莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测 方法 技术领域 本发明属于免疫检测技术领域， 涉及一种化学品污染残留的检测试剂盒及其制备 方法， 具体涉及一种检测莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析试剂盒及其制备方法。
背景技术 食品安全是关系到广大人民的日常生活的一件大事。 食品安全问题主要包括食品 中的物理危害、 化学危害和微生物危害等几个因素， 其中化学危害主要包括兽药残留、 农药 残留、 重金属、 环境有害物等。
在过去的几十年中， 随着集约化养殖业的发展， 兽药作为添加剂及药物广泛在畜 牧业中使用， 由此导致的动物性食品中兽药的残留问题日益突出。其主要是指动物在使用 药物预防、 治疗疾病时， 使用促生长饲料药物添加剂后药物以原形或其代谢产物蓄积在动 物的组织器官或可食性产品 ( 如奶、 蛋 ) 中。同一动物不同脏器兽药残留量不同， 按残留量 由高到低一般为 ： 肝＞胆汁＞肾＞肌肉， 注射部位及脂肪的残留量一般也较多。 非法添加和
加大药量， 不遵守休药期规定， 任意扩大使用范围和滥用药物等行为造成的兽药残留事件， 已严重危害到人民群众的健康， 严重者甚至可以引起死亡， 同时这些残留药物也会对环境 产生影响， 对周围食品产生再次污染。
莱克多巴胺 (Ractopamine， 简称 RAC)， 又名雷托巴胺， 化学名为 1-(4- 羟基苯 基 )-2[1- 甲基 -3-(4- 羟基苯基 )- 丙氨基 ]- 乙醇盐酸盐， 属于 2- 肾上腺受体激动剂类 药物， 是继克伦特罗后最常被滥用添加的 所示 ：
2- 肾上腺受体激动剂类药物， 其结构式如式 (I)
它是一种医药原料， 一种可用于治疗冲血性心力衰竭症的强心药。还可以用于治 疗肌肉萎缩症， 增长肌肉， 减少脂肪蓄积， 并对胎儿和新生儿生长有益。美国 FDA 在 2000 年 批准， 可以用于动物营养重新配剂， 广泛地用于畜牧业和养殖业。 可以同时提高动物的日增 重， 提高饲料利用率， 提高动物的蛋白质含量。但由于 2- 兴奋剂易在动物脏器中积聚残留， 并可通过食物链进入人体， 严重危害人类健康。目前， 莱克多巴胺是最常用的添加剂之 一， 在我国滥用尤其严重， 其逐步取代克仑特罗， 成为不法分子谋取经济利益的新手段。建 立快速、 简单、 方便、 有效的检测手段是目前控制莱克多巴胺非法使用的迫切任务。
目前， 检测 RAC 残留的方法主要有以下几种 ： 高效液相色谱法 (HPLC)、 气相色 谱 - 质谱法 (GC-MS)、 液相色谱 - 质谱法 (LC-MS)、 毛细管区带电泳法 (CE) 以及免疫分析方法 (IA)。仪器方法虽然灵敏精确， 但需要昂贵的专业仪器， 分析费时， 成本较高。免疫分析 -1 方法具有简单、 快速、 灵敏及成本低的特点， 可达痕量 (μg kg ) 水平， 是目前世界各国推行 并实施的一种高通量初筛方法， 时间分辨免疫分析检测方法属于免疫分析方法的一种， 其 实际上是在荧光分析 (FIA) 的基础上发展起来的， 是一种特殊的荧光分析。
时间分辨免疫分析 (TRFIA) 的基本原理是其采用了特殊的镧系金属即三价稀土 3+ 离子 (Eu 、 Tb3+、 Dy3+、 Sm3+) 及螯合剂 ( 代替荧光物质、 同位素或酶 )。标记蛋白质、 多肽、 激 素、 抗体、 核酸探针或生物活性细胞， 待反应体系 ( 如抗原抗体反应、 核酸探针反应、 生物素 亲和素反应、 靶细胞与效应细胞的杀伤反应等 ) 发生后， 用时间分辨分析仪测定最后产物 中的荧光强度， 根据荧光值的强弱， 判断体系中分析物的浓度， 达到定量分析的目的。
时间分辨免疫分析检测方法在国外已被广泛应用于临床检测， 近年在许多新领域 得到应用， 如免疫组织化学、 微阵列， 并可用于双标记、 三标记和四标记等多标记免疫分析。 荧光免疫检测方法作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术， 已经给标记免疫学带来 一场革命。 本发明对免疫检测技术进一步应用于食品中兽药残留的快速检测提供一种新途 径。
但目前尚无采用时间分辨免疫分析法检测莱克多巴胺的相关技术报道， 更没有一 种适合进行莱克多巴胺时间分辨免疫分析检测的试剂盒， 以便于实现高灵敏度、 操作简单 的大批量快速检测。 发明内容
本发明的一个目的是克服现有技术的不足， 提供一种检测莱克多巴胺残留的时间 分辨免疫分析检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供所述检测莱克多巴胺残留的方法， 高灵敏度、 操作简 单， 能大批量快速检测。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现 ：
提供一种检测莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒， 包括包被了莱克 多巴胺抗原的酶标板、 莱克多巴胺抗体、 镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体 ( 二抗 ) ； 所述 3+ 3+ 3+ 3+ 镧系元素包括 Eu 、 Tb 、 Dy 、 Sm 等稀土元素。
