一种偶数200BP梯度DNA分子量标准及其快速制备方法.pdf

通过全新的基因工程手段构建一种超级质粒，通过大肠杆菌发酵和限制性内切酶酶切的方法制备一种偶数200bp梯度DNA分子量标准。DNA分子量标准是由7条DNA带组成的限制性内切酶酶切混合物，长度分别为：400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp；各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(2∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。快速制备方法包括7条DNA带是以质粒pYE9600酶切对象，通过大肠杆菌发酵和碱裂解法提取目标质粒pYE9600，经过纯化，用限制性内切酶EcoRI进行酶切消化，从而释放其中所含的200bp系列片段。

1.  一种偶数200bp梯度DNA分子量标准，其特征是由7条DNA带组成的限制性内切酶酶切混合物，长度分别为：400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp；各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(2∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。

2.  根据权利要求1所述的一种偶数200bp梯度DNA分子量标准的快速制备方法，7条DNA带是以质粒pYE9600酶切对象，通过大肠杆菌发酵和碱裂解法提取目标质粒pYE9600，经过纯化，用限制性内切酶EcoR I进行酶切消化，从而释放其中所含的200bp系列片段，其特征在于：
①取-20℃冷冻保存的pYE9600质粒2-5微升通过热激转化的方法将其转入大肠杆菌DH5α或JM109中，涂布于含有氨苄青霉素的平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养，第二天挑单菌落，用含有氨苄青霉素的LB液体培养基(5ml)培养至OD600＝0.8，转接于100ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇床剧烈震荡培养3-5小时，至OD600＝0.6时，继续以1∶100的比例转接于已37℃预热的含有氨苄青霉素的LB液体培养基(1000ml)中培养12-16小时；
②目标质粒pYE9600的大量制备及纯化，其过程包括以下步骤：
(1)于250ml离心瓶中4100-6000rpm常温或4℃收菌，离心时间为3-10分钟，获得菌体沉淀；用20ml的溶液I重悬菌体沉淀；并将之转入600ml的矿泉水瓶中；
(2)分别加入40ml新配制的溶液II，拧好盖子，轻轻颠倒数次，使内容物彻底混匀，室温下放置10-15分钟；
(3)分别加入30ml冰预冷的溶液III，拧好盖子，轻轻地但完全地颠倒、震荡混匀几次(此时不应再有分离的两个液相)；将矿泉水瓶在冰上放10-20分钟；
(4)将矿泉水瓶中的内容物转入离心瓶中，平衡后离心；
(5)6000rpm离心20分钟，将上清轻轻转入量筒中，弃去离心瓶中的沉淀；
(6)加30ml氯仿抽提；
(7)转入分液漏斗，静置5分钟，待分相后，分别收集下层的有机相(氯仿)和上层的水相；
(8)将水相10,000rpm离心10分钟；
(9)合并所有水相(加入10ul的RNase，室温静置10分钟)，量其体积，加入0.7倍体积的异丙醇，并充分混匀，室温下放置10-20分钟；
(10)室温下8000rpm离心15分钟，以回收核酸沉淀；
(11)小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清；
(12)室温下用5ml 70％的乙醇刷洗管底及管壁，小心的倒掉乙醇(注意防止沉淀物的倒出)，并将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉(15-20分钟)；
(13)5ml TE(pH8.0)溶解湿润的核酸沉淀；
(14)溶解后得到的质粒溶液用等体积的酚-氯仿抽提3遍，以充分去除蛋白质，获得澄清的液体；
③利用所获得的pYE9600质粒建立酶切反应体系，其中反应缓冲液的体积为反应总体积的1/10；加入适量的内切酶，充分混匀后于37℃水浴保温20-50个小时；之后将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液(TAE)，使凝胶浸于液面下约3mm，将部分酶解产物取出并进行梯度稀释，加入适量的凝胶上样缓冲液(loading buffer)并混合，用移液枪将之加入凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳，使核酸分子向阴极泳动，当溴酚兰泳动到凝胶的三分之二处时停止电泳，在紫外透射仪上观察酶切产物的纯度及产量；
