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本发明包括用于将细胞转化成葡萄糖应答性的胰岛素生成细胞的组合物和方法，其使用表达β细胞素和PDX1的构建体，例如，利用一种或多种载体来转化胰腺腺泡细胞，所述载体使用超声靶向破坏微泡(UTMD)来表达β细胞素和PDX1。

1.  一种在细胞中诱导产生胰岛素的方法，该方法包括：
用表达β细胞素(BTC)和胰十二指肠同源框-1(PDX1)的载体来转化一种或多种细胞。

2.  权利要求1所述的方法，其中所述细胞用共表达BTC和PDX1的单一构建体来转化。

3.  权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自胰岛细胞、胰腺腺泡细胞、细胞系、已经与一种或多种胰岛素基因共转染的细胞。

4.  权利要求1所述的方法，其中所述构建体是使用微泡、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、凝聚胺-介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道来递送的。

5.  权利要求1所述的方法，其中所述构建体是使用微泡和超声靶向微泡损坏来递送的。

6.  权利要求1所述的方法，其中所述细胞基于葡萄糖水平来表达胰岛素15天以上。

7.  权利要求1所述的方法，其中所述细胞在体内转化并以葡萄糖应答性的方式表达胰岛素15天以上。

8.  权利要求1所述的方法，其中所述细胞为非内分泌胰腺细胞，其以葡萄糖应答性的方式表达胰岛素15天以上。

9.  权利要求1所述的方法，其中所述BTC、PDX1或二者都选自小鼠、大鼠或人。

10.  一种载体，所述载体包括一种核酸表达构建体，该构建体当转染到腺泡细胞时表达β细胞素、PDX1或二者。

11.  权利要求10所述的载体，其中所述载体用当暴露于超声时被破坏的微泡来处理。

12.  权利要求10所述的载体，其中所述核酸表达构建体包括控制BTC表达的启动子。

13.  权利要求10所述的载体，其中所述核酸表达构建体包括受相同启动子控制的BTC和PDX1。

14.  权利要求13所述的载体，其中所述BTC和PDX1在分离的载体上。

15.  权利要求13所述的载体，其中所述BTC和PDX1受不同的启动子控制。

16.  权利要求13所述的载体，其中所述启动子选自RIP、HIV、AMV、SV40、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复序列(HIV LTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、ALV启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、RSV启动子、人血红蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子和EBV启动子。

17.  权利要求10所述的载体，其中所述BTC、PDX1或二者都选自小鼠、大鼠或人。

18.  权利要求10所述的载体，其中所述PDX1的Genbank登录号为NM022852，所述BTC的Genbank登录号为NM022256。

19.  一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含在组成启动子控制下表达BTC和PDX1的外源核酸片段。

20.  权利要求19所述的宿主细胞，其中所述启动子选自RIP、HIV、AMV、SV40、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复序列(HIV LTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、ALV启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、RSV启动子、人血红蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子和EBV启动子。

21.  权利要求19所述的宿主细胞，其中所述BTC、PDX1或二者都选自小鼠、大鼠或人。

22.  权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自胰岛细胞、胰腺腺泡细胞、原代胰腺细胞或者已经与一种或多种胰岛素基因共转染的细胞。

23.  权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞通过微泡、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、凝聚胺-介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道来转化。

24.  权利要求19所述的宿主细胞，其中所述细胞表达胰腺β细胞标记物，该胰腺β细胞标记物选自INS-1、INS-2、胰升糖素、生长激素释放抑制因子、MIST-1、VMAT、神经元素-3、Nkx2.2及其组合。