所述莱克多巴胺抗原是碳二亚胺法 (EDC)、 活泼酯法 (DCC、 NHS)、 混合酸酐法 ( 氯 甲酸异丁酯 ) 将莱克多巴胺半抗原与载体蛋白进行偶联得到的。所述载体蛋白包括牛血清 白蛋白 (BSA)、 人血清白蛋白 (HSA)、 钥孔血蓝蛋白 (KLH) 等载体蛋白。
将莱克多巴胺与氯乙酸钠进行卤代反应， 取代莱克多巴胺分子上的羟基， 合成含 有 2 个碳的羧基间隔臂的莱克多巴胺半抗原 ； 或将顺丁烯二酸酐与莱克多巴胺中的氨基进 行酰化反应， 合成含有 4 个碳的羧基间隔臂的莱克多巴胺半抗原。
将含有 2 个碳的羧基间隔臂的半抗原用于免疫原的制备， 将含有 4 个碳的羧基间 隔臂的半抗原用于包被原的制备， 免疫原与包被原通过柱层析进行纯化， 纯度经 SDS-PAGE 电泳鉴定。本发明免疫原与包被原采用不同的半抗原结构将更有利于提高检测的灵敏度。
所述莱克多巴胺抗体包括单克隆抗体、 兔多克隆抗体或基因工程抗体。
单克隆抗体的制备 ：
动物免疫 ： 以含有 2 个碳的羧基间隔臂的半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c 小鼠进行间隔免疫， 间接免疫分析检测并得到血液里含有莱克多巴胺特异性抗体的 小鼠脾脏。
细胞融合与克隆 ： 取产生特异性抗体的 Balb/c 小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP20 融 合， 采用间接竞争时间分辨免疫分析方法测定细胞上清液， 筛选阳性孔。 利用有限稀释法或 显微克隆法对阳性孔进行克隆化， 得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏 ： 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液， 分装 于冻存管， 在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管， 立即放入 37℃水浴中速融， 离心去除冻 存液后， 移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化 ： 采用体内诱生法， 将 Balb/c 小鼠 (8 周龄 ) 腹腔注入灭 菌石蜡油， 7 ～ 14 天后腹腔注射杂交瘤细胞， 7 ～ 10 天后采集腹水。经辛酸 - 饱和硫酸胺 法或亲和层析法进行腹水纯化， 纯度经 SDS-PAGE 电泳鉴定， 小瓶分装， -20℃保存。
莱克多巴胺兔多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物， 以莱克多巴胺与载体蛋白偶联物为免疫原对新 西兰大白兔进行免疫， 多次免疫后测定血清抗体效价， 心脏采血， 经硫酸胺分级沉淀得到纯 化的多克隆抗体。 莱克多巴胺基因工程抗体的制备
基因工程抗体主要指小分子抗体， 包括 ： Fab( 由完整的轻链和 Fd 构成 )， Fv( 由 VH 和 VL 构成 )， ScFv( 单链抗体， VH 和 VL 之间由一条连接肽连接而成 )， 单域抗体 ( 仅由 VH 组 成 ) 等经基因工程技术改造后的抗体。
制备方法为 ： 提取莱克多巴胺单克隆细胞或经莱克多巴胺免疫原免疫后的小鼠 脾细胞的 RNA， 反转录为 cDNA， 设计抗体轻重链扩增引物， 利用 PCR 技术扩增出抗体的轻 重链基因， 插入适当的表达质粒， 在大肠杆菌中表达， 利用免疫亲和方法进行纯化， 纯度由 SDS-PAGE 电泳鉴定。
所述镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体的制备， 以 Eu3+ 标羊抗兔为例， 取溶 解 于 0.05mol/L PBS pH7.0 的 5mg/mL 羊 抗 鼠 IgG 1ml， 经 PD-10 柱 转 换 缓 冲 盐 条 件， 洗 脱 液 为 50mmol/L pH 9.6NaCO3-NaHCO3 缓 冲 液。 收 集 蛋 白 峰， 经紫外吸收分析定量 (1.46A280-0.74A260)， 用上述洗脱液稀释羊抗鼠至 2mg/mL。取 500μL 稀释后的羊抗鼠 IgG 3+ 加入含 0.2mg 的 Eu -N2-[p- 异氰酸 - 苄基 ]- 二乙酸烯三胺四乙酸 (Eu3+-DTTA) 的棕色小 瓶中， 置于 28℃恒温烘箱中反应 48h， 反应液用 50mmol/L Tris-HCl pH 7.8 缓冲液平衡的 SepharoseCL-6B(1×30cm) 层析， 测定每管的荧光计数值， 检测稀释后的第一个计数峰， 稀 释后备用。
标记率＝标记个 /IgG 分子数
为了方便现场操作和批量检测， 所述试剂盒还可以包括莱克多巴胺标准溶液、 增 强液、 浓缩洗涤液、 样品稀释浓缩液。
优选地， 还可以包括盒体、 包被缓冲液、 洗涤缓冲液、 封闭液和盖板膜。
所述莱克多巴胺标准溶液是浓度为 1000μg/L 的莱克多巴胺 (RAC) 标准品贮备 液， 使用前再配成浓度梯度为 8μg/L、 4μg/L、 2μg/L、 1μg/L、 0.5μg/L、 0μg/L 的莱克多 巴胺 (RAC) 标准品贮备液。
所述增强液包括 β- 二酮体、 三辛基氧化磷 (TOP0)、 TritonX-100、 冰醋酸和邻苯
