一种全酶法制备磷酸寡糖的方法 一、技术领域
本发明涉及一种低聚糖的制备方法，确切地说是利用马铃薯淀粉为原料，采用全酶法制备一种新型的功能性低聚糖-磷酸寡糖的方法。
二、技术背景
寡糖(oligosacchride)也叫低聚糖，是指由2～10个单糖通过糖苷键连接而形成的直链或支链的低度聚合物。根据寡糖生物学功能又可将其分为功能性寡糖和普通寡糖两大类，而功能性寡糖是指具有特殊的生理学功能，特别是不被人和动物肠道吸收并促进双歧杆菌的增殖，有益于肠健康的一类寡糖，即双歧因子。
磷酸寡糖(Phosphorylated oligosaccharides)的概念最早是由日本学者Kamasaka，H.等于1995年提出的，他们在生产淀粉糖的废液中，发现了这种新物质，通过结构进行分析以后发现，这是由麦芽低聚糖中的葡萄糖残基与磷酸根共价连接得到的一类低聚糖，由于其结合有磷酸根，因此，其整个基团带有负电荷，Kamasaka，H等人将其命名为Phosphorylatedoligosaccharides(POs)，即磷酸寡糖。
在以后的进一步研究中发现，磷酸寡糖具有对人体有益的生理功能，它可以在弱碱性条件下能与钙离子结合成可溶性复合物，抑制不溶性钙盐的形成，从而提高小肠中有效钙离子的浓度，促进人体对钙质的吸收，且不被口腔微生物发酵利用，同时，还具有加强牙齿釉质再矿化的作用，达到防止齿质损害的效果。磷酸寡糖主要成分的结构如图1所示。
在制备磷酸寡糖的技术上，日本学者采用壳聚糖修饰的层析柱进行分离，(《Biosci.Biotech.Biochem.，61(2)，238-244，1997》。从文献报道来看，该层析柱的交换容量有限，且其洗脱收集液用70％乙醇进行醇沉来脱盐，脱盐效率低，仅适用于实验室的微量制备，无法实现中试放大和工业化生产。经检索，只发现一例生产磷酸糖类的的美国专利(专利号US Patent 6268182)，但该专利技术生产得到的磷酸糖类是对葡聚糖、琼脂等多糖先进行磷酸化，再进行水解而得，但是，磷酸化处理属于化学法范畴，可能带能安全性问题，并且，磷酸化后还需进行水解步骤，过程繁琐，能耗较大，所以，经济利益不大，不利于大型工业化生产。我国学者谷利伟在所发文章中曾经提到过磷酸寡糖(《食品与机械，1999，12：27-28》)，但并未引起我国食品研究学者的过多关注。近十年间，国内关于磷酸寡糖的研究和报道很少，仅有关于磷酸寡糖前体及检测方法的简单报道，并未对磷酸寡糖的生产做细致研究。
三、发明内容
本发明旨在提供一种有益于人体健康的磷酸寡糖，所要解决的技术问题是以马铃薯淀粉为原料用生物酶法工业化制备磷酸寡糖。
本发明的技术方案是以马铃薯淀粉为原料的全酶促反应，包括调浆、液化、糖化以及分离、纯化、浓缩、干燥各单元过程，与现有技术的区别是所述的液化是在比重8～12OBé、pH值5.0～6.0的浆料中加入氯化钙和耐高温α-淀粉酶用蒸气喷射液化器于100～120℃下进行液化，控制出口温度95～97℃，并在此温度下保温25～35min，液化结束后灭酶、压滤分离得到淀粉液化料，以干淀粉计，氯化钙的加入量为0.6～0.7kg/吨淀粉，耐高温α-淀粉酶的加入量为1680000～2520000u/吨淀粉；所述的糖化是在淀粉液化料中加入真菌酶和普鲁兰酶于温度55～65℃、pH值5.0～5.5条件下糖化2～4h，糖化结束后灭酶、活性炭脱色并压滤分离得到淀粉糖化液，以干淀粉计，真菌酶加入量为2400000～3600000u/吨淀粉，普鲁兰酶加入量为16000～24000u/吨淀粉；所述的纯化是淀粉糖化液首先用001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂吸附除去金属离子和带正电荷的杂质，然后用阴离子交换树脂分离磷酸寡糖。收集洗脱液即是主要含磷酸寡糖的糖液，经浓缩、干燥得到磷酸寡糖产品。
