拟南芥谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因的植物表达载体及其构建方法和应用.pdf

拟南芥谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh，为含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)3C小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)和拟南芥谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶(glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase，FALDH)基因adh的植物表达载体。从拟南芥中扩增出adh基因，用光诱导型启动子控制它在烟草叶片细胞质中过量表达，提高烟草细胞分解甲醛的效率，从而提高植物吸收和耐受外源甲醛的能力。实验表明转adh基因烟草FALDH的酶活性比野生型提高约3～5倍，在含有10mmol/L甲醛的MS固体培养基上培养30天后，转adh烟草的生长状况明显优于野生型烟草。此外，用2mM甲醛液体处理植物时转adh基因烟草的甲醛吸收速率明显高于野生型烟草。

1、  拟南芥谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因的植物表达载体，含有谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因adh cDNA。

2、  如权利要求1所述的植物表达载体，所述的谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因adh的cDNA来源于拟南芥，GenBank登录号为834417。

3、  如权利要求1所述的植物表达载体，谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶cDNA的上游连接有Rubisco 3C小亚基的光诱导型启动子。

4、  如权利要求1所述的植物表达载体，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pH2GW7。

5、  如权利要求1所述的植物表达载体，为pH2-35S-PrbcS-adh，在起始载体pH2GW7上带有启动子PrbcS，其后紧接adh基因。

6、  权利要求1的重组载体，由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找拟南芥adh基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
5’adh：CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC
3’adh：GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG
上游引物5’adh，5’端加CACC特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；下游引物3’adh，末端加EcoR I酶切位，以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到adh基因的全长cDNA；
(2)回收并纯化adh全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-adh；
(3)构建中间载体pENTR^TM2B-adh，用Sal I和EcoR I酶切pMD18-adh和pENTR^TM2B(Invitrogen)得到目的基因片段adh和载体片段pENTR^TM，回收后进行连接、转化感受态细胞，得到重组载体pENTR^TM-adh；
(4)构建入门载体pENTR*-PrbcS-adh，用Nco I和EcoR I消化pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pENTR^TM-adh，回收载体pENTR*-PrbcS片段和adh基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-adh；
(5)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-adh亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得adh基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh。

7、  构建权利要求1的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh的方法，包括下述步骤：
(1)从GenBank中查找拟南芥adh基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
5’adh：CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC
3’adh：GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG
上游引物5’adh，5’端加CACC特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；下游引物3’adh，末端加EcoR I酶切位，以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到adh基因的全长cDNA；
(2)回收并纯化adh全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-adh；
(3)构建中间载体pENTR^TM-adh，用Sal I和EcoR I酶切pMD18-adh和pENTR^TM2B(Invitrogen)得到目的基因片段adh和载体片段pENTR^TM，回收后进行连接、转化感受态细胞，得到重组载体pENTR^TM-adh；
(4)构建入门载体pENTR*-PrbcS-adh，用Nco I和EcoR I消化pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pENTR^TM-adh，回收载体pENTR*-PrbcS片段和adh基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-adh；
(5)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-adh亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得adh基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh。

