具有X染色体上纯合雄激素位点的人胚胎干细胞系 【技术领域】
本发明涉及受精卵来源人胚胎干细胞，具体是涉及一种具有X染色体上纯合雄激素位点的人胚胎干细胞系。
背景技术
人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hES)是由囊胚的内细胞团(inner cell mass，ICM)分离培养而来的，具有全能分化特性的细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在细胞治疗、胚胎发育、药物筛选、基因治疗以及遗传、表观遗传机制研究等领域具有很需要意义。人类胚胎干细胞研究始于1998年，它已成为继人类基因组计划后生命科学中最活跃的研究领域。近年来，胚胎干细胞的分离纯化、性能研究、培养扩增、诱导分化等有了突破性进展。1998年，美国威斯康星大学Thomson实验室利用36枚临床治疗不孕夫妇捐赠的新鲜或冷冻的囊胚，首次成功地分离、建立了5株hES细胞系(Thomson JA，Itskovitz Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem celllines derived from human blastocysts.Science，1998，282：1145-1147)。2000年，澳大利亚Monash University和新加坡大学生殖中心的专家合作，成功地从人囊胚建立了2株未分化的hES细胞系(Reubinoff BE et al.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation invitro.Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)：399-404.)。国内在2000年后，广州、湖南、北京、上海等医学科研单位相继开始了胚胎干细胞的研究。2002年，中山医科大学曾报道，他们使用5例人受精卵来源的囊胚初步建成了3个胚胎干细胞株(何志旭等。人胚胎干细胞系的初步建立.中华医学杂志，2002，82：1314)。2004年，日本和英国的科学家也都得到了hES细胞系(Suemori H etal.Establishment of human embryonic stem cell lines and their therapeuticapplication.Rinsho Byori，2004，52：254；Stojkovic M et al.Derivation ofhuman embryonic stem cells from day-8 blastocysts recovered afterthree-step in vitro culture.Stem Cells.2004；22(5)：790-7)。迄今国际上有美国、英国、新加坡、澳大利亚、瑞典、日本、中国、韩国等20余个实验室建有400株左右hES细胞公开发表的有关hES细胞建系的论著有300多篇(Guhr A，Kurtz A，et al.Current state of human embryonic stem cell research；anoverview of cell lines and their use in experimental work.Stem Cells.2006Oct；24(10)：2187-91)。讫今为止NIH登记的人ES细胞株超过60多株。
hES细胞在体外合适条件下，可以保持未分化状态和无限增殖能力，也可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞。由于干细胞具有以上特征，理论上可以成为人类细胞或者器官移植的来源，为人类疾病的治疗带来了新希望。近10年的发展，hES细胞培养技术日益成熟，为干细胞的临床的应用提供可能。利用hES细胞修复或替代因各种因素所造成的人体组织器官缺损和功能障碍是人类疾病治疗模式划时代的革新。用于细胞替代治疗的hES细胞必须具备安全性、有效性、免疫豁免性三大特点，因而国内外很多研究集中于以下课题：(1)纯化hES细胞培养环境，避免动物源性物质的污染；(2)hES细胞诱导分化为各种成体细胞及其前体细胞以及移植；(3)体细胞核移植与ntES细胞系的建立；(4)人孤雌胚胎干细胞系的建立；(5)hES细胞的表观遗传学变化，如印记基因及甲基化水平、X染色体失活的检测等；(6)hES细胞与基因治疗。
我国人类胚胎干细胞(hES)建系的来源与培养方法主要有以下几种：
(一)、hES系的主要来源为体外受精囊胚，细胞核移植胚胎及早期发育的桑椹胚和人孤雌胚胎分离培养的hES系。
囊胚法
囊胚内细胞团(Inner cell m ass，ICM)是分离hES的最常用材料。将人工受精的胚胎或正常体内受精的胚胎培养至囊胚，分离培养出ICM，进一步分离培养增殖的ICM，得到hES细胞集落，传代增殖并检测后即得到hES细胞系。目前所建立的hES系基本上都是由人工体外受精培养至囊胚期的ICM分离培养得到(Baharvand H，A sh tiani S K，V alo jerdiM R，et al.Establishment and in v itro differentiation of a new embryonic stem cell linefrom human blastocyst[J].D ifferentiation，2004，72(5)：224-229.；Verlinsky Y，Strelchenko N，Kukharenko V，et al.Human embryonic stemcell lines w ith genetic diso rders[J].Rep rod Biomed Online，2005，10(1)：105-110.)