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1、10申请公布号CN102002534A43申请公布日20110406CN102002534ACN102002534A21申请号201010561131922申请日20101126C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/11200601G01N21/6420060171申请人烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址264000山东省烟台市芝罘区新海阳街59号烟台出入境检验检疫局申请人中国检验检疫科学研究院72发明人粟智平耿金培杨益娥李晓玉朱水芳王真陈洪俊74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华54发明名称一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂。
2、及其应用57摘要本发明的目的是提供一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂及其应用。本发明提供的试剂包括序列表的序列1、序列2、序列4和序列5所示DNA组成的特异引物。所述试剂还可包括序列3所示探针甲和序列6所示探针乙。香石竹环斑病毒是我国重要的检疫性有害生物，本发明提供了两套PCR引物探针组合物，建立了双引物探针RTREALTIMEPCR检测香石竹环斑病毒的方法。该方法采用实时荧光PCR技术，有效地提高了检测的灵敏度；两套扩增效率一致的引物探针组合物相互验证确认，有效提高了结果的准确性，在实际检测中具有较强的可操作性。本方法准确、灵敏、简便、快速，检出低限均可达046FG/L植物总RNA。51INT。
3、CL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表4页附图3页CN102002545A1/1页21一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。2如权利要求1所述的试剂，其特征在于所述试剂由所述特异引物、特异探针甲和特异探针乙组成；所述特异探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。3如权利要求2所述的试剂，其特征在于所述特异探针甲为TAQMAN探针；所述特异探针乙为TAQMAN探针。4权利要求1。
4、至3中任一所述的试剂在制备辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂盒中的应用。5一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂盒，包括权利要求1至3中任一所述的试剂。6权利要求1至3中任一所述的试剂在辅助鉴定香石竹环斑病毒中的应用。7一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为74BP且PCR产物乙为70BP，待测病毒为候选的香石竹环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示。
5、DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对。8一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的香石竹环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述特异探针甲为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探。
6、针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。9如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待测病毒为李痘病毒、马铃薯A病毒、马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒或香石竹环斑病毒。10一种检测待测样本中是否含有香石竹环斑病毒的方法，包括如下步骤1提取待测样本的总RNA，反转录为CDNA；2以所述CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述CDNA为模板，用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有香石竹环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为。
7、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述特异探针甲为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。权利要求书CN102002534ACN102002545A1/6页3一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂及其应用技术领域0001本发明涉及一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂及其应用。背景技术0002香石竹环斑病毒CARNATIONRINGSPOTVIRUS，CRSV，属于番茄丛矮病毒科中香石竹环斑病毒属，是一种重要的检疫性植物病毒中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录2007。该病毒主要在芬兰、德国、立陶。
8、宛、波兰、英国、前苏联、意大利、匈牙利、法国、荷兰、哥伦比亚、墨西哥、美国、澳大利亚等国发生，我国未报道。0003香石竹环斑病毒的自然寄主主要是香石竹，还有苹果、李属、西洋梨、繁缕、早熟禾等，它们在我国有大面积的种植。CRSV感染后导致香石竹花萼分裂，每株花数量减少，降低产量25，开花后香石竹病株鲜重较低，造成花畸形，降低生产力。美国CRSV发病率15，波兰香石竹发病率最高者可达85，香石竹环斑病毒的检验检疫具有较大的经济重要性。0004CRSV可随无性繁殖材料进行远距离传播，线虫能够传毒，汁液、机械也可传毒。因此，如果进口带毒的无性繁殖材料，或者随带的土壤中有带病毒的线虫，都可能将该病毒传入。
9、我国。我国经常从香石竹环斑病毒疫区国家引进大量繁殖材料，CRSV可能随之传入我国。该病毒又有传毒介体线虫，一旦传入，难以铲除，后患无穷。为了维护我国花卉和水果等产业的健康发展、防止香石竹环斑病毒随进境物传入中国并尽量减少国际贸易摩擦，开发出准确、灵敏检测香石竹环斑病毒的先进技术，意义重大。0005目前，关于检测香石竹环斑病毒的方法文献报道极少，主要有鉴别寄主接种法、酶联免疫吸附测定ELISA等CLACKMF，ADAMSANJOURNALOFGENERALVIROLOGY1977，34475483；陶庭典，易建平等，DASELISA检测香石竹环斑病毒J植物检疫，2001，154216217。EL。
