技术领域
本发明是关于植物药有效成分的提取分离方法，具体说是关于中药蒲黄 中的有效成分的提取分离方法。
背景技术
蒲黄是一种常用中药，对于蒲黄的研究已有许多文献报道，其中对蒲黄 化学成分的研究，也有一些文献记载将异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷作为蒲黄 药材和含蒲黄药物的质量控制指标，为此，实际工作中需要提取分离纯度高 的异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷作为对照品。特别是在含蒲黄的药物开发研究 当中，如何简化蒲黄有效成分异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的提取工艺，提高 提取分离纯度，是制剂工艺研究过程的关键环节之一。目前一些提取分离方 法的提取工艺路线复杂，异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷收率较低，不适合于工 业化大规模生产，且因为难以进一步提高异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的纯度， 使其用作质量控制用对照品受到一定限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取分离蒲黄中有效成分异鼠李素-3-O-新 橙皮糖苷的新工艺。
本发明的工艺方法步骤如下：
A：取蒲黄药材醇提得稠膏，即总提取物；
B：总提取物硅胶拌样后，另取硅胶活化、干柱层析，以5～10∶1～3∶1 的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂为洗脱剂或展开剂，分段提取得8～12份，各 份用甲醇、乙醇或丙酮洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；合并其 中第3份和第4份得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品；
C：以硅胶为吸附剂，异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品用甲醇溶解后，干 法上样，以乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为洗脱液进行梯度洗 脱，梯度为100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，减压浓缩，把其中第6～8 份浓缩液合并，减压抽干得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品；
D：取异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、 湿法装柱，色谱柱的径高比为3∶20-27，吸附剂为葡聚糖凝胶LH-20，用量 为被分离样品量的18-30倍，用甲醇或乙醇进行洗脱，分段收集洗脱液，共 收集12～15份；把其中第8～10份分别浓缩，加入浓缩液20～25倍量的乙 酸乙酯，静置沉淀，过滤，沉淀用乙酸乙酯洗涤后，干燥，即得到异鼠李素 -3-O-新橙皮糖苷纯品。
上述方法中步骤A的方法为：取蒲黄药材25重量份，加入浓度为60～ 90％的乙醇150～250体积份，浸泡24～48小时后，加热回流提取0.5～1.5小 时，静置0.5-2小时，吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取2～4次， 提取药液合并，药渣弃去；将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度60～ 90℃，减压浓缩至浓缩液无醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即总提取物2.5～ 3.0重量份。
上述方法中步骤A的优选方法为：取蒲黄药材25重量份，加入浓度为 70％的乙醇200体积份，浸泡24小时后，加热回流提取1小时，静置1小时， 吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去； 将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无 醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8重量份。
上述方法中步骤B的方法为：取稠膏50～60重量份，拌入150～180重 量份的100～200目的硅胶，干燥，得到拌样硅胶；另取1500～2000重量份 的100～200目的硅胶，100～105℃活化1.5～2小时后，干法装柱；将拌样 硅胶加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂1500-2500体 积份为洗脱剂或展开剂，进行干柱层析，放干溶剂，进行等分切割或按色带 切割，共得到8～12份；各份用1500～2000体积份的甲醇、乙醇或丙酮洗 脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；收集其中第3份和第4份合并， 得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7重量份；
上述方法中步骤B的优选方法为：取稠膏50重量份，拌入150重量份， 160～200目硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶；另取160～200目硅胶1500重 量份，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶 加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000体积份为展开剂，下 行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，等 分切割，共得到10份；各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500体积份洗脱。 洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第3份和第4份合并，得到异鼠 李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份。
上述方法中步骤C的方法为：吸附剂为100～150重量份的200～300目 的硅胶，异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5-7.0重量份用50-150体积份甲 醇溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上 样；洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶剂 (乙酸乙酯、甲醇、乙醇均为分析纯)进行梯度洗脱；最佳梯度为100∶0、 95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、 45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为100～300体积份，洗脱流速为每分 钟2～6体积份，分份收集，每份100～150体积份，减压浓缩至10～20体 积份；把其中第6～8份浓缩液合并，减压抽干得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖 苷精品2.5-3.0重量份；
上述方法中步骤C的优选方法为：吸附剂为100重量份的200～300目 的硅胶H，异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9重量份用100体积份甲醇溶解 后，加到4倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱 剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂进行梯度洗脱；最佳梯 度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、 55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为200体积份，洗脱流 速为每分钟4体积份，洗脱剂总用量为2600体积份，分份收集，每份100 体积份，减压浓缩至10体积份；把其中第6～8份浓缩液合并，减压抽干得 到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.8重量份；
上述方法中步骤D的方法为：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.50-3.00 重量份，加30-60体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小时后，湿法装柱： 葡聚糖凝胶LH-20 50～80重量份，色谱柱径高比为1∶20-26，用甲醇或乙 醇100-200体积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5～10体积份，共收集12～ 15份；把其中第8～10份分别浓缩至2～3体积份后，加入20～25倍量乙酸 乙酯，静置0.5-2小时，沉淀，过滤，沉淀用15-30体积份乙酸乙酯洗涤后， 自然干燥，即得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品2.1-2.7重量份。
