生产奇数200BP梯度DNA分子量标准的超级质粒及制备方法.pdf

利用Taq DNA聚合酶的加尾活性和对连接产物的选择性凝胶回收，构建了一种全新的DNA分子量标准生产用的质粒pYO7200，该发明属于分子生物学常用试剂的制备领域。该质粒含有一系列的奇数片段梯度(300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、3000bp)，通过一种限制性内切酶酶切，实现其中所含片段的释放，从而形成一种200bp的核酸分子量标准梯度(DNA marker)。该200bp标准梯度的制备过程包括，生产菌株的转化和发酵培养、目标质粒的大规模制备和纯化、目标质粒的酶切。本发明的特点是能利用成熟的生产工艺和基因工程质粒快速、精确、大量地制备用于DNA分子量标准的一个200bp的奇数梯度。

1.  生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒，该质粒是一种全新的超级DNA分子量标准质粒，其特征在于：其中含有300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、3000bp六条片段；300bp为双拷贝；经EcoR I酶切后可以获得一个由6条片段组成的200bp奇数DNA分子量标准梯度；同时各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(6∶5∶7∶9∶15∶30)。

2.  根据权利要求1所述的生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒的制备方法，包括通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、几条片段，其特征在于：
(1)对300bp-A、300bp-B、500bp、700bp分别通过聚合酶进行扩增；
(2)对1500bp、900bp分别通过聚合酶进行扩增；
(3)利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1500bp和900bp两条片段加T；
(4)利用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使500bp、700bp、900bp连接成一个500-900-700的单元，同样300bp-A、300bp-B和1500bp连接成300A-1500-300B的单元；
(5)通过T/A克隆试剂盒，把上述的500-900-700、300A-1500-300B两个单元分别克隆到T载体中形成中间载体T579和T3153；
(6)通过Pst I酶切将300A-1500-300B单元从T3153中切出来，并利用核酸纯化回收试剂盒进行回收和纯化；同时T579载体也被Pst I酶切完全酶切，并利用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连；
(7)把300-1500-300单元连接进脱磷处理的T579载体获得质粒pYO7200。

3.  根据权利要求2所述的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒制备方法，其特征在于：所述的300bp-A、300bp-B、500bp、700bp分别通过聚合酶进行扩增，具体是指用Taq DNA聚合酶进行扩增。

4.  根据权利要求2所述的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒制备方法，其特征在于：所述的1500bp、900bp分别通过聚合酶进行扩增，具体是指用pfu DNA聚合酶进行扩增。