10、ISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低、易出现假阳性。未见有采用实时荧光PCR检测CRSV的研究报道。发明内容0006本发明的目的是提供一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂及其应用。0007本发明提供的辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。0008所述试剂可由所述特异引物、特异探针甲和特异探针乙组成；所述特异探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。0009所述特异探针甲可为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所。
11、示。所述特异探针乙可为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。0010所述试剂可用于制备辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂盒。0011本发明还保护一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的试剂盒，它包括所述试剂。0012所述试剂可用于辅助鉴定香石竹环斑病毒。说明书CN102002534ACN102002545A2/6页40013本发明还保护一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为74BP且PCR产物乙为70BP，待测病毒为候选的香石竹环斑。
12、病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对。0014本发明还保护另一种辅助鉴定香石竹环斑病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的CDNA为模板，用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的香石竹环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所。
13、示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述特异探针甲为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测病毒为候选的香石竹环斑病毒。0015所述待测病毒具体可为李痘病毒、马铃薯A病毒、马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒或香石竹环斑病毒。0016本发明还保护一种检测待测样本中是否含有香石竹环斑病毒的方法，包括如下步骤00171提取待测样本的总RNA，反转录为CDNA；00182以所述CDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针甲进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以所述CDNA为模板，。
14、用特异引物对乙和特异探针乙进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有香石竹环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对；所述特异探针甲为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特异探针乙为TAQMAN探针，核苷酸序列如序列表的序列6所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙均为阳性，待测样本含有香石竹环斑病毒。0019所述TAQMAN探针5末端具体可连接有荧光报告染料FAM，3末端具体可连接有荧光淬灭染料TAMRA。
15、。0020不同的方法，灵敏度和准确性差异较大，如ELISA与PCR凝胶电泳方法灵敏度相差100倍以上，PCR凝胶电泳与实时荧光PCR技术灵敏度相差也在100倍以上。即使同样采用实时荧光PCR技术，由于引物的扩增效率不一样，灵敏度差异也可达到1000倍以上。在实际检测鉴定工作中，为了提高结果的准确性，经常需要对一个结果进行两个以上的确认试验，不同方法检测灵敏度不一样，很难保证两个试验的结果完全一样，这就为结果的判断增加了难度，特别是在检测目标含量极少的情况下，这种难度就会进一步加大。若两套方法检测灵敏度一样或非常接近，这个难题就迎刃而解。0021实时荧光PCRREALTIMEPCR检测技术是国际。
16、最近十余年发展起来的高新检测技术，该技术将PCR扩增与荧光检测系统有机结合起来。与目前已报道的其它检测技术说明书CN102002534ACN102002545A3/6页5相比，该技术具有巨大的优越性，主要体现在A能实时观察PCR过程中待检测样品模板DNA或CDNA扩增情况，无需进行电泳、染色和紫外检测，大大简化了操作程序并缩短检测时间；B采用荧光信号放大功能，大大提高了灵敏度；C特异性引物与特异荧光探针双保险结构有效提高了检测的准确性；D全封闭的操作系统，减少了PCR产物对实验室环境的染污和样品间的交叉染污，有效降低和避免了假阳性结果。实时荧光PCR技术，是目前最准确、最灵敏的技术，其优越性使。
17、之在植物检疫中具有广阔的应用范围和前景。0022香石竹环斑病毒CARNATIONRINGSPOTVIRUS，CRSV是我国重要的检疫性有害生物。本研究根据CRSV中移动蛋白基因MOVEMENTPROTEINGENE的保守序列，设计了两套引物探针组合物每套引物探针组合物由上游引物、下游引物和探针组成，建立了双引物探针RTREALTIMEPCR检测CRSV的方法。0023与现有技术比较，本发明的优点如下1上述实时荧光PCR技术的优点在本发明得以全部体现，如准确、灵敏、简便、快速和能有效减少污染等；2两套引物探针相互验证，进一步有效提高了结果的准确性；3两套引物探针的扩增效率一致，因此对于同一个样品。
18、的两次验证实验，结果的能保证基本一致，从而降低了结果判断的难度，在实际检测工作、科研和解决重大的国际贸易争端中具有极强的可操作性；4两套引物探针的扩增效率极高，检出低限均可达046FG/L植物总RNA。附图说明0024图1为特异性测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴为RN，横轴为循环数；A为CRSV，B为PPV，C为PVA，D为PVV，E为PVY，F为CK1，G为CK2。0025图2为特异性测定中试剂乙的实时荧光PCR结果；纵轴为RN，横轴为循环数；A为CRSV，B为PPV，C为PVA，D为PVV，E为PVY，F为CK1，G为CK2。0026图3为灵敏度测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴。