上述方法中步骤D的优选方法为：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品2.80 重量份，加50体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小时后，湿法装柱：葡聚 糖凝胶LH-20 50重量份，色谱柱径高比为1∶20，用甲醇或乙醇150体积份 进行洗脱，收集洗脱液，每份5体积份，共收集15份；把其中第8～10份 分别浓缩至2体积份后，加入20倍量乙酸乙酯，静置0.5-2小时，沉淀， 过滤，沉淀用20体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到异鼠李素-3-O- 新橙皮糖苷纯品2.58重量份。
采用本方法提取蒲黄有效成分异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷，提取工艺路 线简单，提取分离纯度提高，异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷收率提高，适合于 工业化大规模生产。
下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的纯度检查
用高效液相色谱法检查纯度。仪器：美国惠普公司HP1050高效液相色 谱仪，二极管阵列检测器(HP1050 DAD)，HP1050/WIN-3D化学工作站，Waters 公司25μL可调进样器。色谱柱：Bondclone 10 C18柱，3.9mm×300mm(美 国Phenomenex公司)。流动相：乙腈-水(15～20∶85～80)；流速：1.0～ 1.2mL/min；柱温：室温；检测波长：254nm；衰减：8；进样量：20μg， 保留时间(RT)：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷为8.5～9.5min；色谱图记录时 间：20min。归一化法测定纯度。异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品的纯度为 98.38％，大于98.00％，可作为对照品使用。
实验例2：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的结构测定
取上述方法所得的异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品：黄色结晶性粉末(甲 醇-乙酸乙酯)，熔点179～181℃，易溶于水、甲醇，溶于乙醇，微溶于丙酮、 乙酸乙酯。紫外灯下呈黄棕色荧光，三氯化铝显色后呈黄绿色荧光。盐酸镁 粉反应阳性，Molish反应阳性，示为黄酮苷类化合物。UVλmax(nm)：254， 354(MeOH)，示3位为取代的黄酮醇；270，330，408(MeONa)，带I红移54nm， 示4’位为游离羟基；273，322，365(NaOAc)，带II红移19nm，示7位为游 离羟基；254，353(NaOAc+H3BO3)，示无邻二羟基；269，301，367，404(AlCl3)， 带I红移50nm；264，357，402(AlCl3/HCl)，峰位与AlCl3光谱比较基本不 变，示5位为游离羟基。IRυmax(KBr，cm-1)：3416.8(OH)，2976.8，2934.9， 1659.5(C＝O)，1609.8，1506.4(苯环)，1459.7，1429.6，1356.2，1286.1， 1206.0，1132.6，1069.2，995.7，812.2。FAB-MS(m/z)：647(M+Na)，625(M++1)，479(M+-鼠李糖基+H)，317(M+-鼠李糖基-葡萄糖基+H)， 316(M+-鼠李糖基-葡萄糖基)。EI-MS(m/z)：316(苷元)，315(苷元- 1)，301(苷元-CH3)，287(苷元-CO-H)，273(M+-CH3-CO)，259 (287-CO)，243，217，204，191，173，153(A1++H)，151(B2+)，144，128，97。 1HNMR(CD3OD，TMS)：δ0.86的双峰示有一个鼠李糖，δ5.17的信号为鼠李 糖基端基氢，仔细观察，该信号为双峰，偶合常数很小，推断鼠李糖为α- 构型。δ5.88的双峰归于3位葡萄糖基的端基质子，偶合常数为7.3Hz，推 断为β-构型。13CNMR(CD3OD，TMS)：δ81.1为葡萄糖基2位碳的信号，与对 应葡萄糖甲苷相比，此C-2信号向低场位移，而C-3信号向高场位移，这表 明鼠李糖基与葡萄糖2位相连。该化合物用0.1mol/L盐酸水解，水解液纸 层析检出L-鼠李糖和D-葡萄糖。综合以上数据及实验结果，确定为异鼠李 素-3-O-α-L-鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷，即异鼠李素-3-O-新橙皮 糖苷(isorhamnetin-3-O-neohesperidoside)。分子式为C28H32O16。其UV、 1HNMR、13CNMR数据见表1、2、3。
表1 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的UV光谱数据(nm) 测定溶剂 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷 MeOH MeONa NaOAc NaOAc+H3BO3 AlCl3 AlCl3/HCl 254，354 270，330，408 273，322，365 254，353 269，301，367，404 264，357，402
表2 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的1HNMR数据(in CD3OD) 氢原子 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷 6 8 2’ 5’ 6’ -OCH3 1” 1 6-CH3 δ6.17，d，J＝2.1Hz δ6.36，d，J＝2.1Hz δ7.96，d，J＝1.8Hz δ6.90，d，J＝8.2Hz δ7.54，dd，J＝8.5Hz，2.1Hz overlaid δ5.88，d，J＝7.3Hz δ5.17，d，J＝2.0Hz δ0.86，d，J＝6.1Hz
表3 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的13CNMR数据(in CD3OD) 碳原子 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷(δ) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ OCH3 1” 2” 3” 4” 5” 6” 1 2 3 4 5 6 159.2 135.1 180.1 164.0 100.6 166.9 95.4 159.0 106.7 124.3 116.8 151.4 149.2 115.3 124.3 57.7 101.0 81.1 79.7 73.1 79.2 63.3 103.6 73.1 72.7 74.8 70.7 18.2
实验例3：硅胶干柱色谱分离异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品试验
取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇200L，浸泡24h后，加热回流 提取1小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次， 提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80 ℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏50g，拌入150g粗硅胶(青岛海洋化工厂生产，160～200 目)，自然干燥，得到拌样硅胶。另取粗硅胶(青岛海洋化工厂生产，160～ 200目)1.5kg，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱(直径12cm，高60cm)。 将拌样硅胶加入柱中，以乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶1)混合溶剂为展开剂， 下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂， 等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500mL洗脱。 洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检查。
薄层色谱条件：吸附剂：硅胶GF254预制薄层板；展开剂：乙酸乙酯-丁 酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。
其中第3份和第4份异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量较高，合并，得到 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9g；异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品为棕黄 色粉末。