④所得的偶数200bp梯度DNA分子量标准的纯化：用酚∶氯仿为1∶1的混合溶剂抽提，去除其中的蛋白质(主要是内切酶)成份，一般经过2-3次的抽提即可达到满意的效果；通过向体系中加入适量的TE缓冲液，将3000bp的DNA条带定量为150ng，其他条带的量依次为(从大到小)100ng、70ng、50ng、40ng、30ng、20ng。

一种偶数200bp梯度DNA分子量标准及其快速制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学试剂制备和基因工程应用领域，具体来说就是通过基因工程手段构建超级质粒，通过大肠杆菌发酵和限制性内切酶酶切的方法制备一种偶数200bp梯度DNA分子量标准。
背景技术
在DNA合成及各种方式的基因操作过程中，需要对合成的或进行操作的DNA分子大小变化进行监测，常用的方法是通过将待测DNA分子与一种已知分子量的DNA混合标准物(分子量标准、DNA marker)同时进行电泳，通过比较待测DNA分子与DNA分子标准在电泳过程中的迁移距离来判断DNA样品分子的大小。因此，需要制备一些已知分子量的标准DNA混合物。
现有技术中制备标准DNA的方法已有多种方法：
化学合成法：通过化学反应的方法将4种不同的脱氧核糖核苦酸：腺嘌呤(dATP)，鸟嘌呤(dGTP)，胞嘧啶dCTP)，胸腺嘧啶(dTTP)结合在一起，合成目标大小的DNA片段。该方法操作十分繁琐，效率极低，合成的DNA长度受到严重的限制，一般可合成DNA的长度不超过400bp，大分子量的DNA片段无法直接用化学合成法来合成，成本太高，因而不适用DNA分子量的常规制备。
片段连接法：先用PCR或者合成的方法获得小分子量的DNA分子(如100bp)，再用酶促连接反应将小分子DNA一个一个顺序连接起来，形成不同大小的DNA分子(100bp、200bp、300bp、400bp、…)。该方法理论上讲可以制备各种大小的DNA分子，但操作却十分繁琐，可再现性差，无法实现大规模制备。
聚合酶链反应法：DNA聚合酶链反应已广泛用于基因克隆和DNA片般的制备。目前国内外已被广泛用来制备DNA分子量标准物。但是该方法费时费力，是一种劳动密集型的生产方式，其生产能力有限。
酶切法：用一种或两种限制性内切酶组合对噬菌体DNA或人工设计的质粒进行切割，产生不同大小的DNA片段，以作为DNA分子量标准。该方法的优点是容易大量制备，产率高。但该方法的缺点也很突出：酶切产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，其制约因素是人工构建质粒的设计水平。
长期以来，分子生物学试剂与基因工程应用领域，需要一种设计水平高、制备方便的偶数200bp梯度DNA分子量标准，以及该偶数200bp梯度DNA分子量标准快速生产方法(生产工艺)。
发明内容
经过长期的实验室研究，本发明恰恰满足了上述需求，其目的在于：提供一种偶数200bp梯度DNA分子量标准。
本发明的进一步目的在于：提供一种快速、大量地制备一种偶数200bp梯度DNA分子量标准的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增了400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp几条片段，其中1400bp和1000bp通过pfu DNA聚合酶进行扩增，而400bp-A、400bp-B、600bp、800bp分别用Taq DNA聚合酶进行扩增。然后利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1400bp和1000bp两条片段加T。再利用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使600bp、800bp、1000bp连接成一个600-1000-800的单元，同样400bp-A、400bp-B和1400bp连接成400A-1400-400B的单元。然后通过T/A克隆试剂盒，把上述两个单元分别克隆到T载体中形成中间载体T681和T4144。
通过Pst I酶切将400A-1400-400B单元从T4144中切出来，并利用核酸纯化回收试剂盒进行回收和纯化。同时T681载体也被Pst I酶切完全酶切，并利用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连。建立合适的连接体系，把400-1400-400单元连接进脱磷处理的T681载体所得中间载体命名为T6814144。通过与上述过程相近的技术路线，利用PCR方法从Lambda DNA中扩增获得一个2000bp的片段，并克隆到T载体中，然后用内切酶Sph I再切出来，连入同样Sph I酶切和CIAP脱磷处理的T6814144，获得质粒pYE9600。
所获得的pYE9600是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中含有400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp六条片段，其中400bp为双拷贝，以增强其凝胶电泳后染色观察时的荧光强度。质粒pYE9600经EcoR I酶切后可以获得一个由7条片段组成的200bp偶数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(4∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。