由胰腺腺泡细胞向胰岛素生成细胞的体内转化
发明技术领域
本发明涉及糖尿病的治疗，并且更具体地，涉及将细胞转化成葡萄糖应答性的胰岛素生成细胞的组合物和方法。
发明背景
在不限制本发明范围的情况下，本背景描述的是关于糖尿病。糖尿病在世界范围内影响了大约20亿人并且还在普遍增加(1)。据估计，其为世界上排名第5位的致死疾病(2)，且会导致严重的并发症，包括心血管疾病、慢性肾脏疾病、失明和神经病。
尽管有各种药物治疗糖尿病，包括胰岛素治疗，通常很难对足量血糖进行控制，部分原因是这些药物不能复制正常胰岛的葡萄糖调控功能。因此，新的治疗策略集中于在糖尿病的主要类型中，通过胰岛移植或β-细胞再生来补充缺乏的β细胞正常量(3-5)。
在授予Kojima的第6,232,288号美国专利用于改善胰腺功能的组合物中教导了糖尿病治疗领域的一个有前景的利机会。Kojima教导使用β细胞素蛋白本身或其片段来促进未分化的胰腺细胞分化成合成胰岛素产生胰岛素的β细胞或产生胰腺多肽的F细胞。所述BTC蛋白组合物改善了病人的葡萄糖耐受，并抑制未分化的胰腺细胞生长。还提供了治疗包括人类的哺乳动物的方法。但是，然而，通过给病人提供静脉内注射β细胞素蛋白并不实现长期治疗糖尿病病症。
β细胞素蛋白(BTC)是由源自转基因小鼠的胰腺β肿瘤细胞合成的肽因子，并且其氨基酸序列全长已通过cDNA分析阐明(Shing等人，Science，259：1604(1993)；Sasada等人，Biochemical and BiophysicalResearch Communications，190：1173(1993))。已在非脑器官，如肝脏、肾脏和胰腺中检测到BTC的mRNA，暗示了BTC蛋白可能在这些器官中发挥着某些作用。最初发现BTC蛋白是将其作为具有小鼠3T3细胞生长促进活性的因子，后来发现其显示出抗血管平滑肌细胞和视网膜色素上皮生长促进活性(Shing等人，Science，259：1604(1993))。
天然存在的人BTC蛋白非常微量。大量重组合成高度纯化的人BTC蛋白且成本相对较低(EP-A-0555785)。其它两项专利申请(EP-A-0482623，EP-A-0555785)指出BTC蛋白可以用于治疗疾病如创伤、肿瘤和血管畸形以及制备竞争试剂如抗体或错肽(false peptide)，其可以用于治疗因平滑肌生长导致的疾病如动脉粥样硬化和糖尿病视网膜病变。尽管有这些试剂可用，但是对于长期治疗糖尿病的组合物和方法，仍然存在巨大需求。
发明概述
本发明包括利用β细胞素和胰十二指肠同源框-1(PDX1)将细胞转化成葡萄糖应答性的胰岛素生成细胞的组合物和方法。在一个具体实例中，可以在体内利用超声靶向破坏微泡(UTMD)以及一个或多个转运β细胞素和胰十二指肠同源框-1(PDX1)基因的更多表达载体将胰腺腺泡细胞转化靶或宿主细胞。
更具体地，本发明包括通过用表达β细胞素(BTC)和胰十二指肠同源框-1(PDX1)的构建体转化一种或多种细胞来在细胞内诱导产生胰岛素的组合物和方法，例如，用共表达PDX1和BTC的构建体来转化细胞。在一个实施方案中，所述细胞选自胰岛细胞、胰腺腺泡细胞、细胞系、已与一种或多种胰岛素基因共转染的细胞。所述构建体的转运可以使用微泡、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导转染、凝聚胺-介导转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道或会本领域内技术人员熟知的其它方法。在一个实施方案中，所述构建体的转运是利用微泡和超声靶向破坏微泡。
已发现使用本发明的组合物和方法，胰腺细胞能够基于葡萄糖水平表达胰岛素15天以上，即细胞成为葡萄糖应答性胰岛素生成细胞。所述细胞可以在体内转化并以葡萄糖应答的方式表达胰岛素15天以上。在一个实例中，所述细胞可以是非内分泌胰腺细胞，其以葡萄糖应答性的方式表达胰岛素15天以上。靶细胞可以通过表达选自小鼠、大鼠或人BTC的BTC和选自小鼠、大鼠或人PDX1的PDX1来提供葡萄糖应答性胰岛素的产生。
本发明还包括具有当转染到腺泡细胞时表达β细胞素或PDX1或二者的核酸表达构建体的载体。本领域技术人员将认识到可以使用本发明各种转运载体的方法。转运的非限制性实例包括沉淀(如磷酸钙)、脂质体、电穿孔和注射。所述载体可以在暴露于超声破坏的微泡中转运到选定的靶细胞或组织。在一个实施方案中，所述载体为包括控制BTC表达的启动子的核酸表达构建体。当与PDX1一起表达时，所述核酸表达构建体可能具有受相同启动子控制的BTC和PDX1。供选择地，所述BTC和PDX1可以位于分离的载体上，且甚至受不同的启动子控制。本发明中使用的启动子非限制性实例包括大鼠胰岛素启动子(RIP)、人免疫缺陷病毒(HIV)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)、SV40、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复序列(HIVLTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、禽造白细胞组织增生病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、RSV启动子、人血红蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子和EBV启动子。用于本发明表达的BTC可以是哺乳动物BTC，例如小鼠、大鼠或人BTC。用于本发明表达的PDX1可以是哺乳动物PDX1，例如小鼠、大鼠或人PDX1。在一个具体实例中，PDX1的Genbank登录号是NM022852，BTC的Genbank登录号是NM022256。
