一种快速共价闭合环状 DNA 纯化试剂盒 技术领域 ：
本发明涉及一种快速共价闭合环状 DNA 纯化试剂盒。 背景技术 ：
质粒 DNA 是分子生物学研究几乎每天都要用到质粒 DNA， 也需要经常纯化质粒 DNA， 此外在基因治疗和基因疫苗领域， 随着越来越多的基因治疗药物和基因疫苗进入临床 试验和产业化阶段， 对质粒 DNA 的需求量也越来越大。由于临床用质粒 DNA 的质量标准跟 分子生物学研究用质粒 DNA 的要求不同， 小规模实验室纯化与工业级大规模纯化工艺也有 所差异， 因此一个好的质粒 DNA 纯化技术必须满足各个领域的不同需求。目前能达到此要 求的只有基于碱裂解质粒 DNA 纯化方法， 另一个方法煮沸法的使用主要集中在于分子生物 学研究领域。
一、 碱裂解法质粒 DNA( 共价闭合环状 DNA) 纯化技术 碱裂解法是 1979 年由 Birnboim & Doly 发明， 它的质粒粗提部分由四步操作组 成： 第一步， 细菌重悬。重悬液成份是 25mM Tris-Cl(pH 8.0)、 50mM 葡萄糖和 10mM EDTA。 其中 Tris-Cl 用于缓冲 pH 以稳定 DNA 结构 ； 葡萄糖用于保持渗透压和缓冲 pH， 防止基因组 DNA 过度断裂 ； EDTA 用于鰲合二价金属离子， 使细胞更易破碎， 也使 DNase 失活， 有利于保 持质粒 DNA 的完整性。第二步， 碱裂解。碱裂解液的成分是 1％ SDS 和 0.2M NaOH。SDS 和 NaOH 的第一个作用是使细胞裂解释放菌体内容物。NaOH 的第二个作用是使体系的 pH 保持 在 12.0-12.5 之间， 在此 pH 范围内， 基因组 DNA 不可逆变性而质粒 DNA 由于有特有的拓扑 超螺旋结构， 只发生可逆变性， 可以在下一步中和过程中自然复性 ； SDS 的第二个作用是溶 解蛋白质 ( 平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子 ) 和脂肪。第三步， 中和。中和液的成份 是 3M 醋酸钾 /2M 醋酸。它一方面中和 NaOH， 使质粒 DNA 复性而基因组 DNA 仍然保持单链状 态； 另一方面提高体系中的盐浓度， 使蛋白质、 基因组 DNA 和 RNA 发生盐析沉淀 ； 此外加入 的钾与 SDS 反应生成不溶的十二烷基硫酸钾 (PDS)， PDS 还与蛋白质和基因组 DNA 共沉淀。 所以中和反应后， 大部分蛋白质、 基因组 DNA 和 RNA 都以不溶物状态存在， 而大部分的质粒 DNA 由于分子量较小， 不形成任何沉淀， 而是以溶液状态存在。 第四步， 离心。 离心过程使第 三步形成的所有不溶物沉淀到管底， 上清为质粒 DNA 粗提液， 可以直接用于各种质粒精提 方法进行进一步的纯化处理。
碱裂解法的最大优点是技术成熟， 可以处理从 1mL 到 500mL 或更多的样品， 既适合 于小规模的科研使用， 又能用于工业级大规模生产临床用的质粒 DNA， 并且适用于大肠杆菌 的所有菌株。
其主要缺点是操作难以控制， 主要原因是使基因组 DNA 发生不可逆变性而环状质 粒 DNA 发生可逆变性的 pH 范围十分狭小， 在 12-12.5 之间。如果 pH 低于 12.0 则基因组 DNA 将不能充分变性， 就会污染质粒 DNA ； 如果 pH 高于 12.5， 则质粒 DNA 发生不可逆变性， 降低质粒 DNA 产量。为了将 pH 维持在此范围， 加入碱裂解液后必须迅速充分混匀， 但是在 碱裂解释放出细菌的基因组 DNA 后， 裂解液变得十分粘稠， 只有剧烈搅拌才能充分混匀， 而
剧烈搅拌又会使质粒 DNA 断裂成为线性 DNA， 跟基因组 DNA 一样发生不可逆变性而丢失， 降 低产量 ； 剧烈搅拌还会使大的基因组 DNA 断裂成小片段， 难以形成沉淀， 最后污染质粒 DNA。 所以碱裂解法纯化质粒 DNA 的操作十分难以优化， 对工业级大规模 (10 升以上 ) 处理更是 如此。
碱裂解法的另一缺点是大规模处理时不容易去除 RNA 污染。研究用小规模质粒 DNA 纯化时可以使用动物源性的 RNase， 但是在工业级大规模 (10 升以上规模 ) 纯化临床用 质粒 DNA 时， 大规模使用动物源性的 RNase 不现实， 因为不但价格十分昂贵， 而且还容易引 入动物的病毒和其他病原 ( 如疯牛病病毒 )， 增加很多的质量检测方面的麻烦， 使成本急剧 上升。目前一般采取非酶的办法去除 RNA， 但还是需要增加了很多操作步骤， 增加了成本。
碱裂解法的第三个缺点是步骤多， 质粒 DNA 损失多， 最终回收率只有 50-70 ％左 右。
二、 煮沸法质粒 DNA 纯化技术
本方法最早由 Holmes 和 Quigley 在 1981 年报道， 其过程是先将细菌悬浮于含有 TritonX-100 和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中， 然后加热到 100℃使其裂解。加热除了 破坏细胞外壁， 还有助于解开 DNA 链的碱基配对， 并使蛋白质和染色体 DNA 变性。由于环状 质粒 DNA 有互相缠绕的拓扑结构， 当温度下降后， 闭环 DNA 的碱基又各就各位， 形成超螺旋 分子。离心除去变性的染色体 DNA 和蛋白质沉淀， 就可得到含有质粒 DNA 的上清液。煮沸 裂解法对于小于 15kb 的小质粒很有效， 可用于从 1mL-250mL 菌液中纯化质粒 DNA， 并且对大 多数的大肠杆菌菌株都适用。
其缺点是 ： (1) 不适用于那些经变性剂、 溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化 合物的大肠杆菌菌株。大肠杆菌菌株 HB101 及其衍生菌株 ( 其中包括 TG1) 能产生大量的 碳水化合物， 不适于用煮沸法裂解。(2) 对于表达 DNase 的大肠杆菌菌株， 也不推荐使用煮 沸法纯化质粒 DNA。因为在煮沸过程中， DNase 不会完全失活， 而在后面的操作步骤中难免 2+ 有 Mg 存在 ( 如限制性内切核酸酶的酶切过程 )， 质粒 DNA 会降解。(3) 大规模提取时， 细 菌裂解液太黏稠， 难以处理， 培养细菌时必须在培养基中加入氯霉素。 目前本方法主要是分 子生物学研究领域使用， 很少用于工业级大规模质粒 DNA 纯化。