限制性内切酶切割DNA分子的原理：
核酸限制性内切酶能够专一识别DNA双链上某碱基顺序，如若用EcoRI酶切只有一个切点的环状双链DNA分子，就能产生两个带有AATT碱基顺序的粘性末端的线状DNA分子。核酶限制性内切酶作用于底物DNA时，受到许多要素的制约，主要有以下几个：
1)底物DNA样品的纯度：在制备DNA样品中，由于各种条件的影响，存在着一些非DNA物质，这些物质有的对酶切反应影响较大，如抽提过程中，有机物质的残留成份：酚、氯仿、酒精，都会破坏酶的活性，另外未除去的蛋白质，也会干扰酶的反应，残留的染色体DNA则会相对降低酶对底物DNA的浓度。
2)离子浓度：限制性核酸内切酶专一性需要镁离子以作为辅基。并且要求一定的盐离子浓度，在使用上，通常把限制性核酸内切酶对盐离子的要求分为三类：高盐、中盐和低盐，它们所需的Na+分别为100mmol/L、50mmol/L。如果离子浓度使用不当，酶反应不完全或会使酶的识别位点发生改变，例如高盐类的EcoRI酶当Na⁺离子浓度低于50mmol/L时，它的专一性就降低。只能识别中间的4个核苷酸序列(此活性记为EcoRI^*)由于EcoR I酶切反应需要高盐缓冲液，在中盐缓冲液中反应比较慢，Hind III酶切反应需要中盐缓冲液，实验要求EcoRI与Hind III酶同时消化DNA时，而酶切反应要完全，则选用了中盐缓冲液。
3)底物DNA的量：商品限制性内切酶以酶单位计算，一个酶单位的定义是：在规定的温度和缓冲液内，于20微升反应液内1小时完全消化1微克DNA所需要的酶量。所以若是底物DNA的量超过酶的酶单位所规定的消化量，则反应不能完全。不过商品酶多是浓溶液，每微升含10单位以上，价格昂贵，所以使用时要尽量节省。
4)酶反应温度与酶反应终止：大部分限制性核酸内切酶最适的反应温度在37℃，极个别在60℃，所以酶反应后要使酶的活性失活时，可把反应液置于65℃内保温10-15分钟，以终止酶反应，但此法对个别酶(最适温度在60℃的酶)不适合。
5)酶切反应时间：酶消化时间通常依酶的浓度、底物的浓度和纯度而定，通常是30分钟到2个小时，甚至更长些，但不能过长。因为商品酶极有可能含有杂酶，时间过久，微量杂酶的酶反应也会积累到干扰整个酶切反应的程度。
一、材料：
1质粒pGM-T easy为通用质粒，为闭环状超螺旋结构DNA，全长为3015bp，其核酸序列如下所示。该质粒保存在大肠杆菌DH5α中，购自北京天为时代公司，并保存于本实验室，由其制备的T载体为自制产品。
1     GGGCGAATTG    GGCCCGACGT    CGCATGCTCC    CGGCCGCCATGGCGGCCGCG
51    GGAATTCGAT^*   ATCACTAGTG    AATTCGCGGC    CGCCTGCAGGTCGACCATAT
101   GGGAGAGCTC    CCAACGCGTT    GGATGCATAG    CTTGAGTATTCTATAGTGTC
151   ACCTAAATAG    CTTGGCGTAA    TCATGGTCAT    AGCTGTTTCCTGTGTGAAAT
201   TGTTATCCGC    TCACAATTCC    ACACAACATA    CGAGCCGGAAGCATAAAGTG
251   TAAAGCCTGG    GGTGCCTAAT    GAGTGAGCTA    ACTCACATTAATTGCGTTGC
301   GCTCACTGCC    CGCTTTCCAG    TCGGGAAACC    TGTCGTGCCAGCTGCATTAA
351   TGAATCGGCC    AACGCGCGGG    GAGAGGCGGT    TTGCGTATTGGGCGCTCTTC
401   CGCTTCCTCG    CTCACTGACT    CGCTGCGCTC    GGTCGTTCGGCTGCGGCGAG
451   CGGTATCAGC    TCACTCAAAG    GCGGTAATAC    GGTTATCCACAGAATCAGGG
501   GATAACGCAG    GAAAGAACAT    GTGAGCAAAA    GGCCAGCAAAAGGCCAGGAA
551   CCGTAAAAAG    GCCGCGTTGC    TGGCGTTTTT    CCATAGGCTCCGCCCCCCTG
601   ACGAGCATCA    CAAAAATCGA    CGCTCAAGTC    AGAGGTGGCGAAACCCGACA
651   GGACTATAAA    GATACCAGGC    GTTTCCCCCT    GGAAGCTCCCTCGTGCGCTC
701   TCCTGTTCCG    ACCCTGCCGC    TTACCGGATA    CCTGTCCGCCTTTCTCCCTT