。其具体技术路线为：囊胚→脱透明带(Tyrode酸或链蛋白酶或机械法)→去滋养层细胞(免疫外科法或酶消化法)→纯化的ICM→适宜的饲养层上扩增ICM→离散增殖的ICM为小细胞团块→重新接种在饲养层上培养→离散hES细胞集落为小细胞团块→接种在饲养层上传代培养→出现多个hES样集落→在饲养层上或无饲养层扩大培养→鉴定→建立hES系。ICM的分离是一大难点。分离ICM的方法主要有免疫外科法和机械法两种。目前大多数hES细胞系都是采用免疫外科方法，用特殊的抗体，例如BeWO细胞的单克隆抗体，抗人的全血清，或者红细胞抗体从囊胚中分离出ICM细胞。这些抗体与滋养层细胞表面的主要组织相容性抗原(major histocompatibilitycomplex，MHC)结合形成免疫复合物，在补体存在时可导致滋养层细胞发生免疫溶解，从而得到ICM细胞。但免疫外科法存在动物源性污染问题，在很大程度上存在传播动物疫病和产生异种免疫排斥的风险。尽量减少动物源性污染，改善胚胎干细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得胚胎干细胞的方法已成为现今各国研究的重点。
(二)、建立和维持hES系的条件
饲养层
饲养层是建立和维持ES细胞系的必要条件。大部分已分离得到的人hES细胞系均是在饲养层条件下建立和维持的。有研究表明，小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic f ibroblast，MEF)作为建立hES系的饲养层是有效可行的(Daylon J，A riel J L，Daniel B，et al.nodal signaling isnecessary fo r themaintenance of p luripo tency in human embryonic stemcells[J].Development，2005，132：1273-1282.)。由于MEF为异源细胞，用其培养hES存在传播病原体和造成异种蛋白污染的危险。因此，人们在尝试用其他饲养层来替代MEF，如人胚胎成纤维细胞(RichardsM，Fong C Y，ChanW K，et al.Human feeders suppo rt p ro longed undifferentiated grow th of humaninner cell masses and embryonic stem cells[J].N at Bio techno I，2002，20(9)：933-936.)、包皮成纤维细胞(Prow se B，M cQ uade L R，BryantK J，et al.A p ro teome analysis of conditioned media from human neonatalfibroblasts used in the maintenance of human embryonic stem cells[J].Proteom ics，2005，5(4)：978-989.)以及商品化的成人和胎儿成纤维细胞(RichardsM，Tan S，Fong C Y，et al.Comparative evaluation of varioushuman feeders for pro-longed undifferentiated growth of humanembryonic stem cells[J].Stem Cells，2003，21：546-556.)。人源饲养层细胞在一定程度上能替代MEF，作为hES的饲养层细胞。人类饲养层细胞在体外可以连续传代，不仅较MEF可以节约大量时间，而且用同一材料作饲养层相对较不同批次地MEF稳定。另外，还可避免用STO或MEF培养hES时存在异种蛋白污染等危险。
培养基组成
hES系的培养基组成一般采用高糖DM EM培养液，添加15％～20％的胎牛血清(FBS)或血清替代品(SR)和其他一些微量营养成分(如非必需氨基酸、谷氨酰胺等)、抗氧化剂(如2巯基乙醇(2-M E))和抗生素等。多数研究认为，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FBS或SR在hES培养中具有重要作用(Jo sél，Karin，M arie G M A，et al.Derivation of human embryonicstem cell lines in serum replacement medium using postnatal humanfibroblasts as feeder cells[J].Stem Cells，2005，23：544-549.)。多数研究认为，bFGF是hES自我更新和维持未分化状态所必需的。目前，hES研究重点在于筛选使胚胎干细胞保持在未分化状态的最佳培养体系；检验得到的胚胎干细胞生物学特性是否稳定。
hES系的生物学特性及鉴定方法
hES体积小，核大而明显，有一个或多个核仁，核质比高。hES细胞在体外培养时呈集落状生长，呈相对松散、扁平状集落，集落内细胞界限隐约可见。hES具有正常稳定的二倍体核型和带型。hES细胞的碱性磷酸酶活性呈阳性，已分化的细胞呈弱阳性或阴性。hES表达的人早期胚胎阶段特异性抗原有：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。hESCs还表达Oct4、Fgf4、H2az、Foxd3、Nanog和Sox2等与多能性有关的关键蛋白(Lee J B，Kim J M，Kim S J，et al.Comparative characteristics of three human embryonic stem cell lines[J].Mo I Cells，2005，19(1)：31-38.)。另外，hES具有高端粒酶活性及向3个胚层细胞分化的潜能。hES的生物学特性为自我更新及全向分化。