二甲酸氢钾 (pH 值为 2.0 ～ 3.2) ； 将 6mL 冰醋酸用 0.1mol/L 的邻苯二甲酸氢钾调 pH 值至 3.2， 加入 15μmol β- 二酮体 (β-NTA)， 50μmol 三辛基氧化膦， 1mL Triton X-100， 加三 蒸水定容至 1L。
所述浓缩洗液包括 0.5 ～ 1.5％ ( 体积比浓度 )。吐温 20 的磷酸盐
缓冲液 (pH 值 7.4， 0.1mol/L)， 为常规使用浓度的 15 ～ 25 倍。
所述浓缩稀释液 pH 值 7.4 ～ 8.0、 0.1 ～ 0.25mol/L 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)， 为常规使用浓度的 5 ～ 15 倍。
酶标板是 96 孔酶标板， 采用聚苯乙烯微孔板， 该微孔板包被有浓度为 75μg/L 抗 莱克多巴胺抗原， 并封闭微孔表面未吸附位点 ； 以封闭液室温封闭， 所述封闭液包括溶于 PBS 的脱脂奶粉溶液 (5g 脱脂奶粉 ： 100mL PBS)。以稀释液稀释至终浓度 3％ ( 体积比浓 度 ) 的小牛血清 3mL( 灭活 )。
本发明主要试剂以工作液的形式提供， 节省操作时间， 试剂盒的制备方法如下 ：
(1) 包被了莱克多巴胺抗原的酶标板的制备方法 ： 将 RAC-OVA 以包被缓冲液稀释 为 75μg/L， 向酶标板微孔中加入抗原 100μL， 放入 4℃冰箱中包被过夜， 室温平衡后洗板 两次， 以脱脂奶粉封闭液 (250μL)37℃封闭 1h， 洗板三次， 用无尘吸水纸上拍干， 干燥后用 铝膜真空密封保存。 固定莱克多巴胺抗原载体为以下物质中的一种， 例如聚苯乙烯、 硝酸纤 维素、 聚乙烯、 聚丙烯、 聚丙烯酰胺、 交联葡萄糖、 玻璃、 硅橡胶或琼脂糖凝胶等。 (2)RAC 抗体稀释液的制备方法 ： 将 RAC 单克隆抗体用辛酸 - 硫酸铵法纯化后， 用 PBS 稀释成 1mg/mL 分装备用。
(3)Eu3+ 标羊抗鼠 ： 用含 0.2％的 pH 7.85Tris-HCl 稀释 200 倍
(4) 莱克多巴胺标准溶液的配制 ： 以浓度为 1000μg/L 的 RAC 作为贮备液， 使用前 再配成浓度梯度为 0、 0.1、 0.3、 0.9、 2.7、 8.1μg/L 的 RAC 标准品工作液。
(5) 增强液的配制 ： 6mL 冰醋酸用 0.1mol/L 的邻苯二甲酸氢钾调 pH 值至 3.2， 加
入 15μmol- 二酮体 (-NTA)， 50μmol 三辛基氧化膦 (TOPO)， 1mL Triton X-100， 加三蒸水定容至 1L。
(6) 包 被 缓 冲 液 的 配 制 ：取 Na2CO30.375g， NaHCO30.732g， NaCl 2.250g， NaN30.100g， 加蒸馏水至 250mL， 得 0.1mol/L 碳酸盐缓冲液。
(7) 洗涤缓冲液 (PBST) 的配制 ： 取 KH2PO40.4g， Na2HPO4·12H2O5.8g， NaCl 16.0g， KCl 0.4g， Tween-201.0mL， 加蒸馏水至 2000mL。
(8) 封闭液 ： 1) 脱脂奶粉 5g 溶于 100mL PBS ； 2) 小牛血清 3mL( 灭活 )， 以稀释液 稀释至终浓度 3％。
(9) 稀 释 液 (50mmol/L Tris-HCl， pH 7.85) ： 取 Tris-base 6.4g， NaCl 9.0g， NaN30.4g， 以浓 HCl(12M) 调整其 pH 值为 7.85， 加蒸馏水定容至 1L。
本发明同时提供了检测莱克多巴胺残留的方法， 包括以下步骤 ：
(1) 样品前处理 ；
a. 尿液样本处理
清澈尿液样品可以直接进行检测分析。若尿样呈浑浊状， 2000r/min 离心 5min 或 过滤， 用上清液检测。
b. 饲料样本处理将饲料粉碎， 称取 2g 置于 50mL 试管中， 加入 12mL10％氨化甲醇 (pH 值为 9 ～ 10 的 氨水溶液 9 份 + 甲醇 1 份 )， 充分混匀振荡 1~2min。 加入 9mL 乙酸乙酯， 振荡 20min。 5000r/ min(4000g) 离心 10min。取有机相 500μL 于另一试管中， 用氮气吹干。加入样品稀释液 500μL 稀释后直接检测。稀释倍数 10 应在结果计算中考虑。
c. 组织 ( 肌肉、 肝脏、 肾脏等 ) 样本处理
将组织破碎， 用超声仪或类似仪器将组织均质化， 称取 2g 均质化后的组织样本置 于可密封的试管中， 加 10mL 纯甲醇， 涡旋混匀 5min。 10000r/min 离心 5min 或 3000r/min 离 心 20min， 取上清。沉淀中再加入 10mL 纯甲醇， 涡旋混匀后离心 ( 方法同前 )， 取上清。混 匀两次离心上清， 取出 10mL 用氮气吹干。取 1mL 样品稀释液重新充分溶解后用于检测 ( 注 意： 溶解后请立即进行分析检测 )。稀释倍数为 1。
(2) 利用本发明试剂盒对标准溶液和样品进行检测。
(3) 根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。
应用所述试剂盒进行检测具体包括以下步骤 ：
(1) 将试剂盒从冷藏环境中取出， 置于 20 ～ 24℃环境中平衡不少于 30min， 将酶标 板条固定， 做两个平行实验， 按顺序编号。 (2) 在标准品孔加入 50μL 标准溶液， 样品孔加 / 入 50μL 待测样品， 然后每孔加 入 50μL 莱克多巴胺单克隆抗体工作液， 混匀 ； 振荡反应 45min。