三、 Eppendorf 一步法质粒 DNA 纯化技术
最近德国 Eppendorf 公司发明了一种基于溶菌酶裂解细菌的一步法质粒 DNA 纯 化技术， 它是一种快速、 非有机的从细菌中提取高质量质粒 DNA 专利技术， 其详细的技术资 料 ( 包括专利申请 ) 现在还没公开发表。但根据其公开发表的宣传资料， 该方法使用含有 溶菌酶和去污剂的单一的裂解液裂解细胞， 裂解产物澄清无粘性， 使操作非常容易。 裂解之 后 DNA 直接结合到过滤膜上。通过快速离心的清洗和洗脱得到超螺旋的质粒 DNA。其优点 是操作步骤简单、 需要的溶液数量很少， 所用的时间不到碱裂解的一半， 但质粒 DNA 的质量 高， 能用于下游试验如测序、 酶切和克隆。该方法的缺点是不适用于所有菌株。
该方法与本发明一步式质粒 DNA 纯化技术相比， 操作过程十分相似， 最大的不同 是 Eppendorf 方法需要使用动物源性的溶菌酶裂解细菌， 需要使用动物源性的 RNase 去 除 RNA， 由于上述的价格和可能引入病原等因素， 这种方法显然难以用到工业级大规模质粒 DNA 纯化上去。其次， Eppendorf 方法使用的是基于溶菌酶的温和裂解方法， 裂解细菌效果 肯定不如本发明使用的含异硫氰酸胍和 SDS 的化学裂解液， 质粒 DNA 回收率也不会很高。 此外温和裂解液对 DNase 的抑制很弱， 不能有效防止其对质粒 DNA 的破坏， 不适于 EndA 野生 型菌株。 发明内容 ：
本发明的目的是为了克服上述技术不足， 提供了一种使用的非碱性裂解液就是在 上述配方的基础上增加了六氨合高钴和精胺两种成份， 采用改良的非碱裂解液裂解细菌、 通过多胺选择性地使线状的基因组 DNA 和 RNA 发生高度浓缩而丧失与硅胶膜结合的能力， 而环状质粒 DNA 不发生浓缩， 仍然能够与硅胶膜结合， 经过洗涤和洗脱就可以达到一步纯 化质粒 DNA 的目的一种快速共价闭合环状 DNA 纯化试剂盒。
本发明的目的是由以下技术方案实现的 ：
一种快速共价闭合环状 DNA 纯化试剂盒， 其特征在于 ： 它是由下述步骤和方法完 成的， 具体步骤方法如下，
共价闭合环状 DNA 纯化技术步骤如下 ：
第一步 ： 细菌沉淀， 由于细菌体积在 10-50L， 主要用过滤法收集细菌沉淀， 去掉液 体培养基， 得到菌体 ； 第二步 ： 非碱裂解， 用非碱裂解液裂解细菌， 其间需要使用大型搅拌器进行充分搅 拌， 使细菌裂解， 同时多胺使基因组 DNA 和 RNA 发生高度浓缩而失去与硅胶膜结合的能力， 我们对非碱裂解液配方进行了优化， 增加了精胺和六氨合高钴两种成份 ；
第三步 ： 硅胶膜结合环状 DNA， 使用上步所得裂解液直接上柱， 裂解液直接用硅胶 吸附法进行质粒 DNA 纯化， 除质粒 DNA 外， 蛋白质和呈紧密团状的基因组 DNA 和 RNA 都将不 能与硅胶膜结合而进入穿透液 ；
第四步 ： 洗柱， 洗去硅胶膜上残留的蛋白质、 部分 RNA 和小分子杂质， 用常规的洗 柱液洗柱， 为尽量去除杂质， 可能需要多次重复此步骤 ；
第五步 ： 洗脱， 用低盐溶液将质粒 DNA 从硅胶膜上洗脱下来待用 ； 用低盐的溶液 “如 TE 或超纯水” 将硅胶膜结合的质粒 DNA 洗脱，
共价闭合环状 DNA 纯化技术方法如下 ：
1) 细菌沉淀， 菌体收集 ： 用塑料离心管收集不超过 3mL 过夜培养饱和菌液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃上清 ；
2) 非碱裂解， 裂解菌体 ： 加入 0.6-1mL 裂解液 “用前需摇匀” ， 充分吹打或振荡裂解 细菌直到裂解变澄清， 通常需要半分钟 ； 菌液离心后加入六氨合高钴和精胺， 六氨合高钴的 终浓度为 25mM， 精胺的终浓度为 75mM ；
3) 硅胶膜结合环状 DNA， 结合 DNA ： 将裂解液全部转移到离心吸附柱中， 室温静置 2 分钟使质粒 DNA 与膜结合， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液， 如果一次不能将上 清全部转移到离心吸附柱中， 分两次进行 ；
4) 洗柱， 预洗 ： 在离心吸附柱中加入 0.7mL 的预洗液， 室温 12000-15000g 离心半 分钟， 弃穿透液， 如果预洗液放置在低温产生了沉淀， 用前需要加热到 60℃使之融化， 混匀 后再用 ；
5) 洗脱， 再预洗 ： 再在离心吸附柱中加入 0.3mL 的预洗液， 室温 12000-15000g 离 心半分钟， 弃穿透液， 此步预洗最好别省略， 否则 DNA 纯度不高 ；
清洗 ： 在离心吸附柱中加入 0.7mL 的洗柱液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液 ； 再清洗 ： 再在离心吸附柱中加入 0.3mL 的洗柱液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 甩干残留液体 ；
洗脱 ： 将离心柱置于一个新的 1.5mL 自备塑料离心管中， 加入 30-100uL DNA 洗脱 液， 室温放置 2 分钟， 如果将 DNA 洗脱液预热到 65-80℃， 既得本发明一种快速共价闭合环状 DNA 纯化试剂盒 ； 所述的
裂解液 ： 为 10％ SDS+2M NaCl+10mM 精胺 ；
预洗液 ： 为 2M NaCl ；
洗柱液 ： 为 50％乙醇 ；
洗脱液 ： 为水 ；
多胺 ： 为精胺∶六氨合高钴＝ 3 ∶ 1
本发明技术使用的非碱性裂解液就是在上述配方的基础上增加多胺和 Triton X-114 两种成份而得， 但是经过多胺浓缩后， 线状 DNA 和 RNA 形成非常紧密的结构， 完全丧失 与硅胶膜结合的能力， 而环状的质粒 DNA 仍然保持比较松散的构型， 仍然能够与硅胶膜结 合， 所以通过硅胶膜对质粒 DNA 的差异吸附就可以从含有基因组 DNA、 RNA 和质粒 DNA 的混 合液中清除其中的基因组 DNA 和 RNA， 达到质粒 DNA 纯化的目的。