hES分子遗传、表观遗传学研究
基因组印迹是某些等位基因的表观遗传修饰，与胎儿发育异常及肿瘤生长有关。在个体发育不同时期，基因组印迹状态不同。已有研究表明，鼠胚胎干细胞基因组印迹异常或不稳定(Kirn JH，Auerbach JM，Rodriguez2Gomez JAet al.Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in ananimal of Parkinson’s disease[J].Nature，2002，418(6893)：50256.)；但另一组研究者则发现人和小鼠EG细胞的基因组印迹基本正常，这可能为胚胎干细胞临床应用排除了一大障碍(Humpherys D，Eggan K，Akutsu et al.Epigenetic instability in ES cells and cloned mice[J].Science，2001，293(5527)：95297)。对印记基因、甲基化等表观遗传学变化在hES细胞(Bo WenSun，A.Cong Yang et al.Temporal and parental-specific expression ofimprinted genes in a newly derived Chinese human embryonic stem cell lineand embryoid bodies Human Molecular Genetics，2006，Vol.15，No.1 65-75)的研究目前已成为现今各国在胚胎干细胞领域研究的热点。分子遗传学在核型变化、纯合子变异、同源交换等方面对胚胎干细胞的研究也具有重要意义。
X染色体失活是表观遗传机制的一个重要部分，这种现象在1961年就有了LYON假说，即：(1)雌性哺乳动物细胞内只有一条X染色体有活性，另一条失活并固缩；(2)失活发生在胚胎早期(囊胚期)；(3)失活是随机的，即失活的X染色体既可来自父亲也可来自母亲，一个细胞某条X染色体一旦失活，由该细胞繁衍而来的子细胞都具有同一条失活的X染色体。
X染色体失活的选择和启动发生在囊胚期，这个过程由X失活中心(XIC)控制，XIC是一个顺式作用位点，包含辨别X染色体数目的信息和XIST基因，前者可保证仅有一条染色体有活性，但机制不明，XIST基因缺失将导致X染色体失活失败。X染色体失活的过程为：XIST基因编码XISTRNA，它转录后被包裹在合成它的X染色体上，随后XISTRNA在X染色体上积累并不断扩展，接着一对基因沉默有重要功能的因子再被招募来，包括PCG蛋白EED和ENX1。这些蛋白在失活的X染色体上组成暂时的位点，立即诱导DNA甲基化和组蛋白修饰的发生，这对X染色体失活的建立和维持有重要的作用。失活的染色体依旧持续合成XISTRNA，维持本身的失活状态。
人类基因组DNA有3×109bp，其中10％是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复片段的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星序列。其中重复片段为2-7bp组成的称为微卫星，又称为短串联重复序列(Short TandemRepeat，简称STR)，不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成极其复杂的等位基因片段长度多态性。一般认为，人类基因平均每6～10kb就有1个STR基因座，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。在实践中，联合使用多个STR可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，可以在很高概率水平上认定嫌疑人以及进行亲缘关系鉴定。因此，STR基因座的PCR分型因其高灵敏度，高效率的实用特点，目前已成为国内外法医个体识别和亲子鉴定最主要的技术。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种具有X染色体上纯合雄激素位点的人胚胎干细胞系，该人胚胎干细胞系具有两条X染色体，且其X染色体上雄激素位点为纯合性，并且具有独特的短串联重复序列(STR)，此类细胞及其衍生物在今后潜在的应用中具有唯一识别的特征。
本发明所述的具有X染色体上纯合雄激素位点的人胚胎干细胞系，其特征在于：
(a)所述胚胎干细胞系的平均群体倍增时间为约32小时；
(b)所述胚胎干细胞系的未分化克隆碱性磷酸酶即AKP检测为强阳性，具有较高的碱性磷酸酶活性；
(c)所述胚胎干细胞系能表达以下特异性表面抗原之一：阶段特异性抗原-3即SSEA-3，阶段特异性抗原-4即SSEA-4，肿瘤反应抗原-1-60即TRA-1-60，以及肿瘤反应抗原-1-81即TRA-1-81，而不表达阶段特异性抗原-1即SSEA-1；
(d)所述胚胎干细胞系能表达八聚体结合转录因子4即Oct-4转录因子，保持未分化特性；
(e)所述胚胎干细胞系每隔10代进行一次核型分析，具有正常核型；
(f)所述胚胎干细胞系具有两条X染色体，X染色体失活分析显示其X染色体上雄激素位点为纯合性；
(g)所述胚胎干细胞系具有独特的短串联重复序列。