所述的阴离子交换树脂选自7170强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、201×7强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D201大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或者D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂等。
优选7170强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，树脂活化后，再经pH 4.5的乙酸钠-乙酸缓冲溶液平衡24h，使溶出液pH4.5，采用pH4.0～5.0的乙酸钠-乙酸缓冲溶液定容配制的0.2～0.4mol/L氯化钠溶液为洗脱剂，以0.3BV/h洗脱流速进行洗脱，收集洗脱流出液即是主要含磷酸寡糖的糖液，经浓缩、干燥得到磷酸寡糖产品。
为进一步纯化可用凝胶层析柱对主要含磷酸寡糖的糖液进行脱盐处理，最后浓缩干燥。
本产品红外光谱图与红外光谱图库比较分析表明，产品为结合有磷酸的磷酸寡糖，进一步采用高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)进行分析，结果表明磷酸寡糖的含量≥85％，聚合度2～7。
由于本方法采用新型国产7170强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂进行磷酸寡糖的分离，该树脂交换容量大，可以运用于大型离子交换系统，因此可以进行POs的大量制备，且对糖液采用凝胶层析脱盐，该法脱盐效果明显，处理效率高，总之，该法可以适用于磷酸寡糖(POs)的大型工业化生产。同时，由于该法直接对马铃薯原淀粉进行液化、糖化等操作来制备POs，无需经过磷酸化处理，不会对产品带来潜在的安全性问题，且步骤较简单，能耗少，经济利益较大。
四、附图说明
图1是磷酸寡糖主要成分X衍射图。
图2是制备样品HPAEC-PAD谱图。图中(a)为麦芽低聚糖标准品谱图，(b)为样品谱图。
图3是样品薄层析(TLC)谱图
图4磷酸寡糖样品红外光谱图。图中(a)为马铃薯淀粉磷酸酯谱图，(b)为样品谱图。
图5是本方法工艺路线图。
五、具体实施方式
1、具体操作步骤：
1)调浆。首先向配料罐里注入水，而后在不断搅拌下，徐徐投入1吨原料淀粉，用玻美计进行在线检测，直到浆料浓度为10oBe，然后加入0.65kg CaCl2做为酶活促进剂，用HCl和Na2CO3将浆料调至PH值为5.4。
2)液化。用泵将物料泵入喷射液化器后，向其中加入新型耐高温α-淀粉酶，用量为2100000u/吨淀粉，在喷射器中，粉浆和蒸汽直接充分相遇，喷射温度110℃，并维持4～8min，控制出料温度为95～97℃，喷射液化后的料液进入层流罐，在95℃条件下保温30min，典试反应显碘本色时，通蒸汽灭酶。液化料DE值为15％～17％。
3)一次板框压滤。压滤时，开始压力应不低于0.6Mpa，待滤饼形成阻力增大时再增加压力，但以不超过2Mpa为宜，料液应保持一定得温度，以增加其流动性，但不应高于100℃，pH值为5.2～5.4时，过滤速度最快。
4)糖化。将料液冷却至60℃，向糖化罐中加入真菌酶和普鲁兰酶，用量分别为3000000u/吨淀粉和20000u/吨淀粉，调节PH值为5.2，反应2～4h，然后通入高压蒸汽100℃条件下灭酶2～3h。糖化液DE值为34％～37％。主要成分为麦芽低聚糖。淀粉转化率≥98％。
5)脱色、二次压滤。糖化后糖液随着管道进入脱色罐，罐中含有活性碳，保持罐温为80℃左右，糖液通入后，在不断搅拌的情况下，活性碳吸附糖液所含的色素以及部分无机盐，随后活性碳随同糖液一并进入板框压滤机，经过压滤除去活性碳。