(3) 待反应后洗板六次， 并在吸水纸上拍干， 以保证完全除去孔中的液体。每孔加 入 100μL 铕标二抗工作液， 振荡反应 45min。
(4) 待反应后洗板六次， 并在吸水纸上拍干， 以保证完全除去孔中的液体。每孔加 入 200μL 增强液， 混匀， 避光室温轻拍振荡 5min。
(5) 用时间分辨免疫分析 (TRFIA) 检测仪测定各孔荧光值。
(6) 根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线， 根据标准曲线与样品溶液荧 光值计算样品浓度。
检测结果处理与分析 ：
以所获标准样品吸光值的平均值计算百分荧光值， 以百分荧光值为纵坐标， 莱克 多巴胺标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线， 求出直线方程。用同样的方法计算 样品溶液的百分荧光值， 根据方程式求出对应样品的莱克多巴胺浓度。所述百分荧光值的 计算式为 ：
百分荧光值 (％ ) ＝ (B/B0)×100
其中， B 为标准溶液或样品的平均荧光值， B0 为 0μg/L 标准溶液的平均荧光值。
检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析， 对莱克多巴胺线性 检测范围为 0.1 ～ 8.1μg/L， 检测限可达到 0.01μg/L， 整个检测过程需 2h 就可以完成。
本发明的有益效果 ：
本发明采用镧系元素作标记物， DTTA 为螯合剂， 建立了对莱克多巴胺的定量分析 方法， 此法操作流程短、 简单、 快速， 精密度和准确度均较好， 样品前处理简单， 尤其是采用 3+ 铕 (Eu ) 作标记物， DTTA 为螯合剂， 效果好， 成本低。
浓缩洗涤液为含 0.5 ～ 1.5％吐温 20 的磷酸盐缓冲液 (pH7.4， 0.1mol/L)， 为正常 使用浓度的 15 ～ 25 倍 ； 所述样品稀释浓缩液为 pH7.4 ～ 8.0、 0.1 ～ 0.25mol/L 的磷酸盐
缓冲液， 为正常使用浓度的 5 ～ 15 倍。以便于减少体积， 方便在试剂盒中配备。
本发明采用密封保存的方式保证所述酶标板的空白板的荧光值低于 1000， 保证没 有稀土元素的污染。
本发明使用酸性增强液， 使铕离子 (Eu3+) 从螯合物中解离下来， 游离的 Eu3+ 在三辛 基氧化膦协同下， 重新与 β- 二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在 激发光激发下， 铕离子获能， 经过电子跃迁并返回基态， 便可发射出极强的荧光信号， 在时 -18 3+ 间分辨免疫 (TRFIA) 分析仪上读出其荧光值， 其灵敏度可达 16×10 molEu 。 附图说明
图 1 莱克多巴胺 (RAC) 的半抗原一级 ESI-MS 图谱 图 2 莱克多巴胺 (RAC) 的半抗原二级 ESI-MS 图谱 图 3 标准曲线具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。 下述实施例中所使用的试验 方法如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 为可从商业途径 得到的试剂和材料。
实施例 1 半抗原的制备
莱克多巴胺半抗原的合成路线如下所示 ：
将盐酸莱克多巴胺与琥珀酸酐溶于无水吡啶中在室温搅拌反应。反应结束经萃 取， 除去吡啶和未反应的原料， 于真空旋转蒸发器上减压蒸干， 得到半抗原莱克多巴胺 - 琥 珀酸酯粗产物。以上反应后处理过程用 TLC 实时监控。粗产物经柱层析纯化得到较纯的半 抗原， 用 ESI-MS 进行鉴定。
莱克多巴胺半抗原的 (+)ESI-MS 全扫描质谱见图 1 所示， 图中出现 m/z 400 的分 子离子峰， 与半抗原分子质量对应。为了进一步确定其结构， 对 m/z 400 的分子离子进行了 (+)ESI-MS2 分析， m/z400 的分子离子裂解后出现 m/z 384.2、 284.2、 236.2、 164.3 等碎片离 子峰， 都能合理归属， 见附图 2 所示， 因此 m/z 400 分子离子可归属为半抗原莱克多巴胺琥 珀酸酯。
实施例 2 抗原的制备
莱克多巴胺抗原的制备 ：
a. 将 50μmol/L 莱克多巴胺半抗原溶解在 1mL 的二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 然后在 该溶液中加入等摩尔的二环己基碳二亚胺 (DCC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， 让其在室温 下反应过夜 ；
b. 离心， 取上清液 800μL， 缓慢加入到 4mL 15mg/mL 的 BSA 或 OVA 载体蛋白碳酸
缓冲溶液中， 然后在磁力搅拌下反应 4h ；
c. 待反应完成后， 装入透析袋， 先用蒸馏水透析 2 次， 然后用 0.8％生理盐水透析， 得产物 ；
d. 采用紫外扫描测定结合比 ( 陈新建等， 1998)， 最后将抗原浓缩保存或冻干保存 得到莱克多巴胺免疫原和包被原， 分装保存于 -20℃的冰箱中。
实施例 3 抗体的制备
单克隆抗体的制备 ：