本发明的有益效果 ：
本发明用一步式质粒 DNA 纯化工艺代替两步式质粒 DNA 纯化工艺， 可以直接使用 单菌落进行质粒 DNA 纯化， 不需要过夜培养细菌， 完全省略了质粒粗提步骤， 本发明发现到 一定比例的六氨合高钴 / 精胺在异硫氰酸胍存在的条件下， 完全可以选择性地诱导线状 DNA 和 RNA 的浓缩， 而环状 DNA 仍然呈松弛构型， 说明该过程不受异硫氰酸胍的影响， 在此发 现的基础上， 我们对非碱裂解液配方进行了优化， 增加了精胺和六氨合高钴两种成份， 跟经 典的碱裂解液相比， 改良的、 含多胺的非碱裂解液有下列优点 ：
(1) 多胺使基因组 DNA 发生了高度浓缩， 极大地降低了裂解液的粘稠度， 使裂解液 不再粘稠， 便于后续进行各种处操作。
(2) 多胺使基因组 DNA 和 RNA 发生了高度浓缩， 不再与硅胶膜结合， 去除基因组合 DNA 和 RNA 十分容易。
(3) 不再需要碱变性和跟碱变性密切相关的重悬、 中和和离心三个步骤， 节约了 2/3 的操作时间。
(4)RNA 浓缩后去除， 不再需要 RNase 处理， 极大地降低了大规模纯化质粒 DNA 的成 本。
(5) 省略了碱变性处理， 使 DNA 避免了碱损伤， 质粒 DNA 质量更高。
本发明一步式质粒 DNA 纯化工艺跟传统的两步法工艺相比， 具有下列优点 ：
(1) 更加快捷， 使整个质粒 DNA 纯化操作时间缩短了 2/3， 节约人力和物力， 尤其适 合于高通量质粒 DNA 纯化和工业级大规模质粒 DNA 纯化。
(2) 步骤少， 所以质粒 DNA 损失也减少， 回收率提高， 因此可以用单个菌落直接进 行微量质粒 DNA 的纯化， 免去了过夜细菌培养步骤。
(3) 非碱裂解， 避免了质粒 DNA 的碱损伤， 超螺旋构型的比例更大， 质量提高。
(4) 不需要使用动物源性的 RNase， 减少了由此污染其他病源的可能， 同时还极大 地降低了成本 ( 尤其在工业级大规模纯化质粒 DNA 时， 大量使用 RNase 将十分昂贵 )。
(5) 对操作剧烈程度不敏感， 适合于从微量 ( 单菌落 ) 到工业级 (10 升以上 ) 的各 种规模的质粒 DNA 存在， 操作过程不需要做重大的改动。
(6) 普适性广， 不依赖于大肠杆菌的种类。
(7) 裂解液不粘稠， 不容易堵塞后续纯化时使用的层析柱。 附图说明 ：
图 1 是本发明的多胺浓缩 DNA 原理结构示意图 ；
图 2 是本发明的 DNA- 硅胶膜结合原理结构示意图 ；
图 3 是本发明的从一个含 pUC19 质粒的菌落提取质粒 DNA， 得到的 DNA 一半用于电 泳 ( 样品 A)， 另一半用 EcoRI 限制性内切酶线性化后再琼脂糖电泳 ( 样品 B) 示意图 ；
图 4 是本发明的用本方法从 1.5mL 含 pUC19 质粒的过夜培养的细菌样品中提取质 粒 DNA， DNA 最后用 200uL 洗脱液洗脱， 取 20uL 用于琼脂糖电泳， 前面的 DNA 为超螺旋构型， 后面的为开环构型示意图 ； 图 5 是本发明用本产品从 100mL 饱和菌液中提取 pUC19 质粒 DNA， 最后用 2mL 洗脱 液洗脱 DNA， 取 20uL 上样进行琼脂糖电泳， 前面的 DNA 为超螺旋构型， 后面的为开环构型示 意图 ；
具体实施方式 ： 下面结合实施例对本发明作进一步的描述 ：
实施例 1 ： 一种快速共价闭合环状 DNA 纯化试剂盒， 其特征在于 ： 它是由下述步骤 和方法完成的， 具体步骤方法如下，
共价闭合环状 DNA 纯化技术步骤如下 ：
第一步 ： 细菌沉淀， 由于细菌体积在 10-50L， 主要用过滤法收集细菌沉淀， 去掉液 体培养基， 得到菌体 ；
第二步 ： 非碱裂解， 用非碱裂解液裂解细菌， 其间需要使用大型搅拌器进行充分搅 拌， 使细菌裂解， 同时多胺使基因组 DNA 和 RNA 发生高度浓缩而失去与硅胶膜结合的能力， 我们对非碱裂解液配方进行了优化， 增加了精胺和六氨合高钴两种成份 ；
第三步 ： 硅胶膜结合环状 DNA， 使用上步所得裂解液直接上柱， 裂解液直接用硅胶 吸附法进行质粒 DNA 纯化， 除质粒 DNA 外， 蛋白质和呈紧密团状的基因组 DNA 和 RNA 都将不 能与硅胶膜结合而进入穿透液 ；
第四步 ： 洗柱， 洗去硅胶膜上残留的蛋白质、 部分 RNA 和小分子杂质， 用常规的洗 柱液洗柱， 为尽量去除杂质， 可能需要多次重复此步骤 ；
第五步 ： 洗脱， 用低盐溶液将质粒 DNA 从硅胶膜上洗脱下来待用 ； 用低盐的溶液 “如 TE 或超纯水” 将硅胶膜结合的质粒 DNA 洗脱，
共价闭合环状 DNA 纯化技术方法如下 ：
1) 细菌沉淀， 菌体收集 ： 用塑料离心管收集不超过 3mL 过夜培养饱和菌液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃上清 ；
2) 非碱裂解， 裂解菌体 ： 加入 0.6-1mL 裂解液 “用前需摇匀” ， 充分吹打或振荡裂解 细菌直到裂解变澄清， 通常需要半分钟 ； 菌液离心后加入六氨合高钴和精胺， 六氨合高钴的
终浓度为 25mM， 精胺的终浓度为 75mM ；
3) 硅胶膜结合环状 DNA， 结合 DNA ： 将裂解液全部转移到离心吸附柱中， 室温静置 2 分钟使质粒 DNA 与膜结合， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液， 如果一次不能将上 清全部转移到离心吸附柱中， 分两次进行 ；
4) 洗柱， 预洗 ： 在离心吸附柱中加入 0.7mL 的预洗液， 室温 12000-15000g 离心半 分钟， 弃穿透液， 如果预洗液放置在低温产生了沉淀， 用前需要加热到 60℃使之融化， 混匀 后再用 ；
5) 洗脱， 再预洗 ： 再在离心吸附柱中加入 0.3mL 的预洗液， 室温 12000-15000g 离 心半分钟， 弃穿透液， 此步预洗最好别省略， 否则 DNA 纯度不高 ；
清洗 ： 在离心吸附柱中加入 0.7mL 的洗柱液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿 透液 ；