6)离子交换处理。经脱色、压滤后地糖化液进入离子交换处理系统，首先，进入阳离子交换柱，树脂使用001×7强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，用来除去一些金属离子及带正电杂质。其次，经阳离子柱交换后的糖化液进入阴离子交换柱进行磷酸寡糖和中性糖的分离步骤，树脂使用7170强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(活化后，经pH4.5的乙酸钠-乙酸缓冲溶液平衡24h，使流出液pH值为4.5)，当糖化液经过阴离子交换柱时，磷酸寡糖被吸附，而中性糖不被吸附，随着管道进入三效蒸发浓缩系统进行浓缩，作为麦芽低聚糖进行销售。而后对被吸附的磷酸寡糖进行洗脱，洗脱条件为：采用经pH 4.5的乙酸钠-乙酸缓冲溶液定容配制的0.3mol/L氯化钠溶液为洗脱剂，洗脱流速为0.3BV/h。用苯酚-硫酸法(吸取1ml糖液+1ml去离子水+1ml 6％的苯酚+5ml浓硫酸，静置20分钟，在490nm下检测吸光度)进行糖含量检测，直到洗脱液里不再含糖，将先前所有洗脱液进行收集，内含磷酸寡糖粗品，最后，对收集液进行凝胶层析脱盐处理。
7)浓缩。将收集的磷酸寡糖粗样液，使用旋转蒸发器或者进入三效蒸发浓缩系统进行浓缩处理，为防止焦糖化发生，一般要求温度不超过70℃为宜。
8)干燥。使用喷雾干燥法对浓缩液进行干燥，即为最终磷酸寡糖成品。其中，喷雾干燥的工艺条件为：
进料浓度：35％～45％；
进料温度：60～85℃；
进风温度：135～160℃；
排风温度：75～90℃；
水分含量：6％以下。
3、产品的定性分析
(1)HPAEC-PAD检测糖组分
采用HPAEC-PAD方法测定所制备的样品糖分组成，以麦芽低聚糖标准品为对照，进行分析检测。
1)离子色谱条件
色谱柱：CarboPac PA100 2-mm分析柱和保护柱；柱温：30℃；检测器：脉冲安培检测器PAD；流动相：A：100％水；B：100mmol/L氢氧化钠，200mmol/L乙酸钠；进样体积：25μL。梯度洗脱条件见表1。
表1麦芽低聚糖浆梯度洗脱条件
2)绘制标准品谱图
称取葡萄糖和麦芽2～7糖标品(分别用G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7表示)约10mg，用100μL的超纯水溶解，混和均匀，用0.45μm的水系滤膜过滤后进样。得到标品谱图，如图2(a)所示。
3)样品组分检测
取制备的样品将其稀释至0.005％，用0.45μm的水系滤膜过滤后进样检测。得到样品谱图，如图2(b)所示
(2)薄层层析(TLC)分析
展开剂：乙酸乙酯∶甲醇∶水∶氨水＝10∶18∶2∶3；显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸。取硅胶板在100～110℃活化30～60min。取葡萄糖和麦芽低聚糖(DP2～7)标准品，分离得到的磷酸寡糖样品，配成1％(W/V)的浓度，用微量吸管点样于薄层板上，吹干。再将薄层板放在盛有展开剂的层析缸中展开。当溶剂前沿到达距薄层板末端1cm时，停止展开。取出薄层板，用吹风机吹干，喷显色剂于薄层板，再在电热板上加热10min使其充分显色。如图3所示，1、2样点均为磷酸寡糖样品，可以看出：谱带显色良好，展开稍有拖尾，其各个显色点对应于标样均显滞后，是由于其结合磷酸根从而使分子量增大的缘故，由此我们可以推断出磷酸寡糖含有结合有磷酸根的G2～G7这几种糖组分。
(3)磷酸寡糖的红外光谱分析
将经干燥后的样品，通过溴化钾压片法进行红外光谱分析。见图4。
对两者进行对照分析，发现在1080和928cm-1左右，均有磷脂键特征峰出现。根据红外光谱图库对图2两组谱图进行分析表明：1080cm-1处有P-O-C基团的伸缩振动吸收峰，928cm-1处有5价磷的P-O伸展振动。此外，在3000-2800cm-1区域内的吸收峰是糖类的特征峰，2930cm-1是次甲基(-CH2-)中C-H伸缩振动的吸收峰，1420cm-1处事羰基的C＝O伸缩振动引起的吸收峰，768cm-1处是D-葡萄吡喃糖环C-O-C振动吸收峰，由此可以判定该产品即为结合有磷酸基团的磷酸寡糖。