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1、10申请公布号CN101999003A43申请公布日20110330CN101999003ACN101999003A21申请号200980112841922申请日2009020661/028,06420080212USC12Q1/68200601G01N33/53200601C07H21/0020060171申请人诺瓦蒂斯公司地址瑞士巴塞尔72发明人拉姆巴特范文华74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人封新琴54发明名称分离无细胞凋亡或胎儿核酸的方法57摘要本发明提供一种分离无细胞核酸例如凋亡或胎儿核酸的方法，以及检测赘生性细胞或鉴定胎儿的遗传组成的方法。本发明也提供包含抗DNA抗。
2、体的磁性颗粒和包含该磁性颗粒的试剂盒。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010101286PCT申请的申请数据PCT/US2009/0333752009020687PCT申请的公布数据WO2009/102632EN2009082051INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图3页CN101999010A1/2页21一种分离胎儿核酸的方法，该方法包括从母体生物样品分离无细胞核酸，其中所述生物样品包含细胞成分和无细胞核酸，并且其中进行无细胞核酸的分离不用在分离之前处理该细胞成分。2权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为全血。3权利要求1所述的。
3、方法，其中所述生物样品为储存在水性介质中的宫颈粘液样品。4权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为储存在水性介质中的尿样。5权利要求1所述的方法，其中无细胞核酸是通过使所述生物样品与包含DNA结合剂的固体表面接触而分离的。6权利要求5所述的方法，其中所述固体表面为磁性颗粒、微通道、微孔、平板、滤器、膜或载玻片的表面。7权利要求5所述的方法，其中所述DNA结合剂为抗DNA抗体、DNA结合蛋白、核酸或DNA结合有机分子。8权利要求5所述的方法，其中所述DNA结合剂为选自下组的DNA结合有机分子吖啶、溴化乙锭和DAPI。9权利要求5所述的方法，其中所述DNA结合剂通过接头附接到所述固体表面。10权利。
4、要求9所述的方法，其中所述接头选自下组IGG、蛋白G、蛋白A、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、聚乙二醇、聚乙烯醇和NHSR马来酰亚胺。11权利要求9所述的方法，其中所述接头为亲水或疏水聚合物。12权利要求10所述的方法，其中R为CH2CH2ON，N1100；多核苷酸；多肽；聚苯乙烯；或聚乙烯亚胺。13权利要求1所述的方法，其中进行无细胞核酸的分离不用在分离前使用溶解细胞成分中的细胞的手段。14权利要求1所述的方法，其中进行无细胞核酸的分离不用在分离前除去细胞成分。15权利要求1所述的方法，其中所述分离的无细胞核酸至少包含百分之00001的胎儿核酸。16权利要求1所述的方法，其进一步包括从分离的。
5、无细胞核酸分离长度少于500个核苷酸的核酸的步骤。17权利要求1所述的方法，其进一步包括从分离的无细胞核酸分离长度少于300个核苷酸的核酸的步骤。18一种鉴定胎儿遗传组成的方法，该方法包括根据权利要求1的方法分离胎儿核酸，和基于所述分离的胎儿核酸鉴定胎儿的遗传组成。19权利要求18所述的方法，其中所述遗传组成指示胎儿的性别。20权利要求18所述的方法，其中所述分离胎儿核酸的步骤进一步包括从分离的无细胞核酸分离长度少于500个核苷酸的核酸。21权利要求20所述的方法，其中所述遗传组成指示胎儿的状况或病症。22权利要求20所述的方法，其中所述遗传组成指示选自下组的疾病或病症囊性纤维化、镰状细胞贫血。