751   CGGGAAGCGT    GGCGCTTTCT    CATAGCTCAC    GCTGTAGGTATCTCAGTTCG
801   GTGTAGGTCG    TTCGCTCCAA    GCTGGGCTGT    GTGCACGAACCCCCCGTTCA
851    GCCCGACCGC    TGCGCCTTAT    CCGGTAACTA    TCGTCTTGAGTCCAACCCGG
901    TAAGACACGA    CTTATCGCCA    CTGGCAGCAG    CCACTGGTAACAGGATTAGC
951    AGAGCGAGGT    ATGTAGGCGG    TGCTACAGAG    TTCTTGAAGTGGTGGCCTAA
1001   CTACGGCTAC    ACTAGAAGGA    CAGTATTTGG    TATCTGCGCTCTGCTGAAGC
1051   CAGTTACCTT    CGGAAAAAGA    GTTGGTAGCT    CTTGATCCGGCAAACAAACC
1101   ACCGCTGGTA    GCGGTGGTTT    TTTTGTTTGC    AAGCAGCAGATTACGCGCAG
1151   AAAAAAAGGA    TCTCAAGAAG    ATCCTTTGAT    CTTTTCTACGGGGTCTGACG
1201   CTCAGTGGAA    CGAAAACTCA    CGTTAAGGGA    TTTTGGTCATGAGATTATCA
1251   AAAAGGATCT    TCACCTAGAT    CCTTTTAAAT    TAAAAATGAAGTTTTAAATC
1301   AATCTAAAGT    ATATATGAGT    AAACTTGGTC    TGACAGTTACCAATGCTTAA
1351   TCAGTGAGGC    ACCTATCTCA    GCGATCTGTC    TATTTCGTTCATCCATAGTT
1401   GCCTGACTCC    CCGTCGTGTA    GATAACTACG    ATACGGGAGGGCTTACCATC
1451   TGGCCCCAGT    GCTGCAATGA    TACCGCGAGA    CCCACGCTCACCGGCTCCAG
1501   ATTTATCAGC    AATAAACCAG    CCAGCCGGAA    GGGCCGAGCGCAGAAGTGGT
1551   CCTGCAACTT    TATCCGCCTC    CATCCAGTCT    ATTAATTGTTGCCGGGAAGC
1601   TAGAGTAAGT    AGTTCGCCAG    TTAATAGTTT    GCGCAACGTTGTTGGCATTG
1651   CTACAGGCAT    CGTGGTGTCA    CGCTCGTCGT    TTGGTATGGCTTCATTCAGC
1701   TCCGGTTCCC    AACGATCAAG    GCGAGTTACA    TGATCCCCCATGTTGTGCAA
1751   AAAAGCGGTT    AGCTCCTTCG    GTCCTCCGAT    CGTTGTCAGAAGTAAGTTGG
1801   CCGCAGTGTT    ATCACTCATG    GTTATGGCAG    CACTGCATAATTCTCTTACT
1851   GTCATGCCAT    CCGTAAGATG    CTTTTCTGTG    ACTGGTGAGTACTCAACCAA
1901   GTCATTCTGA    GAATAGTGTA    TGCGGCGACC    GAGTTGCTCTTGCCCGGCGT
1951   CAATACGGGA    TAATACCGCG    CCACATAGCA    GAACTTTAAAAGTGCTCATC
2001   ATTGGAAAAC    GTTCTTCGGG    GCGAAAACTC    TCAAGGATCTTACCGCTGTT
2051   GAGATCCAGT    TCGATGTAAC    CCACTCGTGC    ACCCAACTGATCTTCAGCAT
2101   CTTTTACTTT    CACCAGCGTT    TCTGGGTGAG    CAAAAACAGGAAGGCAAAAT
2151   GCCGCAAAAA    AGGGAATAAG    GGCGACACGG    AAATGTTGAATACTCATACT
2201   CTTCCTTTTT    CAATATTATT    GAAGCATTTA    TCAGGGTTATTGTCTCATGA
2251   GCGGATACAT    ATTTGAATGT    ATTTAGAAAA    ATAAACAAATAGGGGTTCCG
2301   CGCACATTTC    CCCGAAAAGT    GCCACCTGTA    TGCGGTGTGAAATACCGCAC
