衣原体中和营养消化液.pdf

本发明涉及一种衣原体中和营养消化液；特别是在临床大量使用抗生素后的尿道炎患者，需要衣原体细胞培养检查时，使用细胞培养基的配方及其制备方法。沙眼衣原体生殖道感染是最常见性传播性疾病之一。沙眼衣原体还被认为是盆腔炎及其后遗症——输卵管不孕和异位妊娠的重要病因。衣原体细胞培养法是检查衣原体最敏感、最可靠的方法。该培养基能够检测大量临床使用抗生素后的生殖道衣原体阳性结果，具有指导临床诊断和治疗的作用，为防止滥用抗菌药物也具有重要意义。

1、  本发明涉及一种衣原体中和营养消化液；特别是在临床大量使用抗生素后的尿道炎患者，需要衣原体细胞培养检查时，使用细胞培养基的配方及其制备方法，其特征在于具有如下配方(克、ml/每升蒸馏水)：土温-800.3-0.5；卵磷酯0.5-0.8；氯化钠70.0-90.0；磷酸氢二钠0.5-0.7；磷酸二氢钾0.5-0.7；氯化钾3.0-5.0；硫酸镁1.5-3.0  葡萄糖8.0-12.0；氯化钙1.0-2.0；水解乳白蛋白2.0-3.0；小牛血清10.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.2ml；2-巯基乙醇0.5-0.6；青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U/ml)10.0-15.0ml；EDTA 0.1-0.3；0.5％酚红3.0-5.0ml；双蒸水加至1000ml；调pH至7.2-7.4。

2、  一种权利要求1所述衣原体中和营养消化液的制备方法，其特征在于具有如下的步骤：
1)、将土温-80、卵磷酯、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、EDTA按比例进行加温、溶解；
2)、将氯化钙按比例加热溶解于蒸馏水中，冷至54℃；
3)、将溶解的1)混合液缓缓加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷却后调PH7.2-7.4，加酚红；
4)、将溶解的1％谷氨酰胺、2-巯基乙醇按比例加入上述混合液中，压力蒸汽灭菌115℃，20-30min，冷至50℃；
5)、在无菌条件下加无菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均匀；无菌分装，冷藏备用。