再清洗 ： 再在离心吸附柱中加入 0.3mL 的洗柱液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 甩干残留液体 ；
洗脱 ： 将离心柱置于一个新的 1.5mL 自备塑料离心管中， 加入 30-100uL DNA 洗脱 液， 室温放置 2 分钟， 如果将 DNA 洗脱液预热到 65-80℃， 既得本发明一种快速共价闭合环状 DNA 纯化试剂盒 ； 所述的
裂解液 ： 为 10％ SDS+2M NaCl+10mM 精胺 ；
预洗液 ： 为 2M NaCl ；
洗柱液 ： 为 50％乙醇 ；
洗脱液 ： 为水 ；
多胺 ： 为精胺∶六氨合高钴＝ 3 ∶ 1
1) 质粒 DNA 提取 ：
质粒 DNA 纯化是进行分子生物学研究、 生产基因治疗药物和生产基因疫苗等必不 可少的技术。 质粒 DNA 只占宿主细菌总重量的 1％以下， 所以质粒纯化的本质就是去除占总 重量 99％的杂质， 包括基因组 DNA、 RNA、 蛋白质、 内毒素等。由于基因组 DNA 与质粒 DNA 同 质性太强 ( 都是双链 DNA， 只是构型不同 )， 最难去除， 如何有效去除基因组 DNA 的污染一直 是质粒 DNA 纯化的难点和关键， 目前通用的碱裂解法和其他方法都就是利用两者构型差异 而将其分离， 达到纯化质粒 DNA 的目的。
本发明一步式质粒 DNA 纯化技术也是利用基因组 DNA 与质粒 DNA 的构型差异， 但 使用的方法未见报道， 属于原创性技术。 其过程是用改良的非碱裂解液裂解细菌、 通过多胺 选择性地使线状的基因组 DNA 和 RNA 发生高度浓缩而丧失与硅胶膜结合的能力， 而环状质 粒 DNA 不发生浓缩， 仍然能够与硅胶膜结合， 经过洗涤和洗脱就可以达到一步纯化质粒 DNA 的目的。上述纯化整个过程在分子水平上实际上是由三个独立的反应组成， 分别是非碱性 细菌裂解、 多胺浓缩线状 DNA 和 RNA 和硅胶膜 -DNA 结合， 它们所起的作用可以用细胞内各 种分子的变化概括如下 ：
一、 非碱性细菌裂解原理
非碱性细菌裂解技术最早由 Piotr Chomczynski 和 Nicoletta Sacchi 在 1979 年 报道， 用于 RNA 提取。这种非碱性细菌裂解液不单用于裂解细菌， 还用于裂解动物和植物的 组织细胞 ( 当然需要在匀浆条件下进行 )， 其主要成份是 SDS、 异硫氰酸胍、 2- 巯基乙醇和 EDTA。 由于不含强碱， 故不会损伤 DNA。 本发明技术使用的非碱性裂解液就是在上述配方的 基础上增加多胺和 Triton X-114 两种成份而得， 各成份的作用如下 ：
1、 SDS 为强阴离子去污剂， 它利用双亲性溶解细菌细胞膜， 使细菌裂解。SDS 还能 使蛋白质 ( 包括 DNase 和 RNase) 变性并溶解， 有利于减少 DNA 的酶解， 保持其完整性。蛋 白质呈溶解状态也有利于在后续硅胶膜吸附时被清除。
2、 异硫氰酸胍是一种强的蛋白质变性剂， 不但能使膜蛋白变性而破坏细胞膜， 进 而使细菌裂解， 还能使蛋白质以溶液状态存在于裂解液中， 在后续的硅胶膜离心吸附分离 时被去除。在 2- 巯基乙醇存在时， 异硫氰酸胍变性蛋白质的效果更佳。使用异硫氰酸胍的 另一重要原因是它能促进 DNA- 硅胶膜的结合， 所以含异硫氰酸胍的细菌裂解物可以直接 用硅胶膜离心吸附方法纯化其中的 DNA。
3、 2- 巯基乙醇是一种还原剂， 它破坏天然蛋白质中的 S-S 键， 使蛋白质 ( 包括 DNase 和 RNase) 失去活性， 保证提取过程中 DNA 和 RNA 的完整性。它对异硫氰酸胍的蛋白 质变性和溶解能力还有增强作用。
4、 EDTA 可以鰲合细胞膜上的 Mg2+、 Ca2+ 等二价金属离子， 使细胞更易裂解， 并由此 2+ 间接抑制 DNase 活性 (DNase 需要 Mg 作为辅因子 )， 保持 DNA 的完整性。EDTA 的另一个非 常重要的作用就是它可以阻止 RNA 与硅胶膜结合， 免去了使用昂贵的 RNase 来去除 RNA 污 染。
5、 Triton X-114 是一种去污剂， 能专一性地与内毒素形成微小球而使之失去与硅 胶膜结合的能力， 容易在质粒 DNA 纯化时被清除。去除无内毒素是有重要用途 ( 如细胞转 化实验， 基因治疗和基因疫苗 ) 的质粒 DNA 必须达到的标准。
6、 多胺能使 DNA 和 RNA 浓缩， 其基本原理见下节。将多胺整合到细菌裂解液中是 本技术中的创新点之一， 将在创新部分详细说明。
二、 多胺浓缩 DNA 原理 ( 如图 1 所示 )
在水溶液中， DNA 和 RNA 分子呈酸性， 带负电， 而精胺、 亚精胺、 六氨合高钴等多胺 分子则带正电， 它们不仅能够与 DNA 分子的大沟进行嵌入式结合， 还能与 DNA 和 RNA 链上 的碱基和磷酸基进行链内结合和跨链结合， 最终使 DNA 和 RNA 分子发生 4-6 个数量级的高 度浓缩， 形成非常紧密的结构 (Arscott， Biopolymers 30， 619-630， 1990) 子的长度相关 (Hoopes， NAR9， 5493-5504， 1981 ； Murphy， Analytical Biochemistry 295， 143， 2。
多胺浓缩 DNA 和 RNA 的程度不但跟 DNA 和 RNA 分 001)， 并且跟多胺的种类和核酸的 构型 ( 线状或环状 ) 有关， 因此适当选择多胺的种类可以选择性地使不同构型的 DNA( 如基 因组 DNA 和质粒 DNA) 发生不同程度的浓缩 (Murphy， Analytical Biochemistry 295， 143， 2001)， 但 Murphy 的报道中使用的是不含高盐的温和裂解液， 并且在此条件下多胺浓缩 DNA 的构型选择性并不是很强。为了实现在含高浓度异硫氰酸胍 (2M 以上 ) 的裂解液中选择性 地浓缩线状 DNA 和 RNA， 天泽基因研究人员进行了近一年的摸索和研究， 终于首次发现在裂 解液中加入一定比例的六氨合高钴和精胺， 就可以实现线状 DNA 和 RNA 的选择性浓缩， 并使 其丧失与硅胶膜结合的能力， 而在同样的条件下环状的质粒 DNA 并不浓缩， 仍然可以与硅 胶膜结合。目前国内外文献都未有类似发现的报道， 所以本发现具有原创性。