2351   AGATGCGTAA    GGAGAAAATA    CCGCATCAGG    CGAAATTGTAAACGTTAATA
2401   TTTTGTTAAA    ATTCGCGTTA    AATATTTGTT    AAATCAGCTCATTTTTTAAC
2451   CAATAGGCCG    AAATCGGCAA    AATCCCTTAT    AAATCAAAAGAATAGACCGA
2501   GATAGGGTTG    AGTGTTGTTC    CAGTTTGGAA    CAAGAGTCCACTATTAAAGA
2551   ACGTGGACTC    CAACGTCAAA    GGGCGAAAAA    CCGTCTATCAGGGCGATGGC
2601   CCACTACGTG    AACCATCACC    CAAATCAAGT    TTTTTGCGGTCGAGGTGCCG
2651   TAAAGCTCTA    AATCGGAACC    CTAAAGGGAG    CCCCCGATTTAGAGCTTGAC
2701   GGGGAAAGCC    GGCGAACGTG    GCGAGAAAGG    AAGGGAAGAAAGCGAAAGGA
2751   GCGGGCGCTA    GGGCGCTGGC    AAGTGTAGCG    GTCACGCTGCGCGTAACCAC
2801   CACACCCGCC    GCGCTTAATG    CGCCGCTACA    GGGCGCGTCCATTCGCCATT
2851   CAGGCTGCGC    AACTGTTGGG    AAGGGCGATC    GGTGCGGGCCTCTTCGCTAT
2901   TACGCCAGCT    GGCGAAAGGG    GGATGTGCTG    CAAGGCGATTAAGTTGGGTA
2951   ACGCCAGGGT    TTTCCCAGTC    ACGACGTTGT    AAAACGACGGCCAGTGAATT
3001 GTAATACGAC TCACTATA
2试剂
大肠杆菌(E.coli strain：DH5α)；
质粒DNA回收、纯化试剂盒，由北京博大泰恒公司生产；
Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液，北京博大泰恒有限公司生产；
4×dNTP由dATP、dCTP、dTTP、dGTP四种单脱氧核糖核着酸组成，每种的商品浓度为10mM，购自深圳华赛因公司；
DNA分子量标准，购北京博大泰恒有限公司；
氨苄青霉素，
琼脂糖，
溴化乙啶，贮存液为10mg/ml，
溴酚兰，
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na₂)
氯仿，
70％冷乙醇，
无水乙醇，
蛋白胨(OXOID)，
酵母抽提物(OXOID)，
NaCl，
琼脂粉，
无离子水。
3设备
微量移液器(GILSON)，
PCR仪(MJ PTC-200)，
紫外透射仪，
冷冻高速离心机，
电泳仪，
恒温箱，
恒温摇床，
摇床
二、试剂配制
LB固体和液体培养基：配制1升LB液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母膏(yeast extract)5g、氯化钠10g、加几滴5M NaOH调节至pH 7.0，高压(121℃)灭菌20分钟。LB固体培养基(不含氨苄)：每升液体培养基中加入15克琼脂(Agar)高压(121℃)灭菌20分钟，适当冷却后，倒平板。
氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺平板。
1×TE缓冲液(pH8.0)：含10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA-Na₂(pH8.0)，以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4℃贮存。
凝胶上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液。
50×TAE电泳缓冲液的配制：242gTris-Cl，57.1ml醋酸，37.2g EDTA-Na₂，加水至1L，室温保存，用时加蒸馏水稀释至1×即可。
1％琼脂糖凝胶：在一个250ml的锥形瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，1.0g琼脂糖，混匀后在微波炉或电炉上加热溶解，待琼脂糖完全融化后冷却到60℃，加入一滴浓度为10mg/ml的溴化乙啶，摇匀，然后在插有梳子的凝胶槽中灌制凝胶，冷却后即可进行电泳。
三、引物设计与合成
本发明所用到的PCR引物均为本发明的发明人根据噬菌体Lambda DNA的核酸序列，利用引物设计软件DNAstar Primerselect进行设计。分别如下：
通用正向引物：5’-GGG ATG TTT ATG ACG AGC A-3’