8、  权利要求1-6之一的重组载体在制备吸收和耐受甲醛能力增强的转基因植株中的应用。

拟南芥谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因的植物表达载体及其构建方法和应用
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高植物吸收和耐受甲醛能力的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh，及其构建方法与应用。
背景技术：
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚。它反应能力极强，能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应(Feldman等，Prog Nucleic AcidRes Mol Biol，1973，13：1-49)，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性。甲醛被广泛用于工业生产中，是制造树脂、胶粘剂、油漆、塑料、人造纤维的原料，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性的化学物质。人们入住新居都要进行室内装饰和更新家具，其正是室内空气甲醛污染的主要来源。甲醛污染危害严重的场所是：居室、办公室、会议室、宾馆、KTV包房、家具商场、建材商场等。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08(mg/立方米)，有调查表明新的宾馆客房室内空气中甲醛浓度最高达0.36mg/立方米，平均为0.173mg/立方米，是室外对照的13倍。而家具商场最高达0.873mg/立方米，平均为0.432mg/立方米，是室外对照的33倍。建成一所经过装饰的实验室，空气中甲醛平均浓度高达0.5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽样检测发现单位及住户室内环境污染严重，查了11家只有1户合格，其中竟有1户甲醛超标25倍。
甲醛为较高毒性物质，当室内空气中甲醛含量为0.1mg/立方米时，就有异味和不适感；达到0.5mg/立方米时，可刺激眼睛，引起流泪；达到0.6mg/立方米时，可引起咽喉不适或疼痛。浓度更高时，可引起恶心呕吐，咳嗽胸闷，气喘甚至肺水肿；达到30mg/立方米时，会立即致人死亡。长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病(sick-house)。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TDI、VOC等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。
已有研究表明外源甲醛能够作为碳源被整合入光合细胞的代谢中。比如，普通的挂兰在¹⁴C标记的甲醛上生长时通过一碳代谢产生¹⁴C标记的产物，如丝氨酸和卵磷脂。甲醛可以和谷胱苷肽，精氨酸，天冬酰氨和四氢叶酸形成加合物后通过不同的途径进行代谢。对几种真核生物的生化和遗传学研究表明谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶(FALDH)是甲醛代谢的关键酶之一。此酶广泛存在于植物体的所有组织中，它催化的反应以甲醛和谷胱苷肽的加合物硫代羟甲基谷胱苷肽(S-hydroxymethylglutathione)为底物产生硫代甲酰基谷胱苷肽(S-formylglutathione)。在植物中还有硫代甲酰谷胱苷肽水解酶，它能把S-formylglutathione分解为甲酸和谷胱苷肽。这两个酶组成一条甲醛到甲酸的氧化途径。
植物FALDH目前已从从豌豆种子，拟南芥和玉米中分离得到，它们的分子和动力学特征非常相近。不同来源的FALDH等电点在5.3-5.6之间，均由两个相同的亚基构成，SDS-PAGE检测亚基的分子量约为40-45kDa左右。pH为8.0时，来源于豌豆种子，拟南芥和玉米的FALDH对S-hydroxymethylglutathione的Km值分别为2uM，1.2uM，12uM，Kcat分别为380min^-1，1351min^-1，473min^-1。
Achkor等人为了检测甲醛脱氢酶在植物中的功能，对来源于拟南芥FALDH的基因进行遗传操作，得到了不同FALDH水平的拟南芥转基因株系。过量表达此酶的拟南芥对外源甲醛的摄取效率提高25％，FALDH水平降低的植物(由于共抑制表型或者反义表达)和野生型拟南芥相比，甲醛脱毒速率显著缓慢，能力下降。这些结果表明植物吸收甲醛的能力与FALDH活力水平相关(Achkor等，Plant Physiol，2003，132(4)：2248-2255)。
高等植物都拥有甲醛异化作用途径，但在这个途径中的关键酶FALDH在高等植物中表达水平较低，无法应对外界环境中高浓度甲醛的危害。Achkor等的研究证明在拟南芥中用组成型启动子CaMV 35S过量表达FALDH，可以提高转基因拟南芥吸收外界环境中液体甲醛的能力。用报告基因的研究结果表明CaMV35S的表达在根中最强，在茎、叶片、花和果实中较弱(Jefferson等，1987；EMBO，6：3901-3907)。1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50％。Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基因编码，控制rbcS基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)，PrbcS的作用有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表达最强。用报告基因的研究结果表明在叶片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍，因此PrbcS是一种很强的光诱导型启动子(Jefferson等，1987；EMBO，6：3901-3907)，常被用来实现目的基因在叶片中的高水平表达。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种提高植物吸收和耐受甲醛能力的谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因的植物表达载体，该载体是含有拟南芥谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因(即adh基因)的植物表达载体；同时提供该载体的构建方法，以及该载体在制备快速吸收和耐受甲醛的转基因植物中的应用。
本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的：
本发明所提供的用于提高植物耐吸收和受甲醛能力的载体，是具有光诱导启动子和谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因cDNA的植物表达载体。