动物免疫程序 ： 采用 Balb/c 小鼠作为免疫动物， 以莱克多巴胺半抗原与牛血清白 蛋白偶联物为免疫原， 免疫剂量为 60μg/ 只， 首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合 制成乳化剂， 腹腔注射， 间隔 3 周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化， 加强 免疫一次， 四免后腹腔加强免疫一次， 3 天后取脾细胞。
细胞融合与克隆化 ： 取免疫 Balb/c 小鼠脾细胞， 按 4 ∶ 1 比例与 SP2/0 骨髓瘤细 胞融合， 采用间接竞争时间分辨免疫分析方法测定细胞上清液， 筛选阳性孔。 利用显微克隆 法对阳性孔进行克隆化， 直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏 ： 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成 5×106 个 /mL 的 细胞悬液， 分装于冻存管， 在 -70℃超低温冰箱中长期保存。复苏时取出冻存管， 立即放入 37℃水浴中速融， 离心去除冻存液后， 移入培养瓶内培养。 单克隆抗体的制备与纯化 ： 采用体内诱生法， 将 Balb/c 小鼠 (8 周龄 ) 腹腔注射杂 6 交瘤细胞 5×10 个 / 只， 14 天后采集腹水。用免疫层析法进行腹水纯化， 小瓶分装， -20℃ 保存。
(2) 莱克多巴胺兔多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物， 以莱克多巴胺与载体蛋白偶联物为免疫原对新 西兰大白兔进行免疫， 首次免疫以 100μL 抗原和 100μL 完全佐剂充分乳化后免疫， 第二、 三、 四次免疫以 100μL 抗原和 100μL 不完全佐剂充分乳化免疫， 后测定血清抗体效价和抑 制， 心脏采血， 经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
(3) 莱克多巴胺基因工程抗体的制备
基因工程抗体主要指小分子抗体， 包括 ： Fab( 由完整的轻链和 Fd 构成 )， Fv( 由 VH 和 VL 构成 )， ScFv( 单链抗体， VH 和 VL 之间由一条连接肽连接而成 )， 单域抗体 ( 仅由 VH 组成 ) 等经基因工程技术改造后的抗体。
制备方法为 ： 提取莱克多巴胺单克隆细胞或经莱克多巴胺免疫原免疫后的小鼠脾 细胞的 RNA， 反转录为 cDNA， 设计抗体轻重链扩增引物， 利用 PCR 技术扩增出抗体的轻重链 基因， 插入适当的表达质粒 (TG1 菌株， 市购 )， 在大肠杆菌中表达， 利用免疫亲和方法进行 纯化， 纯度由 SDS-PAGE 电泳鉴定。
其中 VH(Back)、 VH(For) 两条引物用于扩增抗体重链可变区基因 VH ； VL(Back)、 VL(For) 两条引物用于扩增抗体轻链可变区基因 VL ； Linker1、 Linker2 两条引物作为接头引 物用于重叠延伸 PCR 法拼接 VH、 VL 基因片段成 scFv 基因片段， 此接头引物内含编码连接肽 (Gly4Ser)3 基因片段， 5′端与 VH 片段端 3′互补， 3′端与 VL 片段 5′端互补。RS(Back)、 RS(For) 两条引物用于二次 PCR 扩增全长 scFv 基因片段， 同时引入 BgI 及 Not I 酶切位点。 R1、 R2 两条引物为载体上引物， 用于载体插入片段的 PCR 鉴定。
VH(Back) VH(For) VL(Back) VL(For) Linker1 Linker2 RS(Back) RS(For) R1 R25 -CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG-3 5 -TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3 5 -GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3 5 5 -GGC ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA 5 -CCG TTT TAT TTC CAG CCT GGT CCC-3 GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GG-3 -TGG AGA CTG AGT GAG CTC GAT GTC CGA TCC GCC ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC-3 5 -GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG 5 -GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC( 含 Bgl I 位点 )GCC CAG GTC AAA CTG CAG GAG TCA GG-3 ( 含 Not I 位点 )CAG CCT GGT CCC-3 5 -CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3 5 -CGA TCT AAA GTT TTG TCG TCT TTC C-3VL 的扩增条件 ： 反应溶液涡旋混匀， 短暂离心后， 进行 PCR 扩增反应， 反应过程及 条件为 ： 94 ℃ ×5min 变性， 加入 1μL 高保真 Pfu 酶 (2.5U)， 进行以下循环 ： 94 ℃ ×30s， 54℃ ×1min， 72℃ ×1min， 共 25 个循环， 最后 72℃延伸 10min。反应完毕后， VL 反应产物取 5μL 进行 1％琼脂糖凝胶电泳检测。