本发明中，选取了人类雄激素受体基因(Human androgen receptor gene)来分析X染色体失活的状态。人类雄激素受体基因第一外显子包含高多态性三核苷酸重复序列。研究表明在离这些核苷酸重复序列大约100bp远的地方甲基化的Hpall and Hhal位点和X染色体失活有关。本实验中选用甲基化特异性PCR来分析X染色体失活的状态。(Takeo Kubota et al(1999)A newassay for the analysis of X-chromosome inactivation based onmethylation-specific PCR.Hum Genet 104：49-55)。在正常女性及拥有女性核型的人胚胎干细胞中，X染色体的失活应该是随机发生的，本发明得到的是X染色体上雄激素位点为纯合性的一株人类胚胎干细胞系。
本领域所熟知，正常女性拥有两条X染色体(一条是父系来源，另一条是母系来源)，而男性只有一条。为了平衡两条X染色体基因表达，女性的一条X染色体会发生失活，其上的基因均不表达。这种失活现象发生在胚胎早期，是随机的，即既可以是父亲来源的X染色体失活，也可以是母亲来源的X染色体失活。在每个细胞，这种选择是独立的，从总体来看，父系和母系X染色体失活的比例为50％对50％。在一些无症状的X连锁疾病中，可以发生非随机的X染色体失活，即在所有的细胞中，均为来自父系的X染色体失活或均为来自母系的X染色体失活，或者这些失活比例极端不平衡，至少达到90％比10％，业内称这种失活为非随机的X染色体失活。理论上拥有XX核型的胚胎干细胞正常情况下应该是随机失活，且甲基化特异性PCR检测结果应显示：活性X染色体和失活X染色体有两个片段不同但面积近似相等的峰，但本发明所述的胚胎干细胞其活性X染色体和失活X染色体均出现同一个峰，揭示此株人胚胎干细胞X染色体上雄激素位点为纯合性(见图6)。
本发明中，进行STR分型所采用的是Promega公司的荧光标记16基因座复合扩增体系，鉴定能力已达10-17，无论用于个体或亲缘关系鉴定都足以作出认定结论。这16个位点包括美国FBI推荐用于建设国家DNA数据库(Combined DNA index System，CODIS)的13个基因座，即D3S1385、TH01、D21S11、D18S511、VWA、D8S1179、TPOX、FGA、D5S818、D31S317、D7S820、D16S539、CSF1PO(这13个位点已成为国际公认的用于法医学STR分型的基因座)，以及Penta E、Penta D和一个性别位点Amelogenin。
短串联重复序列(STR)分析是利用个体间存在不同短串联重复序列扩增片断的特性来鉴定，人类基因基因组DNA中每6-10KBb就有一个STR位点，其多态性成为法医物证和亲子鉴定的丰富来源。胚胎干细胞由于是从不同的受精卵来源建立的，其遗传背景也不一样，STR位点分析可以明确地将不同的胚胎干细胞株区别开来，我们发明的此株胚胎干细胞具有不同的STR位点特征，能和其他人胚胎干细胞系加以鉴别(见图4)。
本发明获得具有X染色体上纯合雄激素位点的人胚胎干细胞系，此类细胞及其衍生物在将来可能的表观遗传学机制研究、人类胚胎干细胞的临床应用、对女性X染色体相关疾病模型的建立，以及由此类细胞诱导产生的分化细胞在临床应用上的可行性评估提供了理想的细胞模型。
【附图说明】
图1显示的是FY-hES7细胞系的一个克隆成长过程，依次是第1天、第2天、第3天及第4天的克隆大小，计算得该克隆的倍增时间为31.25小时(100X标尺＝100um)。
图2是人胚胎干细胞FY-hES7的干细胞生物特性结果图，自左至右分别显示AKP、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81的生物特性；
图3显示FY-hES7及其他两株细胞系均能表达Oct-4转录因子(B-D)，保持未分化特性，FY-hES-1作为对照也表达Oct-4转录因子(E)，F为管家基因β-actin的表达。Oct-4是ES细胞维持自我更新的重要基因，未分化的ES克隆能够高表达。图3中，A：分子量标准Marker；B：FY-hES-5 OCT-4表达；C：FY-hES-7 OCT-4表达；D：FY-hES-8 OCT-4表达；E：FY-hES-1 OCT-4表达；F：阳性参照β-actin。
图4显示人胚胎干细胞FY-hES-7的STR结果；图中显示，人胚胎干细胞FY-hES-8拥有独特的STR位点，分别是在D3S1358位点上表达15，17号峰，TH01位点上表达8，9号峰，其他依次为D21S11：29，30；D18S51：12，14；PENTA E：12，14；D5S818：7，13；D13S317：10，11；D7S820：9，10；D16S539：11，11；CSF1PO：9，11；PENTA D：12，12；VWA：14，14；D8S1179：11，16；TPOX：8，9；FGA：22，23。
图5是人胚胎干细胞FY-hES-7的核型图其核型为46，XX。
图6是人胚胎干细胞FY-hES的体内分化结果图，自上至下分别显示分化为角化鳞状上皮组织(外胚层)、神经组织(外胚层)、软骨组织(中胚层)、脂肪组织(中胚层)、腺体上皮组织(内胚层)。
图7a是人胚胎干细胞FY-hES-7的X染色体失活分析图，上图为X染色体失活产物图，下图为活性X染色体产物；图中显示：其活性状态的X染色体和失活状态的X染色体均表达同一个峰197bp。
图7b是正常女性血DNA的X染色体失活分析图，左侧为X染色体失活产物图，右侧为活性X染色体产物图，显示其失活状态的X染色体是随机的。失活的X染色体有194bp和207两个峰，而活性的X染色体也有194bp和207bp两个峰，且两个峰面积比接近1∶1。
【具体实施方式】
一、人胚胎干细胞系的建立