上述载体中，所述的谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因adh的cDNA来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。所述的来源于拟南芥的谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因adh的GenBank登录号为834417。
上述谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶cDNA的上游为Rubisco 3C小亚基的光诱导型启动子。
上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pH2GW7(购自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology，VIB)。
本发明的上述植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找拟南芥adh基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
5’adh：CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC
3’adh：GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG
上游引物5’adh，5’端加CACC特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；下游引物3’adh，末端加EcoRI酶切位点。以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到adh基因的全长cDNA。
(2)回收并纯化adh全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-adh。
(3)构建中间载体pENTR^TM-adh，用SalI和EcoR I酶切pMD18-adh和pENTR^TM2B(Invitrogen)得到目的基因片段adh和载体片段pENTR^TM，回收后进行连接、转化感受态细胞，得到重组载体pENTR^TM-adh。
(4)构建入门载体pENTR*-PrbcS-adh，用Nco I和EcoR I消化pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建方法见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pENTR^TM-adh，回收载体pENTR*-PrbcS片段和adh基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-adh。
(5)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-adh亚克隆到植物表达载体pH2GW7(Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中，获得adh基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh。
本发明的重组载体pH2-35S-PrbcS-adh在制备耐受甲醛的转基因植株中的应用。
本发明利用光诱导型启动子PrbcS构建adh基因的植物表达载体，以便在转基因植物叶片的细胞质中过量表达谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶，由于该酶是植物细胞中甲醛代谢途径的关键酶，因此增强了植物细胞中甲醛代谢的效率，进而提高了植物吸收和耐受外源甲醛的能力。
附图说明：
图1中间载体pMD-adh的构建策略；
图2中间载体pMD-adh的检测；A：PCR扩增adh基因片段，M：λDNA/HindIII，1～4：扩增产物；B：pMD-adh质粒电泳检测，M：λDNA/HindIII，1：pMD-hps/phi(对照质粒)，2～5：pMD-adh；C：EcoRI酶切检测pMD-adh质粒，M：λDNA/HindIII，1～3：EcoRI酶切pMD-adh产物，4：sphI酶切pMD-hps/phi产物(对照质粒)；D：PCR检验pMD18-adh，M：λDNA/HindIII，1～5：扩增产物。
图3中间载体pENTR^TM-adh的构建策略；
图4中间载体pENTR^TM-adh的检测；A：pENTR^TM-adh质粒电泳检测，1：质粒pMD-dof1(对照质粒)，2～4：pENTR^TM-adh样品；B：BamHI+EcoR I双酶切检测pENTR^TM-adh，M：D2000DNA marker，1～3：酶切产物；C：PCR检验pENT^TM-adh，M：D2000DNA marker，1～3：扩增产物。
图5adh基因的Gateway入门克隆载体pENTR*-PrbcS-adh的构建策略；
图6入门克隆载体pENTR*-PrbcS-adh的检测；A：pENTR*-PrbcS-adh质粒电泳检测，1：pENTR*-PrbcS-*T-hps/ph i(对照质粒)，2～3：pENTR*-PrbcS-adh质粒样品；B：EcoRV酶切检测pENTR*-PrbcS-adh样品，M：λDNA/HindIII，1～2：pENTR*-PrbcS-adh，3：pENTR^TM-adh；C：PCR检验pENTR*-PrbcS-adh，M：λDNA/HindIII，1～2：pENTR*-PrbcS-adh模板，3：pENTR^TM-adh模板。
图7用Gateway的LR反应构建adh基因的植物表达载体的策略；
图8adh植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh的检测和农杆菌转化子菌落的检测；A：电泳检测重组质粒，M：λDNA/HindIII，1～2：pH2-35S-PrbcS-adh，3：pENTR*-PrbcS-adh，4：pH2GW7；B：EcoR V酶切检测pH2-35S-PrbcS-adh，M：D2000DNA marker，1：pENTR*-PrbcS-adh，2～3：pH2-35S-PrbcS-adh；C：PCR检测pH2-35S-PrbcS-adh，1～2：pH2-35S-PrbcS-adh扩增产物，3：pENTR*-PrbcS-adh扩增产物，4：pH2GW7为扩增模板；D：菌落PCR检测pH2-35S-PrbcS-adh的转化效果，M：500bp DNA marker，1～2：菌落PCR样品，3：正对照(模板为pENTR*-PrbcS-adh)，4：负对照(模板为pH2GW7)。
图9adh在转基因烟草中的插入情况以及转录水平检测；A：转adh烟草基因组PCR扩增，M：λDNA/HindIII，1～6：转基因烟草株系，7：野生型烟草，8：正对照(模板为pH2-35S-PrbcS-adh质粒)；B：转adh烟草RT-PCR扩增，M：λDNA/HindIII，F3、F4、F5、F6、F16、F25：转基因烟草株系，WT：野生型烟草。
图10FALDH在转基因烟草中的酶活性测定；F3、F4、F6、F16、F25：转基因烟草株系；WT：野生型烟草。