VH 的扩增条件 ： 反应溶液涡旋混匀， 短暂离心后， 进行 PCR 扩增反应， 反应过程及 条件为 ： 94 ℃ ×5min 变性， 加入 1μL 高保真 Pfu 酶 (2.5U)， 进行以下循环 ： 94 ℃ ×30s， 60℃ ×1min， 72℃ ×1min， 共 30 个循环， 最后 72℃延伸 10min。反应完毕后， VH 反应产物取 5μL 进行 1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(1)scFv 基因片段拼接及 PCR 扩增 ：
重叠延伸反应
首先按以下反应体系进行 linker 的预拼接 ：
Linker1 引物 (10μmol/L) 0.5μL
Linker2 引物 (10μmol/L) 0.5μL
10×PCR Buffer 5μL
dNTP(2.5mmol/L) 4μL
去离子水 34.5μL
总体积 44.5μL
反应溶液涡旋混匀， 短暂离心。于 PCR 仪上 94℃ ×5min 预变性， 加入 0.5μL 高保 真 Pfu 酶， 进行以下循环 ： 94℃ ×45s， 50℃ ×1min， 72℃ ×1min， 共 3 个循环。
在上面体系中补加 VH， VL 进行 scFv 的拼接 ：
VH 纯化产物 (50ng) 3μL
VL 纯化产物 (50ng) 2.5μL
Linker 预拼接溶液 44.5μL
总体积 50μL
先后将 VH， VL 加入后， 用枪轻轻混匀。 于 PCR 仪上 94℃ ×5min 预变性， 补加 0.5μL 高保真 Pfu 酶， 进行以下循环 ： 94℃ ×45s， 50℃ ×1min， 72℃ ×1min， 共 30 个循环， 72℃延 伸 10min。
(2)scFv 基因的 PCR 扩增
采用以下反应体系 ：
拼接产物 4μL
5×PCR Buffer 10μL
dNTP(2.5mmol/L) 4μL
RS(Back) 引物 (10μmol/L) 1μL
RS(For) 引物 (10μmol/L) 1μL
无菌纯水 30μL
总体积 50μL
混合均匀， 短暂离心后， 于 PCR 仪上， 94℃ ×2min 预变性， 加入 0.5μL 高保真 Pfu 酶， 进行以下循环 ： 94 ℃ ×45s， 60 ℃ ×1min， 72 ℃ ×1min， 共 30 个循环， 最后 72 ℃延伸 10min。取 5μL 反应产物进行电泳检测。
实施例 4Eu3+ 标记羊抗鼠的制备和纯化
取溶解于 0.05mol/L PBS pH7.4 的 5mg/mL 羊抗鼠 IgG 1ml， 经 PD-10 柱转换缓冲 盐条件， 洗脱液为 50mmol/L pH 9.6NaCO3-NaHCO3 缓冲液。收集蛋白峰， 经紫外吸收分析定 量 (1.46A280-0.74A260)， 用上述洗脱液稀释羊抗鼠至 2mg/mL。 取 500μL 稀释后的羊抗鼠 IgG 3+ 加入含 0.2mg 的 Eu -N2-[p- 异氰酸 - 苄基 ]- 二乙酸烯三胺四乙酸 (Eu3+-DTTA) 的棕色小 瓶中， 置于 28℃恒温烘箱中反应 48h， 反应液用 50mmol/L Tris-HCl pH 7.8 缓冲液平衡的 SepharoseCL-6B(1×30cm) 层析， 测定每管的荧光计数值， 检测稀释后的第一个计数峰， 稀 释后备用。
标记率＝标记个 /IgG 分子数
实施例 5 时间分辨免疫分析试剂盒组分的配制
(1) 浓缩洗涤缓冲液的配制 ： 含 0.5 ～ 1.5 ％吐温 20 的磷酸盐缓冲液 (pH7.4， 0.1mol/L)， 为正常使用浓度的 15 ～ 25 倍。
(2) 样品稀释浓缩液的配制 ： pH7.4 ～ 8.0、 0.1~0.25mol/L、 含有的磷酸盐缓冲液， 为正常使用浓度的 5 ～ 15 倍。
(3) 封闭液的配制 ： 脱脂奶粉 1.0 ～ 5.0g 溶于 100mL 蒸馏水。
(4) 增强液的配制 ： 6mL 冰醋酸用 0.1mol/L 的邻苯二甲酸氢钾调 pH 值至 3.2， 加
入 15μmol- 二酮体 (-NTA)， 50μmol 三辛基氧化膦 (TOPO)， 1mL Triton X-100， 加三蒸水定容至 1L。
(5) 酶标板微孔板的包被 ： 包被抗原用 pH9.6， 0.05mol/L 的碳酸盐缓冲溶液 ( 含 1 ～ 2g 碳酸钠和 2 ～ 4g 碳酸氢钠， 双蒸水 1L) 稀释成 0.1 ～ 5ug/mL， 在酶标板的每孔加 100uL， 37℃包被 1h 后 4℃下包被过夜， 倾去包被液， 用 PBST 洗涤 3 次， 拍干， 然后在每孔中 加入 200uL1.0 ～ 5.0％脱脂奶粉， 放入 37℃温箱中 1h 后用 PBST 洗涤 3 次， 干燥后封入铝箔袋中 4℃保存。