三、 硅胶膜离心吸附柱纯化 DNA 原理 在水溶液中， DNA 分子呈酸性， 带负电 ； 硅胶膜表面的硅 - 氧键水化形成硅烷醇 基团 (silanol group) 也呈弱酸性， 带负电， 所以两者之间会产生静电排斥， 不能相互结 合。但是， 当溶液中同时存在一定浓度的阳离子时， 阳离子可以通过形成阳离子桥 (cation bridge) 而中和 DNA 和硅胶膜表面的负电荷 ( 即静电屏蔽 ) 并使二者结合。尽管如此， DNA 与硅胶膜结合的主要方式并不是阳离子桥， 而是 DNA 磷酸基团与硅胶膜表面硅烷醇基团之 间形成的氢键。阳离子桥的作用只是降低分子间静电排斥， 有利于两者接近并形成氢键而 已。虽然 DNA 与硅胶膜表面形成的每一对氢键结合力比较微弱， 但由于其数量巨大， 还是能 够使 DNA 牢固地吸附在硅胶膜表面。阳离子桥介导和氢键介导的 DNA- 硅胶膜结合如图 2 所示 ：
由于氢键在 DNA- 硅胶膜结合中起了重要作用， 所以凡是影响 DNA- 硅胶膜形成氢 键能力和数量的因素都能影响 DNA- 硅胶膜的结合强度， 这些因素包括结合液的盐浓度 ( 包 括异硫氰酸胍的浓度 )、 溶液的 pH 和 DNA 构型等。一般情况下， 呈线状构型的基因组 DNA 和 其他线状 DNA 两端游离， 受空间结构的阻碍小， 与硅胶膜表面形成氢键的数目最大， 结合最 牢固 ； 而呈环状构型的 DNA( 包括呈开环和超螺旋两种构型的质粒 DNA) 由于没有游离端， 受 空间结构紧密的限制， 与硅胶膜形成氢键的数目远少于同等长度的线状 DNA， 所以结合强度 也弱于同等长度的线状 DNA。
但是经过多胺浓缩后， 线状 DNA 和 RNA 形成非常紧密的结构， 完全丧失与硅胶膜结 合的能力， 而环状的质粒 DNA 仍然保持比较松散的构型， 仍然能够与硅胶膜结合， 所以通过 硅胶膜对质粒 DNA 的差异吸附就可以从含有基因组 DNA、 RNA 和质粒 DNA 的混合液中清除其 中的基因组 DNA 和 RNA， 达到质粒 DNA 纯化的目的。
主要技术与性能指标 ：
对用于分子生物学研究的质粒 DNA， 目前全世界都没有统一的质量标准， 本发明拟 执行德国著名的质粒 DNA 纯化产品开发商 Qiagen 公司的标准。
对用于基因治疗和基因疫苗的质粒 DNA， 本发明拟执行国家食品药品监督管理局
2003 年颁布的 《预防用 DNA 疫苗临床前研究技术指导原则》 和 《人基因治疗研究和制剂质 量控制技术指导原则》 中提出的标准。
一、 用于分子生物学研究的质粒 DNA 的技术标准 ：
检验项目 鉴别试验 质粒构型 质粒纯度 RNA 残留 gDNA 残留
检定方法 一种限制性内切酶后电泳 琼脂糖电泳 紫外分光光度计 琼脂糖电泳 琼脂糖电泳标准 跟预期结果一致 超螺旋或开环构型 OD260/280 ＝ 1.75-1.85 检不出 检不出二、 用于基因治疗和基因疫苗的质粒 DNA 的技术标准 ：检验项目 鉴别试验 质粒构型 质粒纯度 蛋白质污染 RNA 残留 gDNA 残留 无菌 内毒素残留 检定方法 三种以上限制性内切酶后电泳 琼脂糖电泳 紫外分光光度计 ELISA 或氨基酸分析法 琼脂糖电泳 Southern Blot UPS23 培养 LAL 测试 标准 跟预期结果一致 ＞ 90％为超螺旋构型 OD260/280 ＝ 1.75-1.85 ＜ 1ug/mg 检不出 ＜ 2ug/mg 无细菌生长 ＜ 10EU/mg技术创新、 工艺创新 ：
技术创新
本发明在国内外首次用多胺选择性地浓缩线状 DNA 和 RNA， 并使之丧失与硅胶膜 结合的能力。项目将一定比例的两种多胺 ( 精胺和六氨合高钴 ) 整合到非碱裂解液中并使 之发挥浓缩 DNA 的作用。一般认为， 多胺与 DNA 的结合是静电结合， 盐离子将通过中和 DNA 所带电荷而抑制多胺与 DNA 的结合， 也就是说体系中盐离子浓度越高， 多胺对 DNA 的浓缩 效率就越低。但是 Murphy 等人报道， 不同多胺对盐离子的敏感程度是不一样的， 并且在同
一条件下， 浓缩效果也受核酸分子的种类 (DNA 还是 RNA) 和构型 ( 线状还是环状 ) 的影响 (Murphy， Analytical Biochemistry 295， 143， 2001)。 根据这一线索， 本发明研究人员经过 精心摸索， 首次发现到一定比例的六氨合高钴 / 精胺在异硫氰酸胍存在的条件下， 完全可 以选择性地诱导线状 DNA 和 RNA 的浓缩， 而环状 DNA 仍然呈松弛构型， 说明该过程不受异硫 氰酸胍的影响。 在此发现的基础上， 我们对非碱裂解液配方进行了优化， 增加了精胺和六氨 合高钴两种成份。跟经典的碱裂解液相比， 改良的、 含多胺的非碱裂解液有下列优点 ：
(1) 多胺使基因组 DNA 发生了高度浓缩， 极大地降低了裂解液的粘稠度， 使裂解液 不再粘稠， 便于后续进行各种处操作。
(2) 多胺使基因组 DNA 和 RNA 发生了高度浓缩， 不再与硅胶膜结合， 去除基因组合 DNA 和 RNA 十分容易。
(3) 不再需要碱变性和跟碱变性密切相关的重悬、 中和和离心三个步骤， 节约了 2/3 的操作时间。
(4)RNA 浓缩后去除， 不再需要 RNase 处理， 极大地降低了大规模纯化质粒 DNA 的成 本。
(5) 省略了碱变性处理， 使 DNA 避免了碱损伤， 质粒 DNA 质量更高。
工艺创新
本发明用一步式质粒 DNA 纯化工艺代替两步式质粒 DNA 纯化工艺。自分子克隆技 术出现到现在的近三十年里， 人们使用的质粒 DNA 纯化技术都由质粒粗提和质粒精提两步 组成， 目前使用最广泛的质粒粗提法是碱裂解法， 传统使用最广泛的质粒精提方法是硅胶 膜吸附法， 两者结合纯化质粒 DNA 的主要步骤如下 ：
1. 细菌沉淀， 去除液体培养基。
2. 细菌重悬， 使碱裂液与细菌能够快速混匀， 避免极端 pH 的出现和避免剧烈振荡
3. 碱裂解， 用 SDS 和 NaOH 共同作用使细菌裂解， NaOH 还使基因组 DNA 发生不可逆 变性， 使质粒 DNA 发生可逆变性。