材料
1.胚胎来源
医院生殖中心提供的胚胎细胞库，均为在体外授精(IVF)或单精注射(ICSI)后第三天，不适宜进行胚胎移植或冷冻的低质量胚胎，经捐赠夫妇知情同意后用于本实验。
2.主要仪器
CO2培养箱(Forma)、解剖显微镜(Olympus)、普通倒置显微镜(Nikon)、离心机(KUBOTA 21000)、恒温水浴锅(H.H.S-11.2，上海医疗器械三厂)、电子分析天平(Startorius)、普通冰箱(海尔)、-80℃低温冰箱(Forma 725)、液氮罐(MVE，美国)Millipore纯水仪(Purelab maxima.美国)、移液枪(Eppendorf，德国)、眼科手术器械(浙江省华东医药公司)、超净工作台、组织培养板、培养皿(Falcon)、分装管、锥形离心管(NUNC)。
3.主要试剂：
4.溶液配制：PBS缓冲液、DMEM液、0.1％明胶、丝裂霉素-C贮存液、胶原酶IV贮存液、bFGF贮存液、MEF培养液、囊胚优化培养液、phES培养液、phES冻存液等，参照《干细胞手册＝Handbook of stem cells》(Lanza，R等编，裴雪涛教授等编译。-北京：科学出版社，2006)。
方法
1.小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)的分离培养
1.1取妊娠13.5-14.5天的昆明白孕鼠，采用颈椎脱臼法处死，无菌条件下剖腹取出子宫，置于PBS液中反复冲洗，去除血污。
1.2剪开子宫壁取出胚胎，去除头、四肢、内脏后，剪碎鼠胚组织，移入3～4个15ml的离心管中，加入2倍体积的0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，37℃水浴消化8min，用吸管反复吹打，弃去第一次消化的上清液。
1.3再加入2倍体积的0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，37℃水浴消化5～8min，用吸管反复吹打，静置2min吸取上清液，移入盛有培养液的离心管中终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，加入新培养液。
1.4重复1.3步骤5～6次，直至大部分组织细胞消化下来。
1.5收集所有离心后的细胞沉淀于同一个离心管中，再次离心弃上清，加入新培养液，调整细胞密度为4×105/ml，接种于培养皿中，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，2～3天换液1次；待细胞达到90％汇合时，可传代培养、冻存或制作饲养层。
2.饲养层细胞的制备
2.1当第1～3代MEF细胞生长连成一片时，在培养上清中加入丝裂霉素-C，使终浓度为10μg/ml，放回培养箱作用2.5hr。
2.2将0.1％明胶水溶液吸入培养皿内，以能覆盖培养皿表面即可，放回培养箱作用0.5hr以上；使用前，吸弃多余的明胶水溶液，超净台风干备用。
2.3弃含有丝裂霉素-C的MEF细胞培养上清液，用PBS洗涤三次。
2.40.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA液消化1min后，加入培养液吹打洗脱细胞，用培养液制备成4×106个/ml密度的细胞悬液，种植到预先用明胶处理过的培养皿内。
2.5在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内培养。
2.6将制备好的饲养层皿放置在培养箱内备用(可在1～3d内使用)，使用前提前4～24h更换为胚胎干细胞培养液。
3.囊胚培养
3.1囊胚的序贯培养：
3.1.1配制G2.3培养液：在4.75ml的G2.3培养基内加入0.25ml的HSA(浓度为5％)，用移液枪在35mm的培养皿中做35μl的微滴，覆盖矿物油，37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内平衡过夜。
3.1.2将生殖中心D3废弃的胚胎由G1.3微滴中转入G2.3培养液中清洗3次后，再转到新鲜G2.3微滴中培养；每天观察胚胎发育情况直至D7，并且对形成的囊胚进行分级。
3.2囊胚的优化培养
3.2.1配制囊胚优化培养液：取上述配制G2.3培养液1ml加入2000ul的hLIF以及10ng的bFGF，用移液枪在35mm的培养皿中做35μl的微滴，覆盖矿物油，37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内平衡过夜。
3.2.2生殖中心D3废弃的胚胎转到G2.3微滴中培养至D5，再转入囊胚优化培养液滴中培养；每天观察胚胎发育情况直至D7，并且对形成的囊胚进行分级(参照Gardner囊胚分级法)，囊胚根据内细胞团数目的多少可分为A、B、C三级：A级、ICM细胞数目多且排列致密，大小明显可见；B级、ICM细胞数目少且排列疏散，大小可见；C级、ICM细胞数目很少，几乎不见。
4.ICM的分离
4.1机械分割法：
4.1.1制作切割针：将外径90μm、内径70μm的玻璃管的中部在酒精灯的外火焰上拉成两段。再将拉出的玻璃针细部在酒精灯的内火焰拔尖，使细部均匀缩小，拉出长约1cm、中部直径约30μm的纤细针锋。
4.1.2去除透明带：囊胚放入pronase(0.5mg/ml)中，洗涤2遍后，转入另一滴pronase中，在解剖显微镜下观察囊胚透明带的变化，大约1～2min后，见透明带开始溶解后立即转到hES培养液滴中，洗涤2-3遍。如囊胚孵出则直接在hES培养液滴中洗涤。