800bp反向：5’-GAA TTC(EcoR I)TGC ATC TCT TCG ACC TGA GC-3’
1000bp反向：5’-GAA TTC(EcoR I)CAC GAT GAT ATT CAC CAC AC-3’；
600bp反向：5’-GGA ACG GAT A AC CTC ACC GG-3’；
400bpA-反向：5’-GAA TTC(EcoR I)CCG TAA AAA AAG CCG CAC AG-3’；
1400bp反向：5’-GAA TTC(EcoR I)CAG GGT CAG CCA GCA GCA TC-3’；
400bpB-反向：5’-GCA TGC(Sph I)GGC CTT TAG TGA TGA AGG GT-3’；
2000bp正向：5’-CTG CAG(Pst I)GGG ATG TTT ATG ACG AGC AA-3’；
2000bp反向：5’-CTC ACC GGA TGT AAT GGT GG-3’；
引物合成由北京三博远志生物技术有限公司合成，合成后的干粉样引物用TE缓冲液溶解成浓度为10uM的溶液。
本发明的有益效果在于：通过基因工程手段构建超级质粒，通过大肠杆菌发酵和限制性内切酶酶切的方法制备一种偶数200bp梯度DNA分子量标准，过程快速，产率高，可以放大到工业级生产规模。
附图说明
图1用限制性内切酶EcoR I酶切质粒pYE9600所产生的偶数200bp梯度DNA分子量标准的电泳图谱。
具体实施方式
实施例1
利用超级质粒pYE9600制备生产偶数200bp DNA分子量标准梯度的制备方法，具体包括如下步骤：
1.取-20℃冷冻保存的pYE9600质粒2-5微升通过热激转化的方法将其转入大肠杆菌DH5α或JM109中，涂布于含有氨苄青霉素的平板上，倒置于37℃恒温箱内过夜培养，第二天挑单菌落，用含有氨苄青霉素的LB液体培养基(5ml)培养至OD600＝0.8，转接于100ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇床剧烈震荡培养3-5小时，至OD600＝0.6时，继续以1：100的比例转接于已37℃预热的含有氨苄青霉素的LB液体培养基(1000ml)中培养12-16小时。
2.目标质粒pYE9600的大量制备及纯化，其过程包括以下步骤：
(1)于250ml离心瓶中4100-6000rpm常温或4℃收菌，离心时间为3-10分钟，获得菌体沉淀。用20ml的溶液I重悬菌体沉淀。并将之转入600ml的矿泉水瓶中。
(2)分别加入40ml新配制的溶液II，拧好盖子，轻轻颠倒数次，使内容物彻底混匀，室温下放置10-15分钟。
(3)分别加入30ml冰预冷的溶液III，拧好盖子，轻轻地但完全地颠倒、震荡混匀几次(此时不应再有分离的两个液相)。将矿泉水瓶在冰上放10-20分钟。
(4)将矿泉水瓶中的内容物转入离心瓶中，平衡后离心。
(5)6000rpm离心20分钟，将上清轻轻转入量筒中，弃去离心瓶中的沉淀。
(6)加30ml氯仿抽提。
(7)转入分液漏斗，静置5分钟，待分相后，分别收集下层的有机相(氯仿)和上层的水相。
(8)将水相10,000rpm离心10分钟。
(9)合并所有水相(加入10ul的RNase，室温静置10分钟)，量其体积，加入0.7倍体积的异丙醇，并充分混匀，室温下放置10-20分钟。
(10)室温下8000rpm离心15分钟，以回收核酸沉淀。
(11)小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清。
(12)室温下用5ml 70％的乙醇刷洗管底及管壁，小心的倒掉乙醇(注意防止沉淀物的倒出)，并将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉(15-20分钟)。
(13)5ml TE(pH 8.0)溶解湿润的核酸沉淀。
(14)溶解后得到的质粒溶液用等体积的酚-氯仿抽提3遍，以充分去除蛋白质。此时可以获得澄清的液体。
3.利用所获得的pYE9600质粒建立酶切反应体系，其中反应缓冲液的体积为反应总体积的1/10。加入适量的内切酶，充分混匀后于37℃水浴保温20-50个小时。之后将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液(TAE)，使凝胶浸于液面下约3mm，将部分酶解产物取出并进行梯度稀释，加入适量的凝胶上样缓冲液(loading buffer)并混合，用移液枪将之加入凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳，使核酸分子向阴极泳动，当溴酚兰泳动到凝胶的三分之二处时停止电泳，在紫外透射仪上观察酶切产物的纯度及产量。
4.所得的偶数200bp梯度DNA分子量标准的纯化：用酚∶氯仿为1∶1的混合溶剂抽提，去除其中的蛋白质(主要是内切酶)成份，一般经过2-3次的抽提即可达到满意的效果。通过向体系中加入适量的TE缓冲液，将3000bp的DNA条带定量为150ng，那么其他条带的量依次为(从大到小)100ng、70ng、50ng、40ng、30ng、20ng。