4. 中和， 用醋酸钾 / 醋酸中和 NaOH， 使质粒 DNA 复性而基因组 DNA 不能复性， 还使 蛋白质盐析， 使 SDS 生成不溶沉淀并与蛋白质和基因组 DNA 形成聚合物。
5. 离心， 使在中和过程形成的大分子不溶物 ( 包括基因组 DNA) 沉淀到离心管管底 而与上清中的质粒 DNA 分离。
6. 上清液中的质粒 DNA 与硅胶膜结合而残留的蛋白质、 RNA 和小分子杂质将不能 结合而进入穿透液。
7. 洗柱， 洗去硅胶膜上残留的蛋白质、 部分 RNA 和小分子杂质。
8. 洗脱， 用低盐溶液将质粒 DNA 从硅胶膜上洗脱下来待用。
本发明一步式质粒 DNA 纯化工艺革命性地完全省略了质粒粗提步骤， 直接用细胞 裂解物进行硅胶膜吸附纯化， 一步得到纯净的质粒 DNA， 其主要步骤如下 ：
本发明一步式质粒 DNA 纯化工艺与传统的两步法工艺相比， 具有下列优点 ：
(1) 更加快捷， 使整个质粒 DNA 纯化操作时间缩短了 2/3， 节约人力和物力， 尤其适 合于高通量质粒 DNA 纯化和工业级大规模质粒 DNA 纯化。
(2) 步骤少， 所以质粒 DNA 损失也减少， 回收率提高， 因此可以用单个菌落直接进 行微量质粒 DNA 的纯化， 免去了过夜细菌培养步骤。(3) 非碱裂解， 避免了质粒 DNA 的碱损伤， 超螺旋构型的比例更大， 质量提高。
(4) 不需要使用动物源性的 RNase， 减少了由此污染其他病源的可能， 同时还极大 地降低了成本 ( 尤其在工业级大规模纯化质粒 DNA 时， 大量使用 RNase 将十分昂贵 )。
(5) 对操作剧烈程度不敏感， 适合于从微量 ( 单菌落 ) 到工业级 (10 升以上 ) 的各 种规模的质粒 DNA 存在， 操作过程不需要做重大的改动。
(6) 普适性广， 不依赖于大肠杆菌的种类。
(7) 裂解液不粘稠， 不容易堵塞后续纯化时使用的层析柱。
研究内容及涉及的关键技术及技术指标描述
一、 对只需要小规模 ( 单菌落 -500mL 菌液 ) 质粒 DNA 纯化的分子生物学研究领域， 将本技术开发成一步式质粒 DNA 纯化试剂盒系列产品
1、 开发一步式质粒 DNA 微量 ( 单菌落 ) 提取试剂盒
本产品主要利用一步式用质粒 DNA 提取技术于从微量的样品 ( 如固体培养基上过 夜培养得到的单个菌落 ) 中提取质粒 DNA， 用于 PCR、 转化和有限次数的限制性内切酶分析， 判断有没有插入片段。使用本产品的好处是可以为研究人员节约一天的时间。目前使用的 碱变性质粒 DNA 纯化技术由于回收率有限， 因此必须先将单个菌落接种到液体培养基中培 养过夜， 才能得到足够多的细菌供质粒纯化使用， 目前市场上还没有直接用单个菌落提取 质粒 DNA 的类似产品， 属于空白。而一步式质粒 DNA 纯化技术回收率高， 所以可以直接使用 单菌落进行质粒 DNA 纯化， 不需要过夜培养细菌。本产品将填补此类产品的空白。
目前， 本产品已经成功用于含高拷贝质粒的单菌落， 但还没有用于含低拷贝和中 拷贝质粒的菌落样品， 但可以预见， 由于单菌落中的质粒 DNA 的绝对量很少， 非常容易与实 验过程中使用的器皿和硅胶膜吸附柱发生非特异性不可逆结合， 造成丢失， 影响产量。 因此 涉及到此产品开发的关键技术将是如何降低非特异吸附并提高产量。 准备采取的方法之一 是在裂解液中加入一定量的 poly r A 或酵母 tRNA 等非特异核酸， 它们通过自身与非特异 结合位点的结合而减少质粒 DNA 样品的非特异丢失。方法之二是在裂解细菌前， 增加一个 1-3 小时的短时间细菌培养步骤， 增加细菌和质粒 DNA 的绝对量以期得到足够电泳检测用 的质粒 DNA。
2、 开发一步式质粒 DNA 小提试剂盒
本产品主要利用一步式用质粒 DNA 提取技术于从 0.2-5mL 的过夜培养的饱和菌液 中提取质粒 DNA( 通常所说的小提 )， 由于得到的 DNA 量在 1-5ug， 可以供多种实验 ( 如 PCR、 转化、 限制性内切酶分析、 测序 ) 使用。
本产品开发有待解决的关键问题是如何保证内毒素的有效去除， 因为分子生物学 研究中的转染实验需要不含内毒素的质粒 DNA， 虽然本技术使用的非碱裂解液中已经含又 能去除内毒素的 Triton X-114， 但在本方法中实际去除内毒素的效果只有初步的数据， 还 需要进一步的实验收集更多的数据。该项工作希望在本发明执行期间解决。
3、 开发一步式质粒 DNA 大提试剂盒
本产品主要利用一步式用质粒 DNA 提取技术于从 100-500mL 的过夜培养的饱和 菌液中纯化质粒 DNA( 通常所说的大提 )， 得到的 DNA 由于量大， 可以同时用于多种实验， 如 PCR、 转化、 限制性内切酶分析、 测序等。
本产品开发有待解决的关键问题是确定离心吸附柱中硅胶膜的厚度和细菌处理量的关系， 因为硅胶膜吸附 DNA 的能力能其厚度成正比， 而细菌的量越多， 质粒 DNA 的量也 越高。对某一特定的质粒 DNA 量， 如果使用的硅胶膜厚度不够， 则会由于硅胶膜吸附 DNA 的 能力达到饱和， 造成质粒 DNA 的丢失。如果使用的硅胶膜厚度过厚， 则会产生对蛋白质等污 染分子的非特异吸附， 降低质粒 DNA 的纯度。
4、 本发明用于分子生物学研究的质粒 DNA 的技术标准 ：
检验项目 鉴别试验 质粒构型 质粒纯度 RNA 残留 gDNA 残留
检定方法 一种限制性内切酶后电泳 琼脂糖电泳 紫外分光光度计 琼脂糖电泳 琼脂糖电泳标准 跟预期结果一致 超螺旋或开环构型 OD260/280 ＝ 1.75-1.85 检不出 检不出二、 对需要工业级大规模 (10 升以上 ) 应用的基因治疗和基因疫苗领域， 将本技术 开发成可以转让的成套技术， 需要完成以下研究内容。
1、 关键技术
(1) 由于质粒 DNA 的工业应用主要是指临床应用， 所以将其内毒素含量降低到药 物监督管理部门规定的标准是此类产品或技术的最基本要求。 本技术通过在一步式裂解液 中加入 TritonX-114 这一成份而去除内毒素， 在小规模质粒 DNA 纯化的条件下， 初步实验结 果比较令人满意， 但是放量到工业级大规模生产还是个全新的课题， 需要本发明执行中解 决。
