGAGATGCT CTTAACCCAG AAATTCCGTA ACCACTGA SEQ ID NO.2 的序列 (i) 序列特征 ：(A) 长度 ：95 个氨基酸 ；(B) 类型 ：氨基酸 ；(C) 链性 ：单链。 (ii) 分子类型 ：多肽 (iii) 序列描述 ：SEQ ID NO.2 1 MARSLLKANL AAAIADGVSL 21 SISMARRGFS SAAQGRSRVA 41 KAEEKVKMVM MKESADANSW 61 VPDPVTGYYR PANRTADVDV 81 AELREMLLTQ KFRNH*