衣原体中和营养消化液
技术领域
本发明涉及一种衣原体中和营养消化液；特别是在临床大量使用抗生素后的尿道炎患者，需要衣原体细胞培养检查时，使用细胞培养基的配方及其制备方法。其配方主要成分是：土温-80、卵磷酯、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、氯化钙、水解乳白蛋白、小牛血清、1％谷氨酰胺、2-巯基乙醇、青霉素、链霉素、庆大霉素、EDTA、0.5％酚红。沙眼衣原体生殖道感染是最常见性传播性疾病之一。沙眼衣原体还被认为是盆腔炎及其后遗症——输卵管不孕和异位妊娠的重要病因。孕妇患沙眼衣原体宫颈炎，胎儿经产道分娩时可感染沙眼衣原体结膜炎和肺炎。衣原体细胞培养法是检查衣原体最敏感、最可靠的方法。尤其对慢性患者及女性患者，需经培养后才能做出正确诊断；对已治疗的患者需经培养才能证实是否痊愈。该培养基能够检测大量临床使用抗生素后的生殖道衣原体阳性结果，具有指导临床诊断和治疗的作用，为防止滥用抗菌药物也具有重要意义。常用McCoy细胞或Hela229单层细胞培养，通过观察细胞病变(肿大，变性，脱落)及细胞内特征性包涵体可确定诊断。其敏感性约为80％～90％，特异性为100％。并可用于药物敏感试验，还可检测治疗后病人是否存在活的衣原体，以判定疗效。该方法操作繁锁、费时，设备昂贵，技术性强，临床不易推广。沙眼衣原体需要在实验室做细胞培养进行分离，因此，多年来细胞培养一直做为衣原体检测的“金标准”，细胞培养对设备、技术、标本采集和运送等的要求都非常高，从尿道、宫颈采集的柱状细胞，不宜混有多核细胞及粘液脓性分泌物，不宜含有过多的杂质。对采集拭子也有要求：应是棉拭子而不应是木制拭子，因为木制拭了可能抑制衣原体生长。宫颈内标本有细胞刷可采集到更从的细胞以提高培养的敏感性。标本必须放置在特制的转运培基中，冷冻，24小时内包埋到细胞培养盘中。培养时McCoy细胞的状态也会影响最终结果。当McCoy细胞过度生长、变形、破裂甚至完全失去细胞形态时，则无从观察细胞中的包涵体。细胞培养无论在花费上、设备、技术方面都要求非常高，对于细胞培养来讲，花费和时间是影响衣原体细胞培养作为诊断方法使用和推广的最大障碍。很多研究人员在细胞培养方法的改进上进了多方面探索。
背景技术
由沙眼衣原体引起的泌尿生殖系统化疾病是近年来越来越引起临床重视的病原体之一。尤其是大量临床用抗生素后的沙眼衣原体检测十分难检，由于标本中含大量残余抗生素，在恢复培养沙眼衣原体时继续受到残余抗生素的作用。因此，不采用去除残余的抗生素措施的实验，应认为是在设计上的严重失误，依据这样的实验得出的结果是不可靠的。细胞培养无论在花费上、设备、技术方面都要求非常高，对于细胞培养来讲，花费和时间是影响衣原体细胞培养作为诊断方法使用和推广的最大障碍。目前，细胞培养仍是诊断衣原全感染最为可靠的实验方法，习惯上把细胞培养作为“金标准”。用细胞培养的方法来确定衣原体的感染涉及5个方面的影响因素：①尽可能采集含有较多上皮细胞的样本；②在转运培基中添加抗生素以防止标本中细菌的过度生长；③④使用抗代谢药物抑制组织细胞的复制；⑤使用碘、Giemsa、免疫荧光染色来鉴定感染细胞中的衣原体。本发明的目的在于提供一种衣原体中和营养消化液，与其它类试剂相比具备下列特点：衣原体中和营养消化液营养丰富、配制简单、选择性强和变色灵敏，与传统试剂比较，检出率高，污染小，临床应用效果满意.检测方法简单、时间短、准确性强。可防止标本中细菌的过度生长，培养组织细胞的复制得以抑制。
发明内容
本发明的要点在于选择合适的组分，并进行合理混配，经加温、溶解、混合、冷却、分装、高温灭菌等工艺而成一种衣原体中和营养消化液。
本发明选择的衣原体中和营养消化液配方如下(克、ml/每升蒸馏水)：土温-800.3-0.5；卵磷酯0.5-0.8；氯化钠70.0-90.0；磷酸氢二钠0.5-0.7；磷酸二氢钾0.5-0.7；氯化钾3.0-5.0；硫酸镁1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0；氯化钙1.0-2.0；水解乳白蛋白2.0-3.0；小牛血清10.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.2ml；2-巯基乙醇0.5-0.6；青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U/ml)10.0-15.0ml；EDTA 0.1-0.3；0.5％酚红3.0-5.0ml；双蒸水加至1000ml；调pH至7.2-7.4。
土温-80、卵磷酯是中性中和剂，能够有效的将样本中的残余抗生素吸附中和，中和产物对培养物无影响。
氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、氯化钙、是组织细胞的体液平衡必不可少的物质；水解乳白蛋白、小牛血清、1％谷氨酰胺、是组织细胞的营养平衡必不可少的物质；青霉素、链霉素、庆大霉素是细胞培养过程中防止污染必不可少的物质；2-巯基乙醇、EDTA是细胞培养过程中起到组织块的消化以提高细胞的产量。小牛血清使用前要灭活(56℃，30min)，以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每一批血清都要严格检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g/100ml，保证试验条件的稳定。试验中加入小牛血清后，培养基的pH可能还会变化，故亦可先加入小牛血清后调pH值。培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48hr，以检测培养液是否有污染。每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分(主要为谷氨酰胺)损失，造成实验繁琐或者污染。
本发明产品的制备方法是：
1)、将土温-80、卵磷酯、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、EDTA按比例进行加温、溶解；
2)、将氯化钙按比例加热溶解于蒸馏水中，冷至54℃；
3)、将溶解的1)混合液缓缓加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷却后调PH7.2-7.4，加酚红；
4)、将溶解的1％谷氨酰胺、2-巯基乙醇按比例加入上述混合液中，压力蒸汽灭菌115℃，20-30min，冷至50℃；
5)、在无菌条件下加无菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均匀；无菌分装，冷藏备用。
本发明具有以下优点：(1)衣原体中和营养消化液，配制简单，原材料易得；(2)临床应用效果满意，解决了床边接种的困难，污染小；(3)检测方法简单、时间短、选择性强、变色灵敏、检出率高；(4)可防止标本中细菌的过度生长，培养组织细胞的复制得以抑制。能够中和标本中含大量残余抗生素，对已治疗的患者需经培养才能证实是否痊愈，具有指导临床诊断和治疗作用，为防止滥用抗菌药物也具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
按照下表所列数据(克、ml/每升蒸馏水)及其所述步骤进行配置：
配方一：
土温-800.3-0.5；卵磷酯0.5-0.8；氯化钠70.0-90.0；磷酸氢二钠0.5-0.7；磷酸二氢钾0.5-0.7；氯化钾3.0-5.0；硫酸镁1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0；氯化钙1.0-2.0；水解乳白蛋白2.0-3.0；小牛血清10.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.2ml；2-巯基乙醇0.5-0.6；青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U/ml)10.0-15.0ml；EDTA 0.1-0.3；0.5％酚红3.0-5.0ml；双蒸水加至1000ml；调pH至7.2-7.4。
                                                                                       
配方二：
土温-800.3-0.4；卵磷酯0.5-0.7；氯化钠70.0-80.0；磷酸氢二钠0.6-0.7；磷酸二氢钾0.6-0.7；氯化钾4.0-5.0；硫酸镁2.5-3.0葡萄糖9.0-12.0；氯化钙1.5-2.0；水解乳白蛋白2.5-3.0；小牛血清11.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.1-1.2ml；2-巯基乙醇0.5-0.6；青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U/ml)12.0-15.0ml；EDTA 0.2-0.3；0.5％酚红4.0-5.0ml；双蒸水加至1000ml；调pH至7.2-7.4。
                                                                                      
配方三：
土温-800.3-0.4；卵磷酯0.6-0.8；氯化钠80.0-90.0；磷酸氢二钠0.5-0.6；磷酸二氢钾0.5-0.6；氯化钾3.0-4.0；硫酸镁1.5-2.0葡萄糖8.0-10.0；氯化钙1.0-1.5；水解乳白蛋白2.0-2.5；小牛血清10.0-11.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.1ml；2-巯基乙醇0.5-0.6；青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U/ml)10.0-13.0ml；EDTA 0.1-0.2；0.5％酚红3.0-4.0ml；双蒸水加至1000ml；调pH至7.2-7.4。