(2) 对临床用的质粒 DNA， 一般要求其有 90％的呈超螺旋构型。 在应用碱裂解法纯 化质粒 DNA 的实践中， 人们积累了大量关于如何提高超螺旋构型质粒 DNA 比例的经验。其 中的一条是选用无内源 DNase 的宿主细菌， 使质粒 DNA 的天然构型不会因细胞内 DNase 的 作用而发生从超螺旋到开环的转变。其次， 是严格控制细菌裂解的条件， 尤其是搅拌条件， 使之既能充分裂解细菌 ( 裂解达到 95％以上 )， 但又不过于剧烈而使质粒 DNA 发生机械断 裂而引起构型改变。但是这些方法能否转用到一步式工业级大规模质粒 DNA 纯化还是个未 知数， 需要在本发明执行过程中解决。
(3) 小规模纯化质粒 DNA 时使用的硅胶膜吸附和纯化步骤， 一般使用台式离心机 就可以完成， 但工业化大规模操作时， 由于需要处理的裂解液体积太大， 使用离心的方法不 可行 ( 需要超大容量的离心机 )， 所以肯定需要改用硅胶膜层析方法代替硅胶膜离心方法。 如何将硅胶膜层析方法与本技术有效结合也需要从头进行摸索和优化。
2、 本发明用于基因治疗和基因疫苗的质粒 DNA 的技术标准 ：
15101979541 A CN 101979546说检定方法明书标准 跟预期结果一致 ＞ 90％为超螺旋构型 OD260/280 ＝ 1.75-1.85 ＜ 1ug/mg 检不出 ＜ 2ug/mg 无细菌生长 ＜ 10EU/mg13/16 页检验项目 鉴别试验 质粒构型 质粒纯度 蛋白质污染 RNA 残留 gDNA 残留 无菌 内毒素残留
三种以上限制性内切酶后电泳 琼脂糖电泳 紫外分光光度计 ELISA 或氨基酸分析法 琼脂糖电泳 Southern Blot UPS23 培养 LAL 测试一、 面向研究领域的一步式质粒 DNA 纯化试剂盒系列产品结构图
二、 面向基因治疗和基因疫苗领域的大规模一步式质粒 DNA 纯化工艺流程步骤 ： 第一步 ： 细菌沉淀， 由于细菌体积在 10-50L， 主要用过滤法收集细菌沉淀。 第二步 ： 非碱裂解， 用非碱裂解液裂解细菌， 其间需要使用大型搅拌器进行充分搅 第三步 ： 硅胶膜结合环状 DNA， 使用上步所得裂解液直接上柱。 第四步 ： 洗柱， 用常规的洗柱液洗柱， 为尽量去除杂质， 可能需要多次重复此步骤。 第五步 ： 洗脱， 用低盐的溶液 ( 如 TE 或超纯水 ) 将硅胶膜结合的质粒 DNA 洗脱。 关键技术实现的依据拌。
本发明的关键技术是用多胺在高盐的体系中选择性地浓缩线状的基因组 DNA 并 使之丧失与硅胶膜结合的能力， 而在同样条件下， 环状的质粒 DNA 仍然保持松散的构型， 仍然能够跟硅胶膜结合。本发明研究人员经过精心摸索和大规模的筛选， 首次发现当六氨合 高钴和精胺浓度之和为 100mM 时， 虽然在高浓度异硫氰酸胍存在的条件下， 仍然能够诱导 线性基因组 DNA 和 RNA 的浓缩并失去与硅胶膜结合的能力， 而环状的质粒 DNA 仍然呈松弛 构型， 仍然可以与硅胶膜结合。并且当六氨合高钴和精胺的比例为 1 ∶ 3 时， 最终回收的 DNA 中质粒 DNA 的含量最高， 达到 95％， 并且回收率也最高， 达到 90％， 并且没有电泳可以检 测得到的基因组 DNA 和 RNA 污染。相关研究的数据总结如下 ：
多胺总浓度 六氨合高钴终浓度 精胺终浓度 RNA 比例 基因组 DNA 比例 质粒 DNA 比例 质粒 DNA 回收率
100mM 100mM 0mM 20％ 30％ 50％ 40％100mM 75mM 25mM ND 25％ 70％ 60％100mM 50mM 50mM ND 10％ 85％ 90％100mM 25mM 75mM ND ND 95％ 90％100mM 0mM 100mM ND ND 95％ 50％注： ND 表示用电泳检测不到。
在此发现的基础上， 我们对经典的非碱裂解液配方进行了优化， 增加了精胺和六 氨合高钴两种成份。与经典的非碱裂解液相比， 改良的裂解液有下列优点 ：
(1) 多胺使基因组 DNA 发生了高度浓缩， 极大地降低了裂解液的粘稠度， 使裂解液 不再粘稠， 便于后续进行各种处操作。
(2) 多胺使基因组 DNA 和 RNA 发生了高度浓缩， 不再与硅胶膜结合， 去除基因组合 DNA 和 RNA 十分容易。
(3)RNA 浓缩后去除， 不再需要 RNase 处理， 极大降低大规模生产时的成本。
一、 本技术已经用于质粒 DNA 微量 ( 单菌落 ) 提取， 说明其质粒 DNA 的回收率高于 传统的碱变性法， 因为从来没有人成功地将碱变性法用于从单个菌落中提取质粒 DNA。
如图 3 所示 ： 用本方法从一个含 pUC19 质粒的菌落提取质粒 DNA， 得到的 DNA 一半 用于电泳 ( 样品 A)， 另一半用 EcoR I 限制性内切酶线性化后再琼脂糖电泳 ( 样品 B)。A 样 品前面的 DNA 为超螺旋构型， 后面的为开环构型。
二、 本技术已经用于质粒 DNA 小规模 (0.2-1.5mL 饱和菌液 ) 提取。
如图 4 所示 ： 用本方法从 1.5mL 含 pUC19 质粒的过夜培养的细菌样品中提取质粒 DNA， DNA 最后用 200uL 洗脱液洗脱， 取 20uL 用于琼脂糖电泳。前面的 DNA 为超螺旋构型， 后面的为开环构型。
三、 本技术已经用于质粒 DNA 大规模 (100mL 饱和菌液 ) 提取。
如图 5 所示 ： 用本产品从 100mL 饱和菌液中提取 pUC19 质粒 DNA， 最后用 2mL 洗脱 液洗脱 DNA， 取 20uL 上样进行琼脂糖电泳。前面的 DNA 为超螺旋构型， 后面的为开环构型。实施例 2 ： 动物线粒体 DNA 提取分 2 步 ：
动物线粒体 DNA 提取 ( 第一步为总 DNA 提取， )
(1) 细胞裂解缓冲液 ：
Tris(pH8.0)100mmol/L
EDTA(pH8.0)500mmol/L
NaCl 20mmol/L
SDS 10％
胰 RNA 酶 20ug/ml
(2) 蛋白酶 K ： 称取 20mg 蛋白酶 K 溶于 1ml 灭菌的双蒸水中， -20℃备用
(3)TE 缓冲液 (pH8.0) ： 高压灭菌， 室温贮存
(4) 酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1)