图11转基因烟草吸收液体甲醛速率测定；F6、F16：转基因烟草株系；WT：野生型烟草。
图12转基因烟草对于培养基中甲醛的抗性。
A：野生型烟草；B：转基因烟草。
具体实施方式：
试剂与仪器：
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonaseEnzyme Mix kit购自invi trogen公司。其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：FALDH基因cDNA扩增及TA克隆
首先从GenBank中查找adh的全长基因序列，并设计一对引物，序列如下：
5’adh：CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC
3’adh：GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG
上游引物5’adh末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；下游引物3’adh末端加EcoR I酶切位点。
用TRIzoL Reagent(Invitrogen)从拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗中提取总RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min(12000rpm)，弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit(TaKaRa)进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl₂4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。
以cDNA为模板，用adh基因上下游特异性引物5’adh和3’adh进行PCR，扩增得到adh的全长cDNA约1.1kb(图2A)。回收并纯化adh全长基因片段，并将其连接到pMD-18T(大连宝生物公司)载体上(图1)，转化大肠杆菌感受态DH5α(天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测(图2B)。以重组质粒为模板，用引物5’adh和3’adh引物扩增到的1.1kb的PCR产物(图2D)。根据阳性重组质粒pMD-adh载体两端的多克隆位点，用EcoRI单酶切重组质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD-adh酶切产物理论上为3.9kb左右的条带(图2C)。
实施例2：构建中间载体pENTR^TM-adh
用Sal I和EcoR I双酶切pMD-adh和pENTR^TM2B-ccdB(图3)，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，分别回收pMD-adh被切割后产生的adh基因片段(1.1kb)和pENTR^TM2B-ccdB被切割后产生的载体片段pENTR^TM2B，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR^TM2B和adh基因的DNA片断产生中间载体pENTR^TM-adh(图3)。用连接反应混合物转化高效率(10⁸)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，选出连接成功的质粒载体pENTR^TM-adh，进行电泳检测，其大小为3.4kb，已有质粒pMD-dof1作为对照，大小为3.2kb(图4A)。以pENTR^TM-adh为模板，利用adh基因上下游引物进行PCR扩增，扩增结果得到1.1kb左右的条带(图4C)。用BamHI(Takara)和EcoR I(Takara)双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，分别为2.4kb和1.0kb(图4B)。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR^TM-adh。
实施例3：入门克隆pENTR*-PrbcS-adh的构建
用Nco I和EcoR I双酶切pENTR^TM-adh和pENTR*-PrbcS-*T-GFP质粒(图5)，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的载体片断pENTR*-PrbcS(4.0kb)及pENTR^TM-adh被切割产生的adh基因的DNA片断(1.1kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*-PrbcS和adh基因的DNA片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-adh(图5)。用连接反应混合物转化高效率(10⁸)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，选出连接成功的质粒载体pENTR*-PrbcS-adh，进行电泳检测，其大小为4.9kb，已有质粒pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi作为对照，大小为5.3kb(图6A)。以pENTR*-PrbcS-adh为模板，利用adh基因上下游引物进行PCR扩增，扩增结果得到1.1kb左右的条带，对照质粒pENTR^TM-adh扩增产物也是一条1.1kb的条带(图6C)。用EcoR V(Takara)酶切检测pENTR*-PrbcS-adh，连接成功的质粒和对照质粒pENTR^TM-adh均在琼脂糖凝胶电泳图上出现一条200bp左右的条带(图6B)。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-adh。
实施例4：植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh的构建
通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-adh亚克隆到植物表达载体pH2GW7(Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中(图7)。具体的做法是：用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pH2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS-adh和pH2GW7各150ng，1μl LR ClonaseII Enzyme Mix(Invitrogen)，混均于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-adh整合到pH2GW7中获得adh的植物表达载体质粒pH2-35S-PrbcS-adh(图7)。用反应混合物转化高效率(10⁸)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落。从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，选出大小和对照质粒pH2GW7相似的整合成功的质粒pH2-35S-PrbcS-adh(图8A)。pH2-35S-PrbcS-adh进行PCR检测，上游使用光诱导启动子5’PrbcS-2的特异性引物，下游使用3’adh引物进行PCR扩增，正对照试验用pENTR*-PrbcS-adh作为模板，负对照用pH2GW7作为模板。pH2-35S-PrbcS-adh和pENTR*-PrbcS-adh扩增产物均出现1.3kb目的条带，负对照没有扩增产物(图8C)。然后进一步用酶切验证重组质粒的正确性，用EcoRV单切检测pH2-35S-PrbcS-adh，酶切结果和EcoR V单切pENTR*-PrbcS-adh相同，得到一条200bp左右的条带(图8B)。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pH2GW7携带的筛选标记基因为潮霉素抗性基因(Hgr)，这样可用加有潮霉素的平板筛选转基因植物。