4.1.3机械分离ICM：去透明带的囊胚转入hES培养液滴，在解剖镜下左手用1ml注射器针头(29G)压住囊胚内细胞团的对侧予以固定，右手用自制的玻璃细针(30μm粗细)在ICM的两侧切割去除外滋养层。
4.1.4分离后的ICM用口吸管转入hES培养液滴内清洗三遍后，接种到提前一晚制作的MEF饲养层上。
4.2免疫外科法
4.2.1去除透明带：同4.1.2
4.2.2抗体结合：将去除透明带后的囊胚移入抗人全血清(1∶50)中，孵育30min，立即转入hES培养液滴充分洗涤3遍。
4.2.3补体结合：抗体作用过后的囊胚转移至新鲜豚鼠血清(补体)中，孵育30min，处理过程中随时观察，当滋胚层细胞膨大，呈透明空泡状即终止处理，转入hES培养液滴内，用细吸管反复吹打去除外滋养层细胞。
4.2.4分离后的ICM在hES培养液滴内洗涤3遍后，接种到提前处理制作的MEF饲养层上。
5.原代克隆的培养
5.1hES培养液的配制
K-DMEM+15％SR+5％FBS+其它。
5.2.原代克隆的观察
ICM接种后前5天静置不动，以免影响ICM的贴壁；第5天予以半量换液并在解剖镜下观察ICM的生长情况，培养至第10天时，根据巢式克隆的大小及外周滋养层细胞的多少分为A、B、C三类：
6.hES细胞的传代方法比较
原代培养10-12d后，用玻璃细针在原皿内将克隆机械地分成3-4块，然后将小细胞团用口吸管转入新的MEF饲养层上进行首次传代。首次传代再培养4～5天，克隆增至1～2mm大小后，按照1∶2～1∶3的比例进行传代。传代可用机械法、胶原酶IV消化及胰酶消化传代法，具体如下：
6.1机械传代
6.1.1在解剖显微镜下用自制玻璃细针，在ES克隆表面先后进行纵向与横向的分割，将克隆分离为100×100μm大小的细胞团块。
6.1.2用拉制的巴斯口吸管将分离后的细胞团块转移至新制的饲养层上，并左右摇晃培养皿使克隆均匀分布；每天观察、记录ES细胞生长情况。
6.2胶原酶IV消化传代
6.2.1弃原培养液，用DPBS洗涤1次，加入浓度为1mg/ml胶原酶IV，用量以能覆盖细胞为度，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养15～20min。
6.2.2弃消化液，轻敲培养皿底部，加入适量培养液终止消化，用吸管轻轻吹打使大部分细胞从皿底脱离。
6.2.3收集细胞悬液于一10ml的离心管中，加hES洗液至5ml，1000rpm，离心4分钟。
6.2.4弃上清夜，加入适量培养液，将细胞沉淀小心吹打均匀，转移至新制的饲养层上扩大培养，每天观察、记录ES细胞生长情况。
6.3胰酶消化传代
6.3.1弃原培养液，用DPBS洗涤1次，加入适量浓度为0.05％的胰酶，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中作用5min。
6.3.2余步骤同6.2。
7.hES细胞的冻存复苏(慢速冻存一快速复温法)
7.1冻存hES细胞
加入浓度为1mg/ml胶原酶IV，在37℃作用15～20min后，轻轻吹打成小细胞团，离心1000rpm×5min，弃上清，加入冻存液混匀；调整细胞浓度为106个/ml，分装入冻存小管，每管0.5ml，4℃30min，-80℃过夜，次日投入液氮中长期保存。
7.2复苏hES细胞
从液氮罐中取出冻存管，立即投入37℃的温水中快速晃动，直至只有一小块冻存液未融解。将细胞冻存悬液转入盛有5ml培养液的无菌离心管，1000rpm离心5min.弃上清，加入培养液，轻轻吹打混匀，将细胞接种于预先制备的饲养层上培养。
结果
1.由废胚来源的囊胚，在序惯培养体系中培养至第7天(D7)，大多为低级囊胚，表现为囊腔小，内细胞团小或无，不利于hES建系。在囊胚优化培养体系中培养至D7天发现囊腔明显扩张，ICM细胞数目增多且致密；但继续培养至D8囊腔皱缩，腔内出现大量碎片，ICM较前增大但色泽黯淡，接种到饲养层后不能贴壁生长，提示囊胚在体外培养时间不应超过7天。
2.废胚来源hES细胞系的建立
本实验采用K-DMEM+20％SR+5％FBS组培养液培养的11枚ICM中，有9枚ICM贴壁，获得5枚A、B级原代克隆，进行传代后其中4枚传至2-6代便逐渐黯淡、溶解直至死亡；最终建立了1株hES细胞系。新建立的hES细胞系在饲养层上均形成扁平的圆形集落，结构致密，边缘清楚，高倍镜下可见克隆的单个细胞间隙清楚，核质比高、核仁清晰。此株hES细胞系均能反复冷冻复苏，保持未分化状态，复苏率大约为25％～40％。
hES生物学特性检测
材料
细胞来源
1.本发明人所在实验室建立的hES细胞系。
2.实验动物
6～8w龄雄性SCID小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司。
3.仪器
荧光倒置显微镜(Nikon)、3100 Genetic analyzer(美国ABI公司)、PE9700PCR扩增仪(美国ABI公司)、UVP紫外成像系统、电泳仪(Biometra)
4.试剂
Trizonl试剂(上海闪晶分子生物科技有限公司)、Qiagen One Step forRT-PCR Kit(Qiagen)；ES Cell Characterization Kit(SCROO1，Chemicon)；Human Embryonic Germ Layer Characterization Kit(SCRO30，Chemicon)；GOAT ANTI MOUSE IgG-FITC、GOAT ANTI MOUSE IgM-FITC(Santacruz)；Promega PowerPlex 16 System kit(Promega，USA)。
方法
1.hES细胞群体倍增时间(population doubling time，PD time)检测