(5) 异戊醇、 冷无水乙醇、 70％乙醇、 灭菌水
(1) 取新鲜或冰冻动物组织块 0.1g(0.5cm3)， 尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中， 加 入 1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块， 转入 1.5ml 离心管中， 加入蛋白酶 K(500ug/ ml)20ul， 混匀。在 65℃恒温水浴锅中水浴 30min， 也可转入 37℃水浴 12-24h， 间歇振荡离 心管数次。于台式离心机以 12000rpm 离心 5min， 取上清液加入另一离心管中。
(2) 加 2 倍体积异丙醇， 倒转混匀后， 可看见丝状物， 用 100ul 吸头挑出， 晾干， 用 200ulTE 重新溶解。( 可进行 PCR 反应等， 需要进一步纯化的按下列步骤进行 )
(3) 加等量的酚∶氯仿∶异戊醇振荡混匀， 12000rpm 离心 5min。
(4) 取 上 层 溶 液 至 另 一 管， 加 入 等 体 积 的 氯 仿 ∶ 异 戊 醇， 振 荡 混 匀， 离心 12000rpm， 5min。
(5) 取上层溶液至另一管， 加入 1/2 体积的 7.5mol/L 乙酸铵和 2 倍体积的无水乙 醇， 混匀后室温沉淀 2min， 12000rpm 离心 10min。
(6) 小心倒掉上清液， 将离心管倒置于吸水纸上， 将附于管壁的残余液滴除掉。
(7) 用 1ml 70％乙醇洗涤沉淀物 1 次， 12000rpm 离心 5min。
(8) 小心倒掉上清液， 将离心管倒置于吸水纸上， 将附于管壁的残余液滴除掉。
(9) 加 200ul 去离子水重新溶解沉淀物。
动物线粒体 DNA 提取 ( 第二部为在总 DNA 中提取线粒体 DNA( 同质粒 DNA 提取步 骤)
1) 结合 DNA ： 将裂解液全部转移到离心吸附柱中， 室温静置 2 分钟使质粒 DNA 与膜 结合。室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液。如果一次不能将上清全部转移到离心吸 附柱中， 可以分两次进行。
2) 预洗 ： 在离心吸附柱中加入 0.7mL 的预洗液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液。 如果预洗液放置在低温产生了沉淀， 用前需要加热到 60℃左右使之融化， 混匀后 再用。
3) 再预洗 ： 再在离心吸附柱中加入 0.3mL 的预洗液， 室温 12000-15000g 离心半分 钟， 弃穿透液。此步预洗最好别省略， 否则 DNA 纯度不高。
清洗 ： 在离心吸附柱中加入 0.7mL 的洗柱液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿 透液。再清洗 ： 再在离心吸附柱中加入 0.3mL 的洗柱液， 室温 12000-15000g 离心半分钟， 弃穿透液。室温 12000-15000g 离心半分钟， 甩干残留液体。
洗脱 ： 将离心柱置于一个新的 1.5mL 自备塑料离心管中， 加入 30-100uL DNA 洗脱 液， 室温放置 2 分钟。如果将 DNA 洗脱液预热到 65-80℃， 则效果更好。
实施例 3 ： 植物叶绿体线粒体 DNA 提取分两步， 第一步植物总 DNA 提取， 第二步从 总 DNA 中提取线粒体叶绿体 DNA。
植物线粒体叶绿体 DNA 提取 ( 第一步 )
SDS 改良法 DNA 提取液
(1)Solution Ⅰ ： NaCl(100mmol/L)， Tris-HCl(50mmol/LpH 8.0)， EDTA(50mmol/ LpH8.0)。
(2)Solution Ⅱ ： NaCl(100mmol/L)， Tris-HCl(50mmol/LpH 8.0)， EDTA(50mmol/ LpH8.0)， SDS(1％ )
(3)PCA ： 将 Tris 饱和酚和氯仿、 异戊醇按 25 ∶ 24 ∶ 1 的体积比混合， 置于棕色试 剂瓶中， 4℃保存。
(4)CA ： 将氯仿、 异戊醇按 24 ∶ 1 的体积比混合， 置于棕色试剂瓶中， 4℃保存。
(5)5M NaCl
(6) 无水乙醇
(7)1×TE 缓冲液 (pH 8.0) ： 1mol/LTris-HCl(pH 8.0)1ml， 加入 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)0.2ml， 定容至 100ml， 灭菌后备用。
SDS 改良法提取植物总 DNA 步骤 ：
(1) 取叶片称取 0.5g， 置研钵中， 经液氮冷冻后快速研磨成粉末。
(2) 迅 速 转 入 1.5mL 离 心 管 中， 加 入 800ul 的 Solution Ⅰ 溶 液， 颠 倒 混 匀， 12000rpm 离心 5min， 弃上清。
(3) 加入 800ul 的 Solution Ⅱ溶液， 混匀后置于 65℃水浴 30min， 不时轻轻地摇动 混匀。然后 12000rpm， 离心 10min， 取上清。
(4) 加等体积 PCA( 苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 )， 轻轻摇匀至下层液相澄清， 室温静置 5min， 12000rpm 离心 10min， 取上清。
(5) 加等体积的 CA( 氯仿 / 异戊醇 )， 轻轻摇匀， 室温静置 5min， 12000rpm 离心 10min， 观察分界面有无沉淀， 取上清。根据需要， 上清液可用重复 (4) ～ (5) 步骤， 反复提 取多次直至无中间层沉淀。
(6) 向上层清液加 2 倍体积的无水乙醇和 1/20 体积的 5M NaCl 轻轻混匀， 然后置 于 -20℃， 30min。
(7)12000rpm 离心 10min， 去上清， 用 70％乙醇洗涤沉淀 2 ～ 3 次， 倒置沥干。
(8) 室温溶于 200μL TE 溶液或无菌 ddH2O 中， -20℃保存备用。
植物线粒体叶绿体 DNA 提取 ( 第二步 ) 同动物线粒体 DNA 提取。