6、、苯丙酮酸尿、泰萨病、肾上腺增生、范科尼贫血、脊髓性肌萎缩、迪谢权利要求书CN101999003ACN101999010A2/2页3纳肌营养不良、亨廷顿病、强直性肌营养不良、地中海贫血、脆性X染色体综合征、唐氏综合征、克莱恩费尔特综合征、爱德华兹综合征、帕陶综合征、三体X综合征、XYY综合征、8三体性、16三体性、特纳综合征、罗伯逊易位、安格尔曼综合征、迪乔治综合征、沃希综合征、RHD综合征、结节状硬化、共济失调毛细血管扩张症和普威综合征。23一种磁性颗粒，包含在其表面上的抗DNA抗体。24权利要求23所述的磁性颗粒，其中所述抗DNA抗体为单克隆抗体。25一种试剂盒，包含权利要求23所述的磁性。
7、颗粒。权利要求书CN101999003ACN101999010A1/6页4分离无细胞凋亡或胎儿核酸的方法背景技术0001在怀孕期间通常进行产前检查或筛查以确定胎儿的性别或检测胎儿的遗传病和/或染色体异常。到现在为止，已经认识到了由一种或多种缺陷基因引起的超过4000种遗传病。一些例子包括囊性纤维化CYSTICFIBROSIS、亨廷顿病HUNTINGTONSDISEASE、地中海贫血BETATHALASSAEMIA、强直性肌营养不良MYOTONICDYSTROPHY、镰状细胞贫血SICKLECELLANEMIA、卟啉症PORPHYRIA和脆性X染色体综合征FRAGILEXSYNDROME。染色体。
8、异常是由染色体数量的畸变、染色体材料的复制或缺失，以及由染色体结构的缺陷引起的。染色体异常的例子有三体性，例如16三体性TRISOMY16，妊娠前三个月引起流产的主要原因，21三体性TRISOMY21唐氏综合征DOWNSYNDROME、13三体性TRISOMY13帕陶综合征PATAUSYNDROME、18三体性TRISOMY18爱德华兹综合征EDWARDSSYNDROME；克莱恩费尔特综合征KLINEFELTERSSYNDROME47，XXY、47，XYY和47，XXX；染色体的缺失单体性MONOSOMY，例如特纳综合征TURNERSYNDROME45，X0；染色体的异位、缺失和/或微缺失MI。
9、CRODELETION，例如罗伯逊易位ROBERTSONIANTRANSLOCATION、安格尔曼综合征ANGELMANSYNDROME、迪乔治综合征DIGEORGESYNDROME和沃希综合征WOLFHIRSCHHORNSYNDROME。0002目前可用的产前遗传检查通常涉及侵入性操作。例如，对妊娠1012周左右的孕妇进行的绒毛膜绒毛取样CVS和在1416周左右进行的羊膜腔穿刺术都包括侵入性操作以获得样品供检查胎儿染色体异常用。通常使用细胞遗传学或荧光原位杂交FISH分析来检查通过这些取样操作获得的胎儿细胞的染色体异常。0003尽管这些操作对于检测染色体异常可能是有用的，其已经显示了与流产的。
10、风险有关。因此羊膜穿刺术或CVS仅提供给感觉存在增加的风险的妇女，包括那些高龄产妇THOSEOFADVANCEDMATERNALAGE35岁、那些母体血清筛查异常的妇女或那些以前有过胎儿染色体异常的妇女。这些检查的结果是使得年龄超过35岁的妇女生出染色体异常如唐氏综合征的婴儿的百分比显著降低。然而，缺乏用于大多数孕妇的适当的或相对安全的产前检查或筛查的导致了大约80生出唐氏综合征婴儿的妇女的年龄在35岁以下。0004如此需要用于一般群体的孕妇的非侵入性筛查试验，特别是针对鉴定胎儿染色体异常以及其它遗传变异、病症或疾病的检查。这需要分离可以用于产前遗传筛查的胎儿核酸的非侵入性技术发明内容0005。
11、本发明部分基于如下发现，即能够在不溶解或去除样品中细胞的情况下从生物样品分离无细胞核酸，例如，来自凋亡或坏死细胞的核酸或胎儿核酸。因此，本发明提供了分离无细胞核酸例如，凋亡的核酸或胎儿核酸的方法，和鉴定胎儿的遗传组成的方法。本发明还提供包含抗DNA抗体的磁性颗粒，和包含所述磁性颗粒的试剂盒。说明书CN101999003ACN101999010A2/6页50006在本发明的一个实施方式中提供一种分离胎儿核酸的方法。该方法包括从母体生物样品分离无细胞核酸，该母体生物样品含有细胞成分和无细胞核酸，在分离之前不用处理细胞成分。0007在本发明的另一实施方式中提供一种鉴定胎儿遗传组成的方法。该方法包括根。