(6) 莱克多巴胺标准溶液的配制 ： 准确称取莱克多巴胺标样 8.1mg， 溶于 0.1L 缓冲 液中， 然后用缓冲液稀释分别配制 8.1μg/L、 2.7μg/L、 0.9μg/L、 0.3μg/L、 0.1μg/L 莱 克多巴胺溶液， 另外缓冲液配制 0μg/L 对照样， 4℃保存。
(8) 试剂分装 ： 各种试剂按要求配制， 测定合格后无菌分装莱克多巴胺抗体工作 液 7mL/ 瓶， 莱克多巴胺标准样品 1mL/ 瓶， 二抗工作液 10mL/ 瓶， 增强液 20mL/ 瓶， 浓缩洗液 50mL/ 瓶， 浓缩样品稀释液 50mL/ 瓶。分装后贴标签， 注明批号和有效期， 4℃保存。
(9) 试剂盒的组装 ： 分别将可拆卸包被好包被抗原的微孔板 1 块， 莱克多巴胺抗体 工作液、 二抗工作液、 增强液、 浓缩洗液、 莱克多巴胺标准溶液、 浓缩样品稀释液各 1 瓶， 莱 克多巴胺标准溶液 6 瓶， 使用说明书 1 份置试剂盒内指定位置。 试剂盒检验合格后封装， 4℃ 保存。
实施例 6 检测莱克多巴胺的时间分辨免疫分析试剂盒的组建
组建检测莱克多巴胺的时间分辨免疫分析试剂盒， 包括包被了莱克多巴胺抗原的 酶标板、 莱克多巴胺抗体、 镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体， 其他工作液可以在检验室配 备。
如果为了大批量快速的检测样品中莱克多巴胺， 组建的检测莱克多巴胺的时间分 辨免疫分析试剂盒包括下述组分 ：
(1) 包被莱克多巴胺抗原的酶标板， 96 孔 ；
酶标板是 96 孔酶标板， 采用聚苯乙烯微孔板， 该微孔板包被有浓度为 75μg/ L 抗莱克多巴胺抗原， 并封闭微孔表面未吸附位点 ； 所述封闭指以浓度为 5 ％脱脂奶粉的 PBS( 以重量比 ) 封闭液室温封闭。
(2) 莱克多巴胺抗体工作液， 7mL/ 瓶 ； 浓度为 2mg/mL ；
(3) 铕标二抗工作液， 10mL/ 瓶 ； 标记率为 11.2， 浓度为 0.15mg/mL ；
(4) 莱 克 多 巴 胺 标 准 品 溶 液 6 瓶， 浓 度 分 别 为 0μg/L、 0.1μg/L、 0.3μg/L、 0.9μg/L、 2.7μg/L、 8.1μg/L， 1mL/ 瓶 ；
(5) 增强液， 7mL/ 瓶 ；
(6) 浓缩洗涤液， 50mL/ 瓶 ；
(7) 浓缩样品稀释液， 50mL/ 瓶 ；
(8) 使用说明书， 1份；
(9) 盖板膜， 2张；
(10) 自封袋 ( 含干燥剂 )， 1 个。
本发明的检测莱克多巴胺残留的荧光免疫分析试剂盒的制备方法包括以下步 骤：
(1) 包被了莱克多巴胺抗原的酶标板的制备方法 ： 将 RAC-OVA 以包被缓冲液稀释 为 75μg/L， 向酶标板微孔中加入抗原 100μL， 放入 4℃冰箱中包被过夜， 室温平衡后洗板 两次， 以脱脂奶粉封闭液 (250μL)37℃封闭 1h， 洗板三次， 用无尘吸水纸上拍干， 干燥后用 铝膜真空密封保存。 固定莱克多巴胺抗原载体为以下物质中的一种， 例如聚苯乙烯、 硝酸纤 维素、 聚乙烯、 聚丙烯、 聚丙烯酰胺、 交联葡萄糖、 玻璃、 硅橡胶或琼脂糖凝胶等。
(2)RAC 抗体稀释液的制备方法 ： 将 RAC 单克隆抗体用辛酸 - 硫酸铵法纯化后， 用PBS 稀释成 1mg/mL 分装备用。
(3)Eu3+ 标羊抗鼠 ： 用含 0.2％的 pH 7.85Tris-HCl 稀释 200 倍
(4) 莱克多巴胺标准溶液的配制 ： 以浓度为 1000μg/L 的 RAC 作为贮备液， 使用前 再配成浓度梯度为 0、 0.1、 0.3、 0.9、 2.7、 8.1μg/L 的 RAC 标准品工作液。
(5) 增强液的配制 ： 6mL 冰醋酸用 0.1mol/L 的邻苯二甲酸氢钾调 pH 值至 3.2， 加 入 15μmol - 二酮体 ( -NTA)， 50μmol 三辛基氧化膦 (TOPO)， 1mL Triton X-100， 加三 蒸水定容至 1L。
(6) 包 被 缓 冲 液 的 配 制 ：取 Na2CO30.375g， NaHCO30.732g， NaCl 2.250g， NaN30.100g， 加蒸馏水至 250mL， 得 0.1mol/L 碳酸盐缓冲液。
(7) 洗涤缓冲液 (PBST) 的配制 ： 取 KH2PO40.4g， Na2HPO4·12H2O5.8g， NaCl 16.0g， KCl 0.4g， Tween-201.0mL， 加蒸馏水至 2000mL。
(8) 封闭液 ： 1) 脱脂奶粉 5g 溶于 100mL PBS ； 2) 小牛血清 3mL( 灭活 )， 以稀释液 稀释至终浓度 3％。
(9) 稀 释 液 (50mmol/LTris-HCl， pH 7.85) ： 取 Tris-base 6.4g， NaCl 9.0g， NaN30.4g， 以浓 HCl(12M) 调整其 pH 值为 7.85， 加蒸馏水定容至 1L。 实施例 7 样品前处理
a. 尿液样本处理
清澈尿液样品可以直接进行检测分析。若尿样呈浑浊状， 2000r/min 离心 5min 或 过滤， 上清液用于检测。
b. 饲料样本处理
将饲料粉碎， 称取 2g 置于 50mL 试管中， 加入 12mL10％氨化甲醇 (pH9-10 的氨水 溶液 9 份 + 甲醇 1 份 )， 充分混匀振荡 1 ～ 2min。加入 9mL 乙酸乙酯， 振荡 20min。5000r/ min(4000g) 离心 10min。取有机相 500μL 于另一试管中， 用氮气吹干。加入样品稀释液 500μL 稀释后直接检测。稀释倍数 10 应在结果计算中考虑。