实施例5：用adh基因的植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-adh转入农杆菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μl ddH₂O中，98℃处理5分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。PCR检测pH2-35S-PrbcS-adh转化结果，上下游引物分别为5’adh和3’adh，正对照扩增体系模板使用pENTR*-PrbcS-adh质粒，负对照使用pH2GW7质粒，扩增片断理论长度为1.1kb，PCR产物经电泳分析显示其片段大小与理论预测值相符，表明质粒已转入农杆菌(图8D)
实施例6：用含有adh基因植物表达载体的农杆菌转化烟草
挑取携带有质粒pH2-35S-PrbcS-adh的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe，100μg/ml)，180rpm，28℃培养24h，待菌液OD₆₀₀至1.0左右，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD₆₀₀值为0.5。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1(MS+NAA02.1μg/ml+BAP 0.02μg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含潮霉素(25μg/ml)的芽诱导培养基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含潮霉素(25ug/ml)的MS培养基上进行根的诱导。
实施例7：adh基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测
为了确认通过潮霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH 7.5100mM，EDTA20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2％)，65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)后转移上清至1.5mlEP管；再次加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组DNA样品。以转adh烟草抗性苗基因组作为模板，上下游引物分别为5’PrbcS-2(PrbcS特异性引物)，3’adh进行PCR扩增检测adh是否插入烟草基因组。扩增产物大小为1.3kb左右，和预期推测一致，说明目的基因均已插入这些转基因株系的基因组，野生型烟草基因组PCR产物未出现目标条带(图9A)。
为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测adh基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min(12000rpm)，弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(5×reactionbuffer 4μl，25mM MgCl₂ 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV ReverseTranscriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用adh基因的上下游引物进行RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明转基因烟草植株均有目的基因的转录物，而野生型的烟草则没有(图9B)。
实施例8：转基因烟草甲醛脱氢酶(FALDH)的酶活性分析
从烟草叶片中抽提可溶性蛋白，取0.2g烟草叶片，加1ml蛋白抽提液[100mMTris-HCl(pH 7.5)；10％(V/V)甘油；10mM巯基乙醇；1mM PMSF；5％(W/V)PVP]研磨，转移至EP管中，13000rpm离心25min(4℃)。将上清移到新的EP管中，用Bradford方法测定植物上清中的蛋白质浓度。
FALDH酶活性在25℃通过检测NADH的产生量计算(Koivusalo等，FEBSLett，1989，257：105-109)。反应体系(800μl)为：0.1M sodiumphosphate(pH8.0)，1mM HCHO，1mM glutathione，2.4mM NAD，蛋白样品。
转adh烟草株系在25℃持续光照培养15天后，检测FALDH酶活性(图10)。转基因烟草酶活性比野生型烟草提高约3～5倍左右，这表明adh已在烟草中过量表达具有活性的FALDH。
实施例9：转基因烟草吸收液体甲醛速率测定
甲醛可与Nash试剂(醋酸氨：15％，冰醋酸：0.3％，乙酰丙酮：0.2％)发生化学反应产生有颜色的物质，该物质的最大吸收波长为410nm，因此可以制备标准曲线，根据HCHO-Nash标准曲线即可计算出反应液中甲醛的含量，利用该方法可以测定植物对甲醛的吸收速率。取0.3g左右植物材料放入小三角瓶中，加入10～20ml处理液(HCHO 2-4mM，KHCO₃5mM，MES 0.1％)，处理一定时间。取出20～100μl处理液，加水至1mL，再加入1mL Nash试剂在30℃保温30分钟后，测定OD₄₁₀，再根据标准曲线计算出处理液残存甲醛浓度(图11)。结果表明，2个转基因烟草株系在2mmol/L甲醛溶液中处理48小时后残余甲醛的比率为5％和8％左右，而野生型剩余甲醛的比率为25％，这说明转基因烟草吸收液体中甲醛的速率优于野生型。
实施例10：转基因烟草对甲醛的抗性检测
将转基因和野生型小苗移入MS固体培养基(甲醛浓度10mmol/L)，在25℃持续光照培养约30天后观察烟草表型变化(图12)，可以看出转adh烟草比野生型长势明显要优异，这表明FALDH非常有助于提高烟草对于固体培养基中液体甲醛的抗性，与野生型相比，转基因株的生长受甲醛的影响很小。