12、据本发明的方法分离胎儿核酸，并基于分离的胎儿核酸来鉴定胎儿的遗传组成。0008在本发明的另一实施方式中提供一种磁性颗粒。该磁性颗粒包含在其表面上的抗DNA抗体。0009本发明的又一个实施方式中提供一种包含本发明的磁性颗粒的试剂盒。0010附图简述0011图1显示将抗DNA抗体与链霉抗生物素蛋白涂覆的磁性颗粒附接的过程中的示例性步骤。0012图2显示通过蛋白G将抗DNA抗体与链霉抗生物素蛋白DYNABEADM280附接的过程中的示例性步骤。0013图3显示将抗DNA抗体与胺化DYNABEAD附接的过程中的示例性步骤。0014发明详述0015本发明部分基于如下发现，即在不溶解或去除样品中细胞的情况。
13、下可以从生物样品分离无细胞核酸，例如凋亡的或胎儿的核酸。根据本发明的一方面，其提供一种分离凋亡或胎儿核酸的方法。该方法包括从生物样品，例如受试者或母体的生物样品，分离无细胞核酸。此处所用的术语“无细胞核酸”指的是循环的、或自由漂浮的FREEFLOATING核酸，并且可与循环的、或自由漂浮的核酸互换使用。在一个实施方式中，无细胞核酸包括存在于任何完整或部分完整的细胞外的核酸。在另一实施方式中，无细胞核酸包括存在于任何完整或部分完整的细胞外，但在细胞或细胞样成分内的核酸，例如在膜结构、线粒体样结构、脂质膜囊泡内等。0016一般而言，术语“母体MATERNALHOST”指的是怀有即孕有胎儿的女性受试。
14、者。任何合适的母体生物样品，例如一种包含胎儿核酸的母体生物样品，均可以用于本发明的方法中。示例性的生物样品包括，但不限于，全血、血浆、血清、尿、宫颈粘液、羊水或绒毛膜绒毛样品。在一个实施方式中，母体生物样品是全血。在另一实施方式中，所述生物样品是储存在水性介质中的宫颈粘液样品或尿样。在又一个实施方式中，所述生物样品是含有从一种或多种宫颈粘液样品或尿样中沥滤的核酸的介质例如，水性介质的样品。水性介质可以是任何介质，例如含水缓冲液，其适用于保存宫颈粘液样品或尿品。0017一般而言，所述生物样品例如母体生物样品包含细胞成分以及无细胞核酸，并且所述无细胞核酸的分离不用在分离前对所述细胞成分进行处理。例。
15、如，所述细胞成分可以包含细胞或例如，如在血浆或血清的情况下细胞的或基质的成分或蛋白。0018此处所用的术语“分离”指的是分开、捕获、隔离SEQUESTER等，并可与它们互换使用。可以通过目前已知或者以后发现的任何用于从生物样品分离核酸的手段MEANS来分离所述无细胞核酸。在一个实施方式中，所述无细胞核酸是通过使生物样品与包含核酸的配体的固体表面接触而分离的。所述配体可以直接或间接例如通过接头涂覆或固定在固体表面上。用于将配体附接到固体表面的方法是本领域技术人员熟知的并且可以使用现在已知的或以后开发的任何方法。在一个实施方式中，所述固体表面为磁性颗粒，包含在说明书CN101999003ACN10。
16、1999010A3/6页6柱例如树脂柱中的颗粒，微通道、微孔、平板、滤器、膜或载玻片的表面。0019在另一实施方式中，可以将所述配体涂覆在装置例如，微流装置的表面。示例性的微流装置包括进口装置INLETMEANS、出口装置OUTLETMEANS和在进口和出口装置之间延伸的微通道配置。该微通道配置可以是任何能为生物样品提供随机化流动通路的微通道。例如，所述微通道配置可以包括多个横向分离柱SEPARATORPOST，其与微通道和自微通道的突起相整合。这种柱通常以能够提供随机化流出通路的模式排列。微流装置的实例在美国申请号11/458,668和11/331,988中描述，将这两篇申请在此全部并入。微。
17、流装置的微通道配置的表面可以用配体部分或完全地涂覆。0020示例性的配体包括，但不限于4，6二脒基2苯基吲哚DAPI、吖啶、偏端霉素、溴化乙锭、8甲氧沙林8METHOXYPSORALEN、二氨基二四氢呋喃DIAMINOBISTETRAHYDROFURAN、反义寡核苷酸、2脱氧核糖或核糖核苷酸、天然的或修饰的寡核苷酸、PNA、LNA、2甲氧基、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或其组合。在一个实施方式中，分离的核酸是DNA，并且所述配体是DNA结合剂，包括，但不限于，抗DNA抗体，例如，多克隆抗DNA抗体或单克隆抗DNA抗体；DNA结合蛋白；DNA结合核酸和DNA结合有机分子。0021可以将核酸的配体或者直。