hES细胞采用1mg/ml的胶原酶消化传代并低密度接种，用标记笔在每个培养皿的底部标记约5个克隆，于接种后的第1天开始，每隔24小时照相测量同一个ES克隆大小，直至第4天。按照公式PD(hour)＝ΔtxLg2/(LgNt-LgN0)来计算其倍增时间，至少计算三个PD值，然后求平均值。
2.hES细胞特异性标志物鉴定
2.1碱性磷酸酶检测(AKP染色)
人胚胎干细胞培养至第20代时，进行碱性磷酸酶检测(AKP染色)：去培养液用4％多聚甲醛固定15分钟后，TBST液冲洗2次，加入碱性磷酸酶孵育液，室温下孵育30分钟至染色满意时，TBST液冲洗，光镜下观察结果。
2.2人类胚胎干细胞表面抗原鉴定
2.2.1hES细胞传代培养至第4天，生长旺盛时终止培养，4％多聚甲醛固定20min。
2.2.2TBST冲洗2次，每次5-10min
2.2.30.1％Triton X-100/PBS作用10min
2.2.4TBST冲洗2次，每次5-10min。
2.2.5加入4％山羊血清阻断封闭非特异性抗原，室温下孵育30分钟。
2.2.6加入一抗SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81(用4％山羊血清1∶50稀释)，室温孵育1小时。
2.2.7TBST冲洗3次，每次5-10min。
2.2.8用4％山羊血清1∶100稀释FITC标记的二抗，室温孵育30min。
2.2.9TBST冲洗3次，每次5-10min。
2.2.10PBS覆盖，荧光显微镜观察染色结果。
3.RT-PCR检测hES细胞中Oct-4转录因子的表达
3.1Trizol试剂盒分离提纯总RNA
3.1.1各取10个hES克隆细胞团，加入0.5ml的TriZOL，充分混匀，室温静置5min。
3.1.2再加入100μl的氯仿，充分混匀，室温静置5min。
3.1.34℃，10000rpm离心15min。
3.1.4取上清液，加入250μl的异丙醇，充分混匀室温静置5min。
3.1.54℃，10000rpm离心10min。
3.1.6弃上清液，加入75％的酒精500μl，4℃，10000rpm离心10min。
3.1.7弃上清液，室温干燥，再加入25μl的DEPC水，混匀。
3.1.8紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。
3.2一步法RT-PCR检测Oct-4的表达
3.2.1引物设计：OCT-4Primer A：5’-GTGTTCAGCCAAAAGACCATC-3’，Primer B：5’-CCCTGAGAAAGGAGACCCA-3’
3.2.2RT-PCR反应体系
50μl反应体系，具体组成如下
RNase-free water 26.0μl
RT-PCR Buffer 10.0μl
dNTP Mix 2.0μl
Primer A 3.0μl
Primer B 3.0μl
RT-PCR Enzyme Mix 2.0μl
Template RNA 4.0μl
3.2.3RT-PCR反应扩增条件
逆转录反应 30min 50℃
PCR起始步骤： 15min 95℃
以下步骤循环36次
变性： 1min 94℃
退火： 1min 56℃
延伸： 1min 72℃
最后延伸： 10min 72℃
3.2.4配制1.5％琼脂糖凝胶，电泳30min，观察扩增条带，记录结果。
4.染色体核型分析
4.1选择培养至第10代以后，处于指数生长期的hES细胞进行核型分析；加入秋水仙素(终浓度为0.25μg/ml)以抑制分裂期细胞停止于分裂中期，置培养箱继续培养4小时。
4.2用吸管吹打，使大部分圆形的分裂中期细胞从皿底脱落，将培养液转入离心管内，再用PBS清洗一遍后，加入适量0.05％胰蛋白酶液作用5min，加入培养液反复吹打，收集细胞悬液1000rpm离心5分钟，弃上清液，留沉淀细胞。
4.3往细胞沉淀加37℃预温的0.4％枸橼酸钠与0.4％KCl(1∶1)的低渗液，用吸管吹打均匀，在水温箱中静置5分钟。
4.4向低渗处理后的细胞悬液中加新鲜配制的甲醇与冰醋酸(3∶1)固定液0.5ml，用吸管轻轻吹打调匀进行预固定，1000rpm离心5分钟。
4.5弃上清液加固定液4ml，轻轻吹打，封口后室温静置40分钟，1000rpm离心5分钟。
4.6弃上清液加固定液2ml，轻轻吹打，封口后室温静置20分钟，1000rpm离心5分钟。
4.7吸弃掉大部分上清液，留0.5ml左右上清夜及细胞沉淀，混匀后取1-2滴滴片，置65℃烤片过夜。
4.8制备好的染色体制片于0.25％胰酶消化G显带后，用新鲜配置的10％吉姆萨染液染10min，流水冲洗干净，于燥。
4.9高倍镜下分析20～40个分裂中期细胞的染色体核型，采用Leica染色体分析软件观察结果，发报告。
5.个体识别(STR位点分析)
采用Qiagen法提取基因组DNA，进行PCR扩增，产物在ABI 3100遗传分析仪上进行毛细管电泳，分析16个短串联重复位点做个体识别。16个位点为：D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、PentaE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、PentaD、amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、FGA。
6.体内外分化能力检测
6.1体外分化能力检测
6.1.1拟胚体形成：生长旺盛的胚胎干细胞用0.05％胰酶作用3分钟，加入拟胚体培养液，轻轻吹打成小细胞团，转入细菌培养皿内悬浮培养，3天后更换至新的细菌培养皿；此后每2天换液1次，至拟胚体形成。