本发明还包括宿主细胞，其包括受控于组成型启动子表达BTC和PDX1的外源核酸片段。所述宿主细胞还可以具有受控于组成型启动子表达BTC和PDX1的外源核酸片段。可以控制BTC和/或PDX1基因的启动子选自，例如RIP、HIV、AMV、SV40、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复序列(HIV LTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、ALV启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、RSV启动子、人血红蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子和EBV启动子。宿主细胞的实例包括但不限于胰岛细胞、胰腺腺泡细胞、原代胰腺细胞或已与一个或多个胰岛素基因共转染的其它细胞。所述宿主细胞的转化可以通过微泡、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导转染、凝聚胺-介导转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道。在一个实例中，当在体内转化靶细胞时，细胞可以表达一种或多种胰腺β细胞标记物，例如INS-1、INS-2、胰升糖素、生长激素释放抑制因子、MIST-1、VMAT、神经元素-3、Nkx2.2及其混合物。
附图的简要说明
所附附图，其中全文分开来看，诸如参考数字是指相同或功能相似的元素，并被纳入成为说明书的一部分，还阐述本发明，并与发明详述一起用于解释本发明的原理。
图1.上图：。血糖水平随时间变化图。在正常对照(红色实线)中，葡萄糖水平是稳定的。在所有链脲霉素(STZ)-处理的大鼠中，葡萄糖在第3天内急剧上升，在STZ单独(黑色实线)、DsRed(黑色虚线)或β细胞素单独(蓝色虚线)处理的大鼠中持续上升。到第5天和第10天，用胰十二指肠同源框-1(PDX1)(橙色虚线)处理的大鼠中，葡萄糖得到改善，用PDX1和β细胞素同时处理(蓝色实线)的大鼠中，葡萄糖几乎正常。通过重复测量ANOVA，组间和随时间变化的这些差异在统计学上都极其显著。下图：血清胰岛素水平随时间变化图。在正常对照(红线)中，胰岛素水平随时间变化保持稳定。在所有STZ-处理的大鼠中，第3天胰岛素显著下降，并进一步下降(仅STZ或带有DsRed的UTMD)，或保持较低(带有β细胞素的UTMD)。相反地，带有PDX1的UTMD的胰岛素水平在第5天恢复到正常(橙色虚线)；而有PDX1和β细胞素的UTMD则在第5天和第10天(蓝色实线)导致胰岛素水平超常。通过重复测量ANOVA，组间和随时间变化的这些差异在统计学上都极其显著。
图2.基线和第10天的C-肽图。在正常对照中，C-肽随时间变化保持稳定(红线)。C-肽在STZ单独或STZ之后带有DsRed或BTC的UTMD处理的大鼠中降低。然而，C-肽在STZ之后带有DsRed和BTC的UTMD处理的大鼠中显著提高(p＜0.03对其它全部组，第10天)。
图3.在UTMD之后第10天进行的葡萄糖耐受实验结果。STZ单独处理的大鼠(黑线)在基线处的血糖水平明显提高，葡萄糖负荷后进一步提高。β细胞素和PDX1(蓝线)具有与正常对照鼠(红线)相似的几乎正常的葡萄糖应答。
图4.用FITC-标记的抗-胰岛素(绿色)和CY5-标记的抗-胰升糖素(蓝色)抗体染色的鼠胰腺代表性组织学切片。左上图图：正常对照大鼠的低倍(100X)切片显示3个中间有β-细胞(绿色)，外周有α-细胞(蓝色)一般胰岛，中间有β-细胞(绿色)，外周有α-细胞(蓝色)。右上图图：STZ-处理的大鼠的低倍切片(100X)显示没有可见的胰岛。左中图图：BTC-处理的大鼠的低倍切片(100X)显示非典型的大多用胰升糖素(蓝色)染色的胰岛-样团簇细胞大多用胰升糖素(蓝色)染色。右中图图：通过UTMD借助转运PDX1和β细胞素质粒来处理大的鼠的低倍切片(100X)。非典型的胰岛-样团簇细胞大多用胰升糖素染色。另外，抗-胰岛素似乎扩散地存在于出现在该外分泌胰腺。左下图：PDX1和β细胞素质粒处理的大鼠的高倍(400X)图像，显示出似乎是腺泡细胞内主要是胰岛素染色。右下图：BTC和PDX1处理的大鼠中的非典型的胰岛-样团簇高倍(400X)图像。在这些胰胰岛-样团簇内的染色主要是胰升糖素染色。
图5.该图显示出图示出每个正常胰岛形态的切片的正常胰岛形态的胰岛数量(左图)和主要是胰升糖素阳性细胞的胰岛-样团簇(右图)。正常胰岛在对照中常见(每个切片46±9个胰岛)，但是在STZ-大鼠中，无论处理组，都是罕见的(p＜0.0001)。胰升糖素阳性细胞的胰岛-样团簇在对照中不存在，而适量存在于STZ-鼠中，尤其是那些BTC和PDX1处理的大鼠(每个切片19±8个胰岛，p＜0.02对其它他组)。
图6.左图：通过UTMD借助PDX1和β细胞素来处理大鼠高倍图像(1000X)。左图像顶部被FITC-标记的抗胰岛素染色，显示似乎是腺泡细胞产生胰岛素。右图底部为显示FITC-标记的抗胰岛素和DsRed-标记的抗淀粉酶共同定位的共焦图像，确定这些是腺泡细胞。右图：UTMD处理后分离的肺泡细胞的免疫印迹。竖向图是正常对照、STZ-处理对照、UTMD与β细胞素、UTMD与PDX1、以及UTMD与PDX1和β细胞素。在这些UTMD处理的肺泡细胞中，大量β-细胞标记物上调。β-肌动蛋白作为阳性对照。
图7.带有PDX1和β细胞素的UTMD处理后的腺泡细胞转分化的时间过程。顶图：组织学图像显示，UTMD处理后，在腺泡细胞内FITC-标记的胰岛素的产生，其在第10天是显著的，在第20天减少，在第30天几乎没有。底图：葡萄糖(竖线左边)在第10天和第30天期间增加；而胰岛素(竖线右边)降低。
发明详述
当审查以下的发明详述时，本发明的新特征对于本领域技术人员来讲是显而易见的。然而，应当理解的是，提供发明详述和具体实施例尽管表明了本发明的特定实施方案，但仅是为了阐明的目的，因为在本发明的精神和范围之内的各种变化和修改通过发明详述和随后的权利要求，对于本领域技术人员来说都是显而易见的。
在不背离以下权利要求的精神和范围的情况下，本发明可以包括本文所述的可能的从教导角度讲的各种修改和变化。预期本发明的用途可以包括具有不同的特征的组分。料想的是假定充分认识到在所有方面的等同形式，本发明的范围受后附权利要求限制。
本文所使用的术语“基本上如序列ID号(SEQ ID NO.)(#)所示的序列”、“序列类似于”、“核苷酸序列”以及关于核苷酸的类似术语，是指基本上与本文所明确的序列如序列ID号(SEQ ID NO.)：1任意部分相应的序列。这些术语是指合成的和天然生成的分子，且包括具有生物学、免疫学、实验或其它功能上等同活性的序列，如关于通过核酸片段杂交，或者编码全部或部分β细胞素或PDX1活性的能力。无疑地，这些术语意思是包括由其全序列特定的如此这样的信息。