c. 组织 ( 检测用肌肉、 肝脏或肾脏等 ) 样本处理
将组织破碎， 用超声仪或类似仪器将组织均质化， 称取 2g 均质化后的组织样本置 于可密封的试管中， 加 10mL 纯甲醇， 涡旋混匀 5min。 10000r/min 离心 5min 或 3000r/min 离 心 20min， 取上清。沉淀中再加入 10mL 纯甲醇， 涡旋混匀后离心 ( 方法同前 )， 取上清。混 匀两次离心上清， 取出 10mL 用氮气吹干。取 1mL 样品稀释液重新充分溶解后用于检测 ( 注 意： 溶解后请立即进行分析检测 )。稀释倍数为 1。
实施例 8 试剂盒的检测方法
(1) 将试剂盒从冷藏环境中取出， 置于 20 ～ 24℃环境中平衡不少于 30min， 将酶标 板条固定， 做两个平行实验， 按顺序编号。
(2) 在标准品孔加入 50μL 标准溶液， 样品孔加入 50μL 待测样品， 然后每孔加入 50μL 莱克多巴胺单克隆抗体工作液， 混匀 ； 振荡反应 45min。
(3) 待反应后洗板六次， 并在吸水纸上拍干， 以保证完全除去孔中的液体。每孔加 入 100μL 铕标二抗工作液， 振荡反应 45min。
(4) 待反应后洗板六次， 并在吸水纸上拍干， 以保证完全除去孔中的液体。每孔加 入 200μL 增强液， 混匀， 避光室温轻拍振荡 5min。
(5) 用 TRFIA 检测仪测定各孔荧光值。
(6) 根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线， 根据标准曲线与样品溶液荧 光值计算样品浓度。
检测结果处理与分析 ：
以所获标准样品吸光值的平均值计算百分荧光值， 以百分荧光值为纵坐标， 莱克 多巴胺标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线， 求出直线方程， 直线方程为 y ＝ 2 48.17142-36.52x， R ＝ 0.99486。用同样的方法计算样品溶液的百分荧光值， 根据方程式 求出对应样品的莱克多巴胺浓度。所述百分荧光值的计算式为 ：
百分荧光值 (％ ) ＝ (B/B0)×100
其中， B 为标准溶液或样品的平均荧光值， B0 为 0μg/L 标准溶液的平均荧光值。
检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析， 对莱克多巴胺线性 检测范围为 0.1 ～ 8.1μg/L， 检测限可达到 0.01μg/L， 整个检测过程需 2h 就可以完成。
实施例 9 试剂盒精密度与准确度试验
1、 标准品溶液重复性试验
从 3 批 按 照 实 施 例 4(6) 中 的 方 法 制 备 的 酶 标 板 中， 各 抽 出 20 个 微 孔， 测定 0.9μg/L 标准溶液的荧光值 (CPS 值 )， 重复 20 次， 计算变异系数 CV％， 结果见表 1。
表 1 标准品溶液重复性试验
结果表明试剂盒标准品检测的批内变异系数范围在 3.9 ～ 5.9％之间， 批间变异 系数为 8.7％。
2、 样本重复性与准确度试验
准确度是指测得值与真值的符合程度， 在免疫分析测定中， 准确度常以回收率表 示， 精密度常以变异系数来表示。 在空白猪尿、 猪肝中， 将莱克多巴胺添加至终浓度为 1μg/ L(μg/kg)、 5μg/L(μg/kg)， 在 空 白 饲 料 中， 将 莱 克 多 巴 胺 添 加 至 终 浓 度 为 50μg/kg、 100μg/kg， 每个浓度各 10 个平行， 测定 3 批。计算平均值、 添加回收率及批内与批间变异 系数。结果见表 2。
表 2 样本重复性与准确度试验结果
结果表明尿样、 猪肝、 饲料样本的添加回收率在 81.0 ～ 105％之间， 批内变异系数 在 5.9 ～ 9.1％之间， 批间变异系数在 14.2 ～ 18.3％之间。实施例 10 保存期试验
(1) 将试剂盒放置于 2 ～ 8℃， 分别取 0、 2、 4、 6、 8、 9、 10、 11 和 12 个月的试剂盒， 对 莱克多巴胺标准样品 (0.1μg/L) 的荧光值、 50％抑制浓度、 添加回收率、 批内变异系数各 参数进行测定。
(2) 将 试 剂 盒 在 37 ℃ 保 存 的 条 件 下 放 置 12 天， 每天对莱克多巴胺标准样品 (0.1μg/L) 的荧光值、 50％抑制浓度、 添加回收率、 批内变异系数各参数进行测定。
(3) 将试剂盒在 -20℃冰箱保存 12 天， 每天对莱克多巴胺标准样品 (0.1μg/L) 的 荧光值、 50％抑制浓度、 添加回收率、 批内变异系数各参数进行测定。
从结果可看出， 经过三种条件保存试验， 莱克多巴胺标准样品 (0.1μg/L) 的荧光 值下降小于 5％， 且 CPS 不低于 100000 ； 50％抑制率在 0.5 ～ 1.0μg/L 之间 ； 其检测限可 达到 0.01μg/mL， IC50 可达到 0.2ng/mL ； 添加回收率在 80 ～ 110％之间 ； 批内变异系数在 5.9 ～ 9.1％之间， 小于 10％ ； 批间变异系数在 14.2 ～ 18.3％之间。各项指标均符合质量 要求， 因此， 试剂盒可以在 2 ～ 8℃保存 12 个月。