实验例4：减压柱色谱分离异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品试验
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为 薄层层析用硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量100g)。取异鼠李素-3-O-新 橙皮糖苷粗品6.9g用少量甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～200目) 中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次 采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、 95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、 45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为150mL，洗脱流速为每分钟3mL，洗 脱剂总用量为1950mL，每份100mL，减压浓缩至小体积(约10mL)后，用薄 层色谱检查，薄层色谱条件：吸附剂：硅胶GF254预制薄层板；展开剂：乙酸 乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。其中第6-8份异鼠李素-3-O-新 橙皮糖苷含量较高，把第6～8份浓缩液合并，减压抽干得到异鼠李素-3-O- 新橙皮糖苷精品黄色粉末2.80g。
实验例5：葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱色谱分离异鼠李素-3-O-新橙 皮糖苷纯品试验
上述异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品黄色粉末2.80g以少量甲醇溶解， 上样(Sephadex LH-20凝胶50g，甲醇浸泡24h后，湿法装柱。色谱柱直径 3cm，高60cm)，用甲醇进行洗脱，待色带到达柱底部时，开始收集洗脱液， 每份5mL，共收集15份。用薄层色谱检查，薄层色谱条件：吸附剂：硅胶 GF254预制薄层板；展开剂：乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。 其中第8-10份异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量较高，把其中第8～10份分别 浓缩至小体积(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，静置，沉淀，过滤，沉淀 用15mL乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品 2.2克，为淡黄色粉末。
实施例1：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇175L，浸泡30小时后，加热 回流提取1小时，静置1.5小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取 3次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴 温度70℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.5kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取180目硅胶1600g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为 1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以10∶1∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000毫 升为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时， 放干溶剂，色带切割，共得到10份。各份用甲醇1750ml洗脱。洗脱液减压 回收溶剂后，得各洗脱物；其中第3份和第4份异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷 含量较高，合并，得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品7g。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为 薄层层析用200目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量110g)。异鼠李素 -3-O-新橙皮糖苷粗品7g用80毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～ 200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱 剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度 为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、 50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为200mL，洗脱流速为每分钟 4mL，洗脱剂总用量为2600mL，每份100mL，减压浓缩至小体积(约18mL) 后，把其中第6～8份浓缩液合并，减压抽干得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷 精品黄色粉末3.00g。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的纯化：上述异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品 黄色粉末3.00g以40毫升甲醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶80g，乙 醇浸泡30小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用甲醇150毫升 进行洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份10mL，共收集10份。 把其中第8～10份分别浓缩至小体积(2.8mL)后，加入25倍量乙酸乙酯， 静置1小时，沉淀，过滤，沉淀用25mL乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得 到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品2.65克，为淡黄色粉末。
实施例2：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为80％的乙醇200L，浸泡40小时后，加热 回流提取1.5小时，静置2小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取 4次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴 温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.7kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取180目硅胶1600g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为 1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以乙7∶3∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2200毫升 为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时， 放干溶剂，色带切割，共得到10份。各份用甲醇1900ml洗脱。洗脱液减压 回收溶剂后，得各洗脱物；其中第3份和第4份异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷 含量较高，合并，得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.8g。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为 薄层层析用250目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量130g)。异鼠李素 -3-O-新橙皮糖苷粗品6.8g用75毫升甲醇溶解后，加到5倍量的粗硅胶 (160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。 洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯 度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、 55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为220mL，洗脱流速为 每分钟5mL，洗脱剂总用量为2860mL，每份120mL，减压浓缩至小体积(约 16mL)后，把其中第6～8份浓缩液合并，减压抽干得到异鼠李素-3-O-新橙 皮糖苷精品黄色粉末2.80g。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的纯化：上述异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品 黄色粉末2.80g以50毫升溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶70g，甲醇浸 泡26小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用甲醇180毫升进行 洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份8mL，共收集12份。把其 中第8～10份分别浓缩至小体积(2.4mL)后，加入24倍量乙酸乙酯，静置 1小时，沉淀，过滤，沉淀用20mL乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到异鼠 李素-3-O-新橙皮糖苷纯品2.58克，为淡黄色粉末。