本文所使用的术语“基因”，是指功能性蛋白、多肽或肽的编码单元。正如本领域人员会理解的，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列、或片段或其组合，还有基因产物，包括那些可能被人工改造过的。纯化的基因、核酸、蛋白等用来指这些从通常与其相关的至少一种受污染的核酸或蛋白中确定和分离出的实体。
本文所使用的术语“载体”，是指将DNA片段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。所述载体还可以定义为设计用于传播特定序列的核酸分子，或作为包括操作连接到该特定序列的启动子的表达载体，或设计造成引入这样的启动子的核酸分子。所述载体可以以独立于宿主细胞染色体的状态而存在，或者可以整合到宿主细胞染色体中。
本文所使用的术语“宿主细胞”，是指被改造成含有核酸片段或改变的片段的细胞，无论古菌、原核的或真核的。因此，改造的或重组的细胞，与不含通过人工重组引入基因的天然存在的细胞不同。
本文所使用的术语“控制序列”，是指在特定宿主有机体中表达操作连接的编码序列所必需的DNA序列。所述控制序列适用于原核生物，例如，包括启动子、任选的操纵序列、核糖体结合位点和转录终止子。当细胞培养生长并成熟如处于对数生长(log)期间，可以使用在低于生长-阻抑量的水平来抑制Fab’多肽合成的高度调控的可诱导启动子。
本文所使用的术语“操作连接”，是指第一和第二核酸序列之间的功能关系。例如，若是前导肽或分泌的导肽DNA作为参与该多肽分泌的前蛋白表达，那么将其操作连接到多肽DNA上；若是启动子或增强子影响序列转录，那么将其操作连接到编码序列；或者若是设置核糖体结合位点的以促进翻译，那么将其操作连接到编码序列。通常，“操作连接”的意思是被连接的DNA序列是邻接的，对于分泌的导肽来讲，是邻接的且位于同一个阅读框。增强子并不必是邻接的。在合适的限制性位点通过连接反应来完成连接。若是不存在这样的位点，就按照常规操作使用合成的寡核苷酸连接物或接头。
本文所使用的术语“细胞”和“细胞培养物”相互交替地使用，且所有这样的指代包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”在不考虑转录的数量的情况下，包括源于此的原代受试细胞和培养物。还应当理解的是，由于天然或人工突变，所有子代的在DNA含量上不可能精确地相同。包括与筛选初始转化的细胞具有相同功能或生物学活性的突变体子代。从前后关系上看，前后不同名称都将是清楚的。
本文所使用的“质粒”，用在前的小写字母p和/或随后的大写字母和/或数字命名。商业上可购的初始质粒是公众可以自由获得的，或者由这些可获得的质粒按照已公开的方法构建。此外，其它质粒等同物都是本领域已知的，且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
本文所使用的术语“蛋白”、“多肽”或“肽”是指包括通过肽键连接的氨基酸的化合物，可相互交替使用。
本文所使用的术语“内源的”，是指来源于细胞内的物质。内源物质由细胞代谢活动产生的。然而，内源物质仍可能是由细胞新陈代谢的操纵而产生的，例如，使细胞表达基因编码的物质。
本文所使用的术语“外源的”，是指来源于细胞外部的物质。当涉及核酸时，“外源的”是指与细胞无关的核酸序列，或者与细胞同源但是位于通常找不到元素的宿主细胞核酸内。然而，细胞可以通过本领域技术人员所熟知的各种代谢或诱导手段中的任意一种来使外源物质内在化。
基因的基因形式或基因的克隆含有被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中止的编码区。内含子是被转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可能含有诸如增强子的调控元件。将内含子从核酸或初级转录物中除去、切除或“剪切”；因此在信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。在翻译期间，mRNA在开始形成的多肽中在特定序列或氨基酸序列中起作用。
除了含有内含子，基因的基因组形式还可以包括存在于RNA转录物中位于序列的5’和3’端。这些序列被称为“侧翼”序列或区(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物的非翻译序列的5’或3’端)。所述5’侧翼区可能含有控制或影响基因转录的调控序列，如启动子和增强子。所述的3’侧翼区可能含有指导转录终止、转录后剪切和多聚腺苷酸化的序列。
DNA分子被认为具有“5’端”和“3’端”，因为单核苷酸以一种核苷酸戊糖环的5’端磷酸盐通过磷酸二酯键在一个方向上根与其邻接的3’氧相同方向连接的邻接的3’氧通过磷酸二酯键的方式反应来制备寡核苷酸。因此，若是寡核苷酸的末端未连接到单核苷酸戊糖环的3’氧，就被称为“5’端”；若是其3’氧未连接到其后单核苷酸戊糖环的5’磷酸盐，就被称为“3’端”。本文所使用的核酸序列，即使其内有较大的寡核苷酸，也可以被认为具有5’和3’端。DNA分子无论直链还是或环状，分离元件被称为是“上游”或“上游”的5’或3’元件。该专用术语反映出沿着DNA链5’到3’的方式进行转录。
本文所使用的术语“转化”，是指外源的DNA进入并改变受体细胞的过程，例如，一种或多种包括启动子和编码序列的质粒来表达β细胞素和/或PDX1。转化可以在利用本领域熟知的各种方法的自然或人工条件下发生。转化可以依赖于任何已知的采用插入外来核酸序列到原核或真核宿主细胞的方法。基于被转化的宿主细胞来选择方法，且该方法可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质体转染和粒子轰击。这种“转化的”细胞包括稳定的转化细胞，其中插入的DNA能够在该转化细胞内作为自主复制的质粒或是作为宿主染色体的一部分进行复制。