18、接地或者通过接头附接到固体表面。任何合适的接头，例如，亲水的或疏水的聚合物都可以使用。接头的实例包括，但不限于，IGG、蛋白G、蛋白A、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和NHSR马来酰亚胺，其中R是CH2CH2ON，N1100；多核苷酸、多肽、聚苯乙烯、聚乙烯亚胺等。在一个实施例中，接头包含约2至约50、75、100、125、150、200或250个原子，例如，C、N、S、P和/或O原子。在另一实施方式中，接头包括不同长度的亲水聚合物，例如，聚乙二醇、聚乙烯醇等。0022根据本发明的方法，无细胞核酸的分离不用在分离之前处理细胞成分。在一个实施方式中，无细胞核酸的分离不用在分离之前溶解或使用手段来。
19、溶解细胞成分中的细胞。这样的手段包括已知用于对细胞进行手动溶解或以其他方式杀死、破坏等从而将核酸从细胞内释放到生物样品中的任何手段。溶解手段的实例包括，但不限于，用溶解剂、洗涤剂或表面活性剂处理生物样品；加热含细胞的生物样品；改变含细胞的生物样品的PH值，例如，以使得PH在PH4、5或6以下，或在PH8、9或10以上。0023在另一实施方式中，无细胞核酸的分离不用在分离前去除例如，通过过滤、离心等细胞成分即细胞或细胞因子或蛋白。0024通常本发明的方法可以用于分离无细胞核酸，其含有至少百分之0000011X105的凋亡或胎儿核酸。在另一实施方式中，无细胞核酸含有至少百分之000055X105的。
20、凋亡或胎儿核酸。在又一实施方式中，无细胞核酸含有至少百分之000011X104的凋亡或胎儿核酸。在又一实施方式中，无细胞核酸含有大约001、01、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或90的凋亡或胎儿核酸。0025本发明的方法可以进一步包括从分离的无细胞核酸分离用长度小于约250、300、350、400、450、500、550或600个核苷酸的核酸的步骤。0026根据本发明的另一方面，其提供一种鉴定胎儿的遗传组成的方法。所述方法包括根据本发明的方法分离胎儿核酸，并基于所述分离的胎儿核酸鉴定胎儿的遗传组成。0027胎儿的遗传组成可以指示胎儿的性别，或胎儿中的状况或病症。在一个实。
21、施方式说明书CN101999003ACN101999010A4/6页7中，通过本发明的方法分离的无细胞核酸可以直接用于确定胎儿的性别。在另一实施方式中，胎儿核酸是从无细胞核酸中分离的并且胎儿的遗传组成是基于所述分离的胎儿核酸鉴定的。胎儿核酸可以通过任何已知的手段从无细胞核酸分离。0028在一个示例性的实施方式中，胎儿核酸是通过按大小分级从无细胞核酸分离的。从无细胞核酸分离长度小于例如大约600、550、500、450、400、350、300或250个核苷酸的核酸。用于大小分级的任何已知手段，例如，凝胶电泳例如，PAGE、HPLC、TLC或基于柱的大小分级可以用于分离胎儿核酸。0029在一个实施。
22、方式中，胎儿的遗传组成是基于分离的胎儿核酸鉴定的。所述遗传组成可以指示胎儿中的状况或疾病。状况或疾病的实例包括，但不限于，囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、软骨发育不全ACHONDROPLASIA、先兆子痫PREECLAMPSIA、苯丙酮酸尿PHENYLKETONURIA、泰萨病TAYSCAHSDISEASE、肾上腺增生ADRENALHYPERPLASIA、范科尼贫血FANCONIANEMIA、脊髓性肌萎缩SPINALMUSCULARATROPHY、迪谢纳肌营养不良DUCHENNESMUSCULARDYSTROPHY、亨廷顿病、地中海贫血、强直性肌营养不良MYOTONICDYSTROPHY。
23、、脆性X染色体综合征、唐氏综合征、爱德华兹综合征、帕陶综合征、克莱恩费尔特综合征、三体X综合征、XYY综合征、8三体性、16三体性、特纳综合征、罗伯逊易位、安格尔曼综合征、迪乔治综合征、沃希综合征、RHD综合征、结节状硬化TUBEROUSSCLEROSIS、共济失调毛细血管扩张症ATAXIATELANGIELTASIA和普威综合征。0030根据本发明的又一方面，其提供检测赘生性NEOPLASTIC细胞、赘生性核酸或赘生性细胞的遗传标记例如受试者中的肿瘤细胞的方法。该方法包括根据本发明的方法分离无细胞核酸，和基于所述分离的无细胞核酸检测赘生性核酸例如赘生性细胞如肿瘤细胞的遗传标记的存在与否。00。