实施例3：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为90％的乙醇225L，浸泡45小时后，加热 回流提取0.5小时，静置1.5小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提 取2次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水 浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8kg。
取上述稠膏55g，拌入170g，160目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取160目硅胶1700g，100～105℃活化2小时后，干法装柱，径高比为1∶5； 将拌样硅胶加入柱中，以乙9∶1∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂1800毫升为展 开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干 溶剂，等分切割，共得到10份。各份用丙酮1700ml洗脱。洗脱液减压回收 溶剂后，得各洗脱物；其中第3份和第4份异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷含量 较高，合并，得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.5g。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为 薄层层析用300目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量140g)。异鼠李素 -3-O-新橙皮糖苷粗品6.5g用80毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶 (160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。 洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯 度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、 55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为200mL，洗脱流速为 每分钟4mL，洗脱剂总用量为2600mL，每份140mL，减压浓缩至小体积(约 12mL)后，把其中第6～8份浓缩液合并，减压抽干得到异鼠李素-3-O-新橙 皮糖苷精品黄色粉末2.60g。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的纯化：上述异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品 黄色粉末2.60g以50毫升乙醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶60g，乙 醇浸泡28小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用乙醇150毫升 进行洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份7mL，共收集14份。 把其中第8～10份分别浓缩至小体积(3mL)后，加入22倍量乙酸乙酯，静 置0.5小时，沉淀，过滤，沉淀20mL乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品2.38克，为淡黄色粉末。
实施例4：异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品的制备
取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇200L，浸泡24h后，加热回流 提取1小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次， 提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80 ℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏58g，拌入160g，180目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。 另取120目硅胶1900g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为 1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以乙8∶2∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000毫升 为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时， 放干溶剂，等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1600ml 洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第3份和第4份异鼠李素 -3-O-新橙皮糖苷含量较高，合并，得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品6.9g。 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷粗品为棕黄色粉末。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的精制：采用减压柱层析方法。吸附剂为薄 层层析用250目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量150g)。异鼠李素-3-O- 新橙皮糖苷粗品6.9g用90毫升甲醇溶解后，加到3倍量的粗硅胶(160～ 200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱 剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度 为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、 50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为150mL，洗脱流速为每分钟 4mL，洗脱剂总用量为1950mL，每份150mL，减压浓缩至小体积(约10mL) 后，把其中第6～8份浓缩液合并，减压抽干得到异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷 黄色粉末2.50g。
异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的纯化：上述异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷精品 黄色粉末2.50g以50毫升甲醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶50g，甲 醇浸泡24小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用乙醇120毫升 进行洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份5mL，共收集15份。 把其中第8～10份分别浓缩至小体积(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，静 置1小时，沉淀，过滤，沉淀用25mL乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷纯品2.37克，为淡黄色粉末。