本文所使用的术语“转染”，是指向真核细胞中引入外来的DNA。可以通过本领域已知的各种方法来完成转染，包括例如，磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导转染、凝聚胺-介导转染、电穿孔、微注射脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道。因此，术语“稳定的转染”或“稳定被转染”是指将外来DNA引入并整合至被转染的细胞基因组中。术语“稳定的转染子”是指具有将外来的DNA稳定地整合至基因组中的细胞。该术语还包括在有限的时间内瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。因此，术语“瞬时转染”或“瞬时被转染”是指向细胞中引入外来DNA，其中外来DNA未能整合到被转染细胞的基因组中。所述外来DNA在被转染细胞的核内坚持几天。本文期间，该外来DNA受在染色体内控制内源基因表达的调节控制。术语“瞬时转染子”，是指占据外来DNA但未能整合该DNA的细胞。
本文所使用的术语“载体”，用来指将DNA片段从一个细胞转运到另一个细胞的核酸分子。有时术语“媒介物”与“载体”相互交替使用。本文所使用的术语“载体”还包括涉及重组DNA分子的表达载体，该DNA分子含有期望的编码序列和在特定宿主有机体中对于操作连接编码序列的表达所必需的合适的核酸序列。原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵基因(可选择的)和核糖体结合位点，通常还有其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多聚腺苷酸化信号。
本文所使用的术语“扩增”涉及核酸时，用来指通过本领域已知的任何方法来产生大量核酸序列的附件。扩增是核酸复制的一种特殊情况，包括模板特异性。模板特异性通常用术语“靶”特异性来描述。靶序列是“靶”，从某种意义即设法从其它核酸中把它们分类出来。已主要设计扩增技术用于这种分类。
本文所使用的术语“引物”，是指在经纯化的限制性消化中天然存在的或是人工合成的寡核苷酸，其与诱导的核酸序列互补，在引物延伸产物的合成条件下(即在核苷酸和诱导剂，如DNA聚合酶存在下，在合适的温度和pH下)，能够作为合成的起始点。为达到最大效率，在扩增中引物可以是单链，但也可以供选择地为双链。若是双链，在用于制备延伸产物前，先处理引物以分离链。所述引物必须足够长以在诱导剂存在下引导合成延伸产物。引物的准确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及所使用的方法。
本文所使用的术语“探针”，是指在经纯化的限制性消化中天然存在的或人工合的、重组的或通过PCR扩增的寡核苷酸(即核苷酸序列)，其能够与另一个感兴趣的核苷酸杂交。探针可以是单链或双链。探针检测、鉴别和分离特定基因序列中是有用的。预期的是本发明使用的任何探针将用任意“报告分子”标记，使得在任何检测系统中可检测，包括但不限于酶(例如，ELISA和基于酶的组织化学检测)、荧光、放射性和发光系统。并不意向本发明被限于任何特定的检测系统或标记。
本文所使用的术语“靶”，涉及聚合酶链式反应时，是指用于聚合酶链式反应的被引物结合的核酸区。因此，要设法将“靶”从其它核酸序列中分类出来。“片段”定义为靶序列内的核酸区。当用于指细胞或组织时，靶是指利用细胞外源载体(如病毒、脂质体或甚至是未修饰的核酸)的靶来向细胞转运核酸，以此改变细胞的功能，例如，表达一种或多个BTC或PDX1基因。
本文所使用的术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)，是指授予K.B.Mullis的第4,683,195、4,683,202、和4,965,188号美国专利中的方法，其描述了无需克隆或纯化提高在基因组DNA混合物中就可提高靶序列片段浓度的方法，在此引入作为参考。该扩增靶序列的过程包括将过量的两种寡核苷酸引物加入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行热温度循环形成准确的序列。所述两种引物与它们双链靶序列的各自链的靶序列双链互补。为实现扩增，先使混合物变性，且然后将引物退火使引物至与它们在靶分子内的互补序列结合。退火之后，利用聚合酶延伸引物以，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即变性、退火和延伸组成一次“循环”；可以有许多次“循环”)以获得期望靶序列的高浓度扩增片段。期望的靶序列的扩增片段的长度由引物彼此的相对位置确定，并且因此，该长度是可控制的参数。由于重复过程的角度，所述方法被称为“聚合酶链式反应”(以下称“PCR”)。由于期望的靶序列扩增片段成为混合物中的主要序列(就浓度而言)，它们被认为“PCR扩增的”。使用PCR，通过若干不同的方法有可能将基因组DNA中特定靶序列的单个复件扩增到可检测的水平，(例如，与标记的探针杂交；与生物素化引物结合后通过亲和素酶联合检测；与32P-标记的脱氧核苷酸三磷酸盐结合至扩增片段中，如DCTP或DATP)。除了基因组DNA，可以使用适当的引物分子组扩增任何寡核苷酸序列。特别是由PCR过程本身生成的扩增片段，它们本身是随后进行PCR扩增的高效模板。
本文所使用的术语“染色剂”，是指包括该试剂的核酸序列的全部杂交模式。对于部分基因组特定的染色剂提供了在靶和非-靶染色体材料之间的对比。可以用由一种或多种颜色(多色染色模式探测到的部分基因组上的任何期望的染色模式和/或其它指示方法)来检测出许多不同的失常。
本文所使用的术语“转基因”是指可以向哺乳动物的基因组，例如活体动物的哺乳动物细胞中，人工插入的基因材料。本文使用的术语“转基因动物”是描述具有存在于其细胞部分的染色体外或者稳定整合到其种系DNA内(即在其细胞内大多或全部的基因组序列内)的非内源的(即异种)核酸序列的非人动物，通常为哺乳动物。将异种核酸通过基因操作的方法引入到这样的转基因动物种系中，如根据本领域熟知的方法引入到宿主动物胚或胚胎干细胞中。
本文所使用的术语“转基因”是指这样的异种核酸，例如形成诸如表达构建体的异种核酸(如产生“基因敲入”转基因动物)，或者由于插入到靶基因内或与靶基因邻接而导致降低靶基因表达的异种核酸(如产生“基因敲除”转基因动物)。基因的“敲除”意思是导致靶基因功能降低的基因序列的改变，更优选地，该靶基因的表达不可检测或无意义。转基因敲除动物包括靶基因的杂合敲除，或者靶基因的纯合敲除。
本文所使用的术语“干细胞”，是指全能性或多能性干细胞，例如，胚胎干细胞，以及胚胎发育早期的此种多能性细胞，包括但不限于胚泡发育阶段的细胞。在本发明中使用的一个具体实例中，干细胞可以是尚未分化成腺泡或β细胞的胰腺细胞前体，并且作为表达BTC和/或PDX1的靶。