24、31根据本发明的又一方面，其提供了一种磁性颗粒。该磁性颗粒包含在其表面上的抗DNA抗体。该抗DNA抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方式中，所述磁性颗粒包含顺磁性核。在另一实施方式中，所述磁性颗粒包含由材料围绕的核例如，顺磁性核，该材料包括，但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、二氧化硅SILICA、尼龙、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、琼脂糖AGAROSE、陶瓷交联葡聚糖CERAMICSEPHADEX和琼脂糖SEPHAROSE。所述抗DNA抗体可以直接或间接即，通过接头与磁性颗粒附接。0032根据本发明的又一方面，其提供一种包含本发明的磁性颗粒的试剂盒。实施例0033以下实施例意欲说明，而不是以。
25、任何方式、形态或形式，或者明示或者暗示地限制本发明。尽管它们代表了可能采用的那些，但是作为选择可以使用本领域技术人员已知的其它步骤、方法学或技术。0034实施例1DNA结合珠的制备0035图1、2和3分别概述了制备通过IGG、蛋白G和NHSPEG马来酰亚胺结合抗DNA抗体的磁珠中涉及的步骤。0036实施例2从母体血液分离胎儿DNA的步骤0037用抗DNA抗体涂覆的珠6图1、12图2、或18图3处理2ML母体血液。使用说明书CN101999003ACN101999010A5/6页8携带至少100G抗DNA抗体的足够的珠。在室温下轻轻旋转样品15分钟以确保珠与血液充分混合。然后将样品置于磁选器中1。
26、2分钟，然后移出上清。然后将珠用2MNACL、10MMTRISHCL、1MMEDTAPH70洗涤3遍。然后用蛋白酶K在包含100MMNACL、10MMTRISHCL、25MMEDTA、1SDS的200L缓冲液PH80中在55下将珠消化1小时。在95下将蛋白酶K灭活10分钟后，通过加入2体积的无水乙醇并在80下冷却样品20分钟来乙醇沉淀上清。用90乙醇冲洗DNA团块一次。0038实施例3性别的确定0039在PCR中使用引物和探针将来自实施例2的DNA用作模板来确定胎儿性别。在用90乙醇冲洗后，干燥所述DNA团块，溶解入80L水中并通过PCR分析胎儿性别。使用用于Y染色体序列标记的一种或多种TAQ。
27、MAN探针，双重标记的探针，在5端具有报告荧光团且在3端具有猝灭荧光团的1822碱基寡核苷酸探针，和一种或多种引物来检测Y染色体序列。0040使用SRY性别决定区Y引物靶向存在于人和其他灵长类动物的Y染色体上的性别决定基因。所述SRY基因编码睾丸决定因子，其也称作SRY蛋白。使用FCY引物靶向Y染色体中另一常用标记。血红蛋白基因，一种存在于总DNA中的管家基因，在每个PCR反应中用于内部控制。如下所示，所有5个测试的样品已经通过一致的数据得到确认。0041将以下对照用于所述PCR反应0042女性DNA阴性对照5L中200NG0043对照男性基因组DNA阳性对照00445L中0PG对照DNA；0。
28、0455L中7PG对照DNA；00465L中40PG对照DNA；0047L中100PG0048L中200PG。0049使用用于111样品的96孔板设计用于PCR反应。所有对照作为阳性对照的男性DNA，作为阴性对照的女性DNA，和珠蛋白和样品的反应对于每个标记均以一式两份进行。00500051说明书CN101999003ACN101999010A6/6页90052PCR运行条件00530054得自来自孕妇怀孕712周2ML母体血液的全血的性别测试结果显示在表1中。0055表100560057尽管本发明是参考目前优选的实施方式来描述的，但应该理解的是对于本领域的技术人员显而易见的是在不偏离本发明的精神的情况下可以做出多种变化和修改。因此，本发明仅受限于以上权利要求。说明书CN101999003ACN101999010A1/3页10图1说明书附图CN101999003ACN101999010A2/3页11图2说明书附图CN101999003ACN101999010A3/3页12图3说明书附图CN101999003A。