生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒及制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学试剂制备和基因工程应用领域，具体说是一种通过基因工程手段构建的超级质粒及其制备方法，该超级质粒用于使用限制性内切酶酶切的方法制备奇数200bp梯度DNA分子量标准。
背景技术
在DNA合成及各种方式的基因操作过程中，需要对合成的或进行操作的DNA分子大小变化进行监测，常用的方法是通过将待测DNA分子与一种已知分子量的DNA混合标准物(分子量标准、DNA marker)同时进行电泳，通过比较待测DNA分子与DNA分子标准在电泳过程中的迁移距离来判断DNA样品分子的大小。因此，需要制备一些已知分子量的标准DNA混合物。
现有技术中制备标准DNA的方法已有多种方法：
化学合成法：通过化学反应的方法将4种不同的脱氧核糖核苦酸：腺嘌呤(dATP)，鸟嘌呤(dGTP)，胞嘧啶dCTP)，胸腺嘧啶(dTTP)结合在一起，合成目标大小的DNA片段。该方法操作十分繁琐，效率极低，合成的DNA长度受到严重的限制，一般可合成DNA的长度不超过400bp，大分子量的DNA片段无法直接用化学合成法来合成，成本太高，因而不适用DNA分子量的常规制备。
片段连接法：先用PCR或者合成的方法获得小分子量的DNA分子(如100bp)，再用酶促连接反应将小分子DNA一个一个顺序连接起来，形成不同大小的DNA分子(100bp、200bp、300bp、400bp、…)。该方法理论上讲可以制备各种大小的DNA分子，但操作却十分繁琐，可再现性差，无法实现大规模制备。
聚合酶链反应法：DNA聚合酶链反应已广泛用于基因克隆和DNA片般的制备。目前国内外已被广泛用来制备DNA分子量标准物。但是该方法费时费力，其生产能力有限。
酶切法：用一种或两种限制性内切酶组合对噬菌体DNA或人工设计的质粒进行切割，产生不同大小的DNA片段，以作为DNA分子量标准。该方法的优点是容易大量制备，产率高。但该方法的缺点也很突出：酶切产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，其制约因素是人工构建质粒的设计水平。
长期以来，分子生物学试剂与基因工程应用领域，需要一种高水平的人工构建的超级质粒设计思路，以克服酶切产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，以快速、精确、大量地生产奇数200bp梯度DNA分子量标准。
发明内容
经过长期的实验室研究，本发明恰恰满足了上述需求，其目的在于：提供一种通过基因工程手段构建的、全新的、能够快速、精确、大量地酶切法生产200bp奇数梯度DNA分子量标准的超级质粒。
本发明能够的进一步目的在于：提供一种生产200bp奇数梯度DNA分子量标准的超级质粒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增了300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、几条片段，其中1500bp和900bp通过pfu DNA聚合酶进行扩增，而300bp-A、300bp-B、500bp、700bp分别用Taq DNA聚合酶进行扩增。然后利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1500bp和900bp两条片段加T。再利用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使500bp、700bp、900bp连接成一个500-700-900的单元，同样300bp-A、300bp-B和1500bp连接成300A-1500-300B的单元。然后通过T/A克隆试剂盒，把上述两个单元分别克隆到T载体中形成中间载体T579和T3153。
通过Pst I酶切将300A-1500-300B单元从T3153中切出来，并利用核酸纯化回收试剂盒进行回收和纯化。同时T579载体也被Pst I酶切完全酶切，并利用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连。建立合适的连接体系，把300-1500-300单元连接进脱磷处理的T579载体所得中间载体命名为pYO7200。
所获得的pYO7200是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中含有300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、3000六条片段，其中300bp为双拷贝，以增强其观察时的荧光强度。质粒pYO7200经EcoR I酶切后可以获得一个由6条片段组成的200bp奇数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(6∶5∶7∶9∶15∶30)。
本发明的有益效果在于：利用成熟的生产工艺和基因工程构建了一种人工超级质粒，该质粒是一种全新的DNA分子量标准质粒，对该质粒进行切割制备200bp奇数梯度DNA分子量标准，克服了传统的酶切法产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，容易大量制备，产率高，实现了本发明的目的。
附图说明
图1是用于生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒pYO7200图谱。
具体实施方式
生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒制备方法，具体包括如下步骤：
1.通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、几条片段，其中1500bp和900bp通过pfu DNA聚合酶进行扩增，而300bp-A、300bp-B、500bp、700bp分别用Taq DNA聚合酶进行扩增。
2.利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1500bp和900bp两条片段加T。
3.利用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使500bp、700bp、900bp连接成一个500-900-700的单元，同样300bp-A、300bp-B和1500bp连接成300A-1500-300B的单元。
4.通过T/A克隆试剂盒，把上述的500-900-700、300A-1500-300B两个单元分别克隆到T载体中形成中间载体T579和T3153。
5.通过Pst I酶切将300A-1500-300B单元从T3153中切出来，并利用核酸纯化回收试剂盒进行回收和纯化。同时T579载体也被Pst I酶切完全酶切，并利用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连。
6.把300-1500-300单元连接进脱磷处理的T579载体获得质粒，命名为pYO7200。
所获得的pYO7200是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中含有300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、3000六条片段，其中300bp为双拷贝，以增强其观察时的荧光强度。质粒pYO7200经EcoR I酶切后可以获得一个由6条片段组成的200bp奇数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(6∶5∶7∶9∶15∶30)。