本发明人阐明了利用超声靶向破坏微泡(UTMD)，基因治疗可以靶向正常大鼠的胰岛(6)。通过超声在胰腺微循环内选择性地破坏运载质粒DNA的静脉内微泡，从而局部转运质粒。通过在质粒DNA内结合大鼠胰岛素-I启动子，可实现胰岛特异性。现已发现利用UTMD可以用于在链脲霉素(STZ)-诱导的糖尿病大鼠内单独和联合PDX1转运β细胞素(BTC)。靶细胞的转化导致了在BTC和PDX1处理的鼠中出现胰升糖素-染色细胞的原始胰岛-样团簇。在该研究中，处理后到30天团簇消失。虽然未观察到正常胰岛的再生，通过将胰腺腺泡细胞转化成具β细胞标记物的产生胰岛素细胞的UTMD后，糖尿病被逆转高达15天。
UTMD基因治疗对血糖、胰岛素和C-肽的影响。为了评估BTC基因治疗对糖尿病大鼠血糖和胰岛素的影响，18只大鼠经腹腔注射STZ(80mg/kg)后，用含有DsRed报告基因(非活性对照，n＝6)、BTC(n＝6)或BTC+PDX1(n＝6)的UTMD进行处理。其它六只对照，分为单独接受STZ而无UTMD基因治疗(n＝3)，或者既无STZ也无UTMD(正常对照，n＝3)。血糖基线为111±19mg/dl，且在不同组之间差异不显著。
如图1(上图)所示，所有经STZ-处理大鼠的血糖到第2天显著提高，而在STZ单独、DsRed报告基因、BTC单独处理大鼠的血糖到第10天都持续提高。然而，经BTC和PDX1同时处理大鼠的血糖从第3天到第5天降低，到第10天平均值低于200mg/dl。通过重复测量ANOVA，处理组间(F＝89.0，p＜0.0001)和血糖随时间变化的差异(F＝54.7，p＜0.0001)都在统计学上极其显著。通过Scheffe post-hoc测试，用BTC和PDX1共同处理的大鼠血糖在统计学上显著低于STZ单独、DsRed或BTC处理组(p＜0.0001)，但是与对照(p＝0.17)并无统计学差异。血液胰岛素水平基线为0.52±0.11ng/ml，不同组间无统计学差异。
如图2(下图)所示，相对于正常对照，所有经STZ-处理的大鼠到第3天胰岛素水平降低。然而，到第5天BTC/PDX1组的胰岛素水平高于正常组，尽管统计学上的差异不显著。通过重复测量ANOVA，处理组间(F＝15.4，p＜0.0001)和胰岛素随时间变化的差异(F＝18.9，p＜0.0001)都在统计学上极其显著。使用post-hoc Scheffe测试发现，与STZ单独(p＝0.0087)、DsRed(p＝0.024)或BTC(p＝0.015)单独处理组相比，BTC和PDX1共同处理的大鼠的胰岛素水平在统计学上显著更高，但是与对照(p＝0.99)相比，却无统计学差异。
为了证实检测的胰岛素是由UTMD处理产生的，测量在基线处和第10天的C-肽水平。如图2C所示，正常对照中的C-肽保持稳定，而STZ单独或者STZ与DsRed或BTC处理的大鼠的C-肽却降低。然而，第10天时BTC和PDX1共同处理的大鼠的C-肽却显著提高。通过重复ANOVA，处理组间的C-肽在统计学上差异显著(F＝10.5，p＝0.0004)。通过post-hoc测试，第10天BTC/PDX1组的C-肽水平与全部其它各组相比更高(p＜0.03)。
为了确定UTMD处理是否导致合成可调节葡萄糖的胰岛素，进行了糖耐受试验。如图3所示，STZ-处理的动物的葡萄糖耐受曲线明显异常，BTC单独处理的鼠也是如此。相反地，BTC和PDX1共同处理的大鼠的葡萄糖具有几乎正常的耐受应答。
胰岛形态学免疫组织学。图4显示了用FITC-标记的抗-胰岛素(绿色)和CY5-标记的抗-胰升糖素(蓝色)染色在第10天的代表性大鼠胰腺组织学样品。在低倍下(100X)，正常对照(左上图)每个区具有中间绿色抗-胰岛素染色外周蓝色抗-胰升糖素染色的3-4个胰岛，与正常胰岛的预期形态学一致。用STZ单独处理的大鼠(右上图)在第10天几乎没有可检测的抗-胰岛素染色，虽然在推测的胰岛残迹偶现模糊的抗-胰升糖素染色。在DsRed处理的大鼠中也有类似的发现(未示出)。BTC单独处理的大鼠(左中图)，每个区发现1-2个胰岛-样团簇，大多由少许胰岛素染色的胰升糖素-阳性(蓝色)细胞组成。高倍(400X)右下图所示的，用BTC和PDX1共同处理的鼠每个区显示具有主要由抗-胰升糖素染色的3-4个胰岛-样团簇(右中图)。此外，在100X下，抗-胰岛素染色似乎基本上是在外分泌胰腺。在更高倍下(400X，右下图)，发现许多非胰岛细胞显示出细胞质抗-胰岛素染色。
图5显示了不同处理组间的胰岛形态学差异。在对照组中普遍存在正常胰岛(每个切片46±9个胰岛)，但是在STZ-处理的组中罕见(每个切片＜3个胰岛)(p＜0.0001对对照)。在正常对照中不存在主要是胰升糖素-染色细胞的非正常胰岛-样团簇，仅在STZ处理后出现。在BTC和PDX1(每个切片19±8个团簇)处理的大鼠中出现这些异常胰岛，比STZ单独(7±2)、DsRed(11±4)或BTC单独(12±3)，(p＜0.02)处理的大鼠中更普遍。此外，与其它组相比，在BTC和PDX1处理的大鼠中，这些胰升糖素-染色细胞的胰岛-样团簇与更高的血液胰升糖素水平相关。在基线处，血液胰升糖素为95±12pg/ml，且各组间无差异。在第10天时，在BTC和PDX处理的大鼠中，胰升糖素提高到263±145pg/ml(F＝4.6，p＜0.014)，而在其它组中都没有显著变化。
外分泌胰腺内产生胰岛素细胞的免疫组织学。图4所示，为了进一步评估外分泌胰腺内产生胰岛素细胞是，使用具有FITC-标记的抗-胰岛素和DsRed-标记的抗-淀粉酶的共焦显微镜方法(图6，左图)。如左上图所示，在1000X下，如通过在这些细胞的细胞质中的FITC-结合抗-胰岛素抗体所测定的，存在胰岛素的主要表达。左下图显示了抗-胰岛素(绿色)和抗-淀粉酶(红色)的共焦图像，其中信号共定位并指示出这些是腺泡细胞。为了进一步证实腺泡细胞产生胰岛素，从4组大鼠中分离出腺泡细胞；正常对照、STZ单独和STZ之后通过带有BTC的UTMD单独处理以及与BTC和PDX1共同处理。随后为了大量β-细胞标记物，分离的腺泡细胞部分受到RT-PCR(图6，右图)。B-肌动蛋白，阳性对照，存在于所有组中，就像是Nkx6.1和neuroD。仅在受到BTC和PDX1共同处理的组中检测到大量标记物，包括INS-1、INS-2、胰升糖素、生长激素释放抑制因子、MIST-1、VMAT、神经元素-3和Nkx2.2。