6.1.2自发分化：培养7天后将形成的拟胚体转入0.1％明胶包被的培养皿内贴壁培养2周，观察其分化现象。
6.1.3自发分化培养4天后，采用三胚层细胞特异性抗体来检测分化细胞抗原表达情况，这些抗体是：人平滑肌激动蛋白(用于检测骨和肌肉细胞相关抗原，中胚层)，甲胎蛋白(用于检测肝细胞等相关抗原，内胚层)和波形蛋白(用于检测神经细胞相关抗原，外胚层)。
6.2体内分化能力检测
6.2.1畸胎瘤形成：胚胎干细胞消化离心后，制成1×106/ml的细胞悬液，接种到6周龄雄性SCID小鼠的腹股沟皮下和腹腔内。4周后，观察是否有肿瘤生长；10～12周后，处死小鼠，摘除肿块进行如下分析。
6.2.2组织学检查：肿块经10％中性福尔马林固定24h后；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；石蜡包埋；连续5pm切片，经65℃恒温烤箱6h烘干；逐级脱蜡、水化；苏木素染色5min，水洗；盐酸酒精分色30sec，水洗；伊红染色5min，水洗；逐级脱水、透明，中性树胶封片，镜下观察组织细胞形态。
结果
1.hES细胞系的平均PD时间
对此株hES细胞系进行监测3个克隆的生长速度，并计算其平均倍增时间，记录如下表：
表1：此株hES细胞系的三个克隆平均PD时间
克隆 1 2 3 PD时间(小时) 32.75 32.25 31.50
由上表可以看出，此株hES细胞系的PD时间大体相同，都在32小时左右，提示hES细胞每隔32小时就能扩增一倍。
2.干细胞特异性标志物鉴定
此株hES细胞系的未分化克隆AKP检测均为强阳性，胞质内有蓝黑色颗粒沉积，部分分化的克隆着色弱，饲养层细胞不着色，说明hES细胞具有较高的碱性磷酸酶活性。ES表面抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60以及TRA-1-81检测结果显示，此株hES细胞系的SSEA-4、TRA-1-60以及TRA-1-81免疫荧光反应呈现强绿色，SSEA-1抗原抗体免疫荧光反应为阴性(参见图2)，说明此株hES细胞系能表达特异性表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，不表达表面抗原SSEA-1。
3.Oct-4转录因子的表达
Oct-4是ES细胞维持自我更新的重要基因，未分化的ES克隆能够高表达。本实验采用RT-PCR的方法来检测该因子，结果提示新建立的hES细胞系能表达Oct-4转录因子，保持未分化特性。(参见图3)
4.个体识别：
此株hES细胞系在16个STR位点上出现特异性峰可以将其与其他hES细胞系区分开来，参见图4。
5、染色体核型分析：
此株hES细胞系每隔10代进行一次核型分析，分析结果提示此株细胞系具有正常核型，参见图5。
6.体内外分化能力检测：
6.1体外分化潜能：FY-hES7的细胞在悬浮培养的D7天形成囊性拟胚体(EB)；形成囊性EB后转到铺有明胶的培养皿内，贴壁培养至第四天，进行三胚层特异性标记物检测，结果表明hES细胞可自发分化为神经细胞、上皮细胞、平滑肌细胞等三个胚层的细胞。
6.2体内分化潜能：FY-hES7的细胞在接种到SCID小鼠腹股沟皮下6周左右，开始出现肿块；12周时肿块增大约30mm3大小，处死小鼠，摘除肿块，做病理切片可见三个胚层的组织，包括角化复层扁平上皮、神经细胞、色素上皮(外胚层)；平滑肌，软骨(中胚层)以及肠腺上皮和纤毛柱状上皮(内胚层)。参见图6。
甲基化特异性PCR检测X染色体失活状态
胚胎干细胞DNA的提取
提取的DNA使用甲基化试剂盒进行重亚硫酸盐处理，使DNA中的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变
准备两套PCR反应体系，一为甲基化的X等位基因，另一套为未甲基化的X染色体反应体系以。
加入1μl处理过的细胞DNA标本到PCR反应管中，反应体系如下
10x FX buffer 1.5
10mM dNTP 0.75
Primer ARM-F 0.2
Primer ARM-R 0.2
AmpliTaq Gold 0.1
H2O 11.25(μl)(甲基化体系)
10x FX buffer 1.5
10mM dNTP 0.75
Primer ARU-F 0.2
Primer ARU-R 0.2
AmpliTaq Gold 0.1
H2O 11.25(μl)(未甲基化体系)
反应条件如下
95℃for 12’
94℃for 30” ←
58℃for 30” ←
72℃for 30” ←28个循环
72℃for 7’
4℃放置
产物的纯化
Genetic Analyzer 310进行产物分析，人类雄激素受体基因产物大小介于170-230bp之间。
X染色体失活状态的分析
正常女性X染色体失活分析中，其失活的峰应该有两个，活性的峰也应该是两个，从两个峰面积(或修正后面积)的比例中可以计算出两条X染色体失活比例，正常比例为接近1∶1，但也可波动至8∶2。如果此比例高于9∶1或只有一个峰，则此状态为非随机失活。(参考文献：T Kubota et al 1999，A newassay for the analysis of X-chromosome inactivation based onmethylation-specific PCR，Hum Gent 104：49-55)。
结果
胚胎干细胞FY-hES-7的X染色体失活分析图显示其活性状态的X染色体和失活状态的X染色体均表达同一个峰197bp。参见图7a。
正常女性DNA分析X染色体失活显示其失活状态的X染色体是随机的。失活的X染色体有194bp和207两个峰，而活性的X染色体也有194bp和207bp两个峰，且两个峰面积比接近1∶1。参见图7b。