腺泡细胞产生胰岛素的时间过程。在单独研究中，使用STZ处理6只大鼠后，随后通过带有BTC和PDX1的UTMD共同处理，为期30天。每隔5天测量血糖和胰岛素，在第20天和第30天时分别处死3只大鼠。如图7所示，到第30天时腺泡细胞的细胞质的抗-胰岛素染色消失，且伴有血清胰岛素的显著减少和血糖上升。此外，在第30天时未出现胰升糖素-阳性细胞的胰岛-样团簇。
虽然糖尿病的药理学治疗在持续改善，“严格”葡萄糖对照并不能消除糖尿病的破坏性并发症(7，8)，主要是因为可利用的药物并不重新组成正常胰岛的葡萄糖-调控功能。胰腺或胰岛移植可以实现这个目标，但是受到不充足捐赠者供应、需要抑制免疫反应以及移植的胰岛功能丧失的限制。因此，当前的研究努力集中于创造用于移植β-细胞新来源，或者在胰腺或其它组织内再生功能性β-细胞(3-5)。如本文所公开的，超声破坏微泡转运质粒用于对胰腺实施直接基因治疗。这些数据显示了在STZ-诱导糖尿病的大鼠中，共同使用BTC和PDX1的基因治疗可以通过将胰腺腺泡细胞转化成胰岛素生成细胞来恢复体内胰岛素产量和葡萄糖应答。虽然这些细胞表现出大量β-细胞标记物，并且恢复的胰岛素水平和葡萄糖控制持续到15天，但是在30天时消失。因此，术语“转化”而不是“分化转移”最好地描述了本文公开的使用超声破坏转运表达载体的微泡的结果。
众所周知，在部分胰腺切除(9)、STZ(10)或干扰素-γ(11)后会发生β-细胞量起源扩大，已成为最近争议的主题。Dor等人(12)认为在成年大鼠分娩或部分胰腺切除后，仅通过复制存在的β-细胞才可以形成新的胰岛。然而，Hao等人(13)最近的研究显示分离的人胰腺上皮细胞可以在体外或者当将胎儿胰腺组织注射到免疫缺陷鼠的肾囊中时再生β-细胞。本发明的组合物和方法用于刺激在非内分泌胰腺中的胰岛素产生。免疫组织化学用于定位产生胰岛素的腺泡细胞以及胰岛素和淀粉酶的表达。此外，当分离腺泡细胞切片时，在PDX1和BTC共同处理的大鼠中显示出含有几种β-细胞标记物，但是对照中却没有。这些观察，以及通过高剂量STZ处理完全破坏现有的β-细胞后，通过UTMD引入基因治疗的事实，使得β-细胞复制完全不可能解释这些发现。
之前已表明UTMD靶向体内胰腺的基因，使用胰岛素启动子来实现在胰岛内的选择性表达(4)。在本研究中，使用CMV和鼠胰岛素1启动子(RIP)启动子是因为预计后者在胰岛被链脲霉素(STZ)破坏后就不会再起作用。相反，推定CMV有助于起始β-细胞在非内分泌胰腺内再生(14)，且若有新的β-细胞开始产生胰岛素，那么RIP可以增强该过程。单独使用BTC和使用与PDX1组合以尝试再生β-细胞量。BTC是已表明在肠细胞(16)和肝细胞(17)内诱导胰岛素产生的促分裂素和β-细胞刺激激素(15)。PDX1是转录因子，其被认为是胎儿胰腺发育的总开关。虽然通过将腺泡细胞转化成β-细胞的基因重组来恢复正常胰岛素和C-肽水平，但是并不促进正常胰岛的再生。然而，本研究证明UTMD是一种单独或以各种组合将其它可能对于体内胰岛的再生有效的基因引入的可行方法。在成年动物内尤其相关，因为涉及胰岛再生的基因可能不同于那些已知的调控胚胎发育的基因。如Samson和Chan最近的综述(4)，潜在的候选基因包括INGAP、神经元素、neuroD、GLP-1、肠促胰岛素类似物(exendin)、胃泌素和EGF、Mafa、PAX6、Nkx2.2，Nkx6.1以及其它。
尽管以前已报道将腺泡细胞转化成β-细胞显型，然而仅表明在体外用EGF与胃泌素或白血病抑制因子处理分离的外分泌细胞，当其注射到糖尿病啮齿动物时，“被转化”成恢复血糖量正常水平的产生胰岛素细胞。相似地，在结扎胰腺管后，将胃泌素灌输到大鼠中诱导淀粉酶和胰岛素共定位的β-细胞的再生，指明腺泡细胞起源(21)。在随后的研究中，在四氧嘧啶-处理的鼠相同组发现起源于胰管细胞的β-细胞的再生(22)。本研究表明，将腺泡细胞转化成β-细胞显型对于正常胰岛素合成的恢复持续15天是可行的。本文还证实，使用本发明转化的细胞并不是由于β细胞的复制或是该细胞来源于胰管。到第30天这些腺泡细胞内分泌功能的丧失暗示这些细胞并没有完全“分化转移”，故本文使用的术语“转化”。这些细胞失去它们产生胰岛素能力的机制可以与体内质粒的限制性持续作用有关。其它载体的如慢病毒或辅助-缺陷腺病毒的用途可以用于取代质粒来增强转化的寿命。
最终，其它人已经成功使用基因治疗的方法以在肠或肝脏细胞内产生胰岛素(17，23-25)。本文教示的方法的一个优点在于，胰腺可能是用于胰岛再生的最理想的介质。最近，Hao等人(13)的研究支持了胰腺介质的概念，其中，当与胎儿胰腺组织一起被注射到小鼠肾囊中时，培养的人胰腺内皮细胞产生胰岛。推测胎儿胰腺组织含有胰岛再生的适当刺激。
实施例1.使用PDX1和BTC的基因治疗产生主要含有α-细胞并到第30天就消失的胰岛-样团簇。将腺泡细胞转化成葡萄糖-应答性的胰岛素生成细胞的能力首次显示出利用带有BTC和PDX1的UTMD以再生正常胰岛功能的能力。UTMD提供了检测糖尿病成年动物模型胰岛再生候选基因的体内非入侵性的方法。
动物协议和UTMD。动物研究根据NIH的推荐以及实验动物研究委员会的批准来进行。利用腹腔注射氯胺酮(ketamine，60mg/kg)和赛拉嗪(xylazine，5mg/kg)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(200～250g)。将左腹部和颈部的毛剃除，并将聚乙烯管(PE50，BectonDickinson，MD)通过切开插入到右颈内静脉。在第一次实验中，24只大鼠接受5种处理中的一种：1.未处理(正常对照大鼠，n＝3)；2.STZ(80mg/kg/ip，Sigma)单独，无UTMD(N＝3)；3.STZ和带有编码DsRed报告基因质粒的UTMD(n＝6)；4.STZ和带有编码大鼠BTC基因质粒的UTMD(n＝6)；5.STZ与带有编码BTC和PDX1质粒的UTMD(n＝6)。对于所有质粒的制备，一半的基因含有RIP启动子，另一半含有CMV启动子。通过泵(Genie，KentScientific)在20分钟内灌输微泡或对照溶液(用0.5ml PBS稀释的0.5ml)。
在灌输期间，使用市售的超声传感器(S3，Sonos5500，PhilipsUltrasound，Bothell，WA)定向超声到胰腺。在合适的位置夹紧探针。然后在机械指数为1.4的超谐波模式下应用超声(发射1.3MHz/接收3.6MHz)。在R波峰后，通过ECG使用延迟45-70ms，对每第四个收缩末期进行触发四次超声爆破。这些设置示出使用本仪器通过UTMD是最佳的质粒转运方法(26)。明显可见全部大鼠的微泡破坏。在UTMD之后，将颈静脉打结、缝合皮肤并使动物恢复。在固定于基线处过夜10小时后以及在处理后的第3、5和10天抽取血样。使用过剂量的戊巴比妥钠(120mg/kg)在第10天时处死动物。收集胰腺、肝脏、脾和肾脏用于组织学和通过Western免疫印迹检测PDX1和β细胞素蛋白的测试。使用血糖试纸(Precision，Abbott)测量血糖水平，使用RIA试剂盒(LincoResearch)测量血液胰岛素、C-肽和胰升糖素水平。
第二个实验方案的设计是评估腺泡细胞分化转移的时间过程，STZ-诱导糖尿病的6只大鼠利用含有PDX1和β细胞素的质粒的微泡进行UTMD处理。在UTMD处理后第5、10、15、20、25和30天获得葡萄糖、胰岛素、C-肽和胰升糖素的血样。在第20天时处死一半的鼠用于组织学(这些鼠没有第25天和第30天的血样)，其它一半的鼠在第30天被处死。
实施例2.含质粒脂质稳定微泡的制备。按照之前发明人描述的方法制备脂质稳定的微泡(6)。简言之，将250μl的DPPC(1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，Sigma，St.Louis，MO)2.5mg/ml的DPPE(1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，Sigma，St.Louis，MO)0.5mg/ml的溶液以及50μl的纯甘油加入装有2mg干燥质粒的1.5ml小瓶中，与20μg的地塞米松(dexamathasone)充分混合，并在室温下孵育30min。用全氟丙烷气体(AirProducts，Inc，Allentown，PA)将剩余顶部空间充填，随后使用牙科用汞合金器(dental amalgamator，Vialmix^TM，Bristol-Myers SquibbMedicalI maging，N.Billerica，MA)机械摇动30秒。用颗粒计数器(BeckmanCoulterMultisizerIII)测量微泡的平均直径和浓度。
质粒构建。用PCR从Sprague-DawleyDNA中扩增出大鼠胰岛素1启动子(RIP)片段(从-412到+165；genbank#：J00747)，所使用的PCR引物如下：
引物1(XhoI)5’-CAACTCGAGGCTGAGCTAAGAATCCAG-3’
序列ID号(SEQ ID NO.)：1；
引物2(EcoRI)5’-GCAGAATTCCTGCTTGCTGATGGTCTA-3’序列ID号(SEQIDNO.)：2。
大鼠PDX1和β细胞素cDNA的制备如下：新生大鼠的胰腺样品在液氮中瞬间冷冻，并在-86℃下保存。将冷冻的样品在1ml的RNA-STAT溶液中解冻，立即使用polytron3000组织均质器在10,000rpm下匀浆30s两次。根据制造商的说明，使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN)从标本中制备总RNA。使用具有oligo(dT)₁₆的SensiscriptRT试剂盒(QIAGEN)20μl中反转录RNA(30ng)。反应混合物在42℃下孵育50min后，随后进一步在70℃下孵育15min。使用9700PCR扩增仪(Gene PCR System9700，PEABI)对所有样品在含有2μl的cDNA，25μl的HotStarTaq MasterMix(QIAGEN)以及20pmol的各引物50μl体积中进行PCR：
大鼠PDX1cDNA引物(来自Genbank#：NM022852)；
5’AAGAATTCCCATGAATAGTGAGGAGCA3’(正义链)
序列ID号(SEQ ID NO.)：3；
5’AAGCGGCCGCTCAGCCTGCGGTCCTCACC3’(反义链)
序列ID号(SEQIDNO.)：4。
大鼠β细胞素cDNA引物(来自Genbank#：NM022256)；
5’AAGAATTCCGGTTGATGGACTCACT3’(正义链)
序列ID号(SEQIDNO.)：5；
5’AAGCGGCCGCCATTAAGTTAAGCAATAT(反义链)
序列ID号(SEQIDNO.)：6。
通过琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)纯化相应的PCR产物。利用二氯罗丹明荧光标记终止底物循环测序试剂盒(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)在ABI 3100遗传分析仪上对PCR产物进行测序。RIP片段用XhoI和EcoRI消化后连接到pDsRed-表达-1载体(BD Biosciences)的XhoI-EcoRI位点。PDX1和β细胞素的cDNA片段用EcoR1和Not1消化后连接到RIP或CMV操纵载体的EcoR1和Not1位点，并且连接反应在20ml的20mMtris-HCL、0.5mM的ATP、2mM的二硫苏糖醇和1单位的T4DNA连接酶中进行。质粒的克隆和分离都通过标准步骤进行。
腺泡细胞的分离和RT-PCR。按照前述的方法分离腺泡细胞(10)。简言之，将1克大鼠胰腺组织置于装有20mL RPMI-1640培养基的100mL烧杯中，该培养基中含有200U/ml的胶原酶、10mM的Hepes、5％的胎牛血清、100U/mL的青霉素，50μg/mL的链霉素和0.2mg/mL的大豆胰岛素抑制剂。用剪刀将组织剪成非常小的块后，转移到灭菌摇瓶中，在37℃下以150转/分钟的速度往复式振荡孵育40min。用孔径为100μm的尼龙纱布过滤腺泡细胞悬浮液。用含有10％FBA和4mM链脲佐菌素(用于耗尽剩余的β细胞)的RPMI-1640培养基在37℃下，5％CO₂中培养腺泡细胞2小时。收集细胞，提取总RNA并将其逆转成cDNA。使用基因扩增仪GeneAmp PCR System 9700(PE ABI)在含有1μl的cDNA，12.5μl的HotStarTaq Master Mix(QIAGEN)以及20pmol的各引物对所有样品进行PCR。通过测序来确定PCR产物。表1包括PCR寡核苷酸对的实例。
表1.PCR寡核苷酸(Oligos)