19、为RN，横轴为循环数；A、B、C、D、E、F、G、H、I、J所对应的RNA浓度依次为46NG/L、460PG/L、46PG/L、46PG/L、460FG/L、46FG/L、46FG/L、046FG/L、0046FG/L、00046FG/L，K对应DEPC水。0027图4为灵敏度测定中试剂乙的实时荧光PCR结果；纵轴为RN，横轴为循环数；A、B、C、D、E、F、G、H、I、J所对应的RNA浓度依次为46NG/L、460PG/L、46PG/L、46PG/L、460FG/L、46FG/L、46FG/L、046FG/L、0046FG/L、00046FG/L，K对应DEPC水。0028图5为试剂甲和试剂。
20、乙的扩增效率对比图；纵轴为RN，横轴为循环数；A为试剂甲，B为试剂乙。具体实施方式0029以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实时荧光PCR基因扩增仪为ABIPARISM7000美国ABI公司；核酸蛋白分析仪为BIOPHOTOMETER德国EPPENDORF公司；植物总RNA提取试剂盒商品名EZNATM，美国OMEGA公司产品，货号R286701购自北京双羸生物公司；反转录说明书CN102002534ACN102002545A4/6页6试剂盒购自大连宝。
21、生物公司TAKARA货号DRR037A、实时荧光PCR试剂盒定量PCRSUPERMIXUDG，货号C11730025购自美国INVITROGEN公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实时荧光PCR的结果的判定标准为CT值40，为阳性；CT值40，为阴性。0030香石竹环斑病毒CARNATIONRINGSPOTVIRUS，CRSVATCC编号PV21；0031马铃薯V病毒POTATOVVIRUS，PVVATCC编号PV754；0032李痘病毒PLUMPOXVIRUS，PPVATCC编号PVAS709；0033马铃薯A病毒POTATOVIRUSA，PVAATCC编号PVA。
22、S266；0034马铃薯Y病毒POTATOVIRUSY，PVYATCC编号PV50；0035ATCC即美国标准菌种收藏所AMERICANTYPECULTURECOLLECTION，HTTP/WWWATCCORG/。0036实施例1、试剂的制备0037一、引物和探针的设计0038根据美国NCBI核酸数据库中香石竹环斑病毒基因组NC_003531中CRSV移动蛋白MOVEMENTPROTEIN基因序列保守区，分别设计两条上游引物CRSV1F和CRSV2F、两条下游引物CRSV1R和CRSV2R和两条TAQMAN探针CRSV1P和CRSV2P。0039二、试剂的组成00401、试剂甲的组成0041试。
23、剂甲由CRSV1F、CRSV1R和CRSV1P组成引物和探针由上海生工合成。0042CRSV1F上游引物5GGTGACAGTGTTGCACTGAACTTT3序列表的序列1；0043CRSV1R下游引物5CCAGGAGTGCCGACAGAAAC3序列表的序列2；0044CRSV1P探针5FAMTGGCACCCAACGAAAGAACTAAGTCCG3TAMARA；核苷酸序列为序列表的序列3，5端标记报告荧光染料FAM，3端标记淬灭荧光染料TAMRA。0045CRSV1F和CRSV1R的靶序列大小为74BP见序列表的序列7。00462、试剂乙的组成0047试剂乙由CRSV2F、CRSV2R和CRSV。
24、2P组成引物和探针由上海生工合成。0048CRSV2F上游引物5TTGCCGATGTGCCCAAGTAT3序列表的序列4；0049CRSV2R下游引物5GGCGTAGCCTCCTGATGATTT3序列表的序列5；0050CRSV2P探针5FAMCGGTATCGCCCCGCCTTCG3TAMARA；核苷酸序列为序列表的序列6，5端标记报告荧光染料FAM，3端标记淬灭荧光染料TAMRA。0051CRSV2F和CRSV2R的靶序列大小为70BP见序列表的序列8。0052实施例2、试剂的应用0053分别取感染五种病毒CRSV、PVA、PVV、PVY和PPV的香石竹叶片，取健康香石竹叶片作为对照，应用实。
25、施例1制备的试剂甲和试剂乙分别进行特异性测定、灵敏度测定，并进行试剂甲和试剂乙的扩增效率对比。0054一、试剂的特异性测定00551、总RNA提取及质量控制0056用植物总RNA提取试剂盒从感染每种病毒的叶片5种和健康叶片CK1中分别提取总RNA。用核酸蛋白分析仪BIOPHOTOMETER测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以说明书CN102002534ACN102002545A5/6页7此控制核酸质量。00572、反转录合成CDNA0058用反转录试剂盒分别将步骤1从6种叶片中提取的总RNA进行反转录，得到CDNA；DEPC水作为总RNA的对照CK2。0059反应体系25L5LPRIMERS。
26、CRIPTTMBUFFER5，125LPRIMERSCRIPTTMENZYMEMIXI，125LOLIGODTPRIMER50M，125LRANDOM6MERS100M，2L总RNA，加DEPC水至25L。0060反应条件37、15MIN，85、5S。00613、试剂的特异性0062用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂试剂甲或试剂乙将步骤2中的CDNA进行实时荧光PCR。0063试剂甲的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，CRSV1F15M1L，CRSV1R15M1L，CRSV1P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0064。
27、试剂乙的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，CRSV2F15M1L，CRSV2R15M1L，CRSV2P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0065试剂甲和试剂乙的反应体系均在ABIPARISM7000的96孔板中进行；循环条件为50、2MIN；95、2MIN；95、15S，60、30S，45个循环。0066采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图1。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图2。应用试剂甲只有在CRSV中出现扩增曲线CT值14，判为阳性；应用试剂乙只有在CRSV中出现扩增曲线CT值15。PPV、PVA、PVV、PVY、CK1和。
28、CK2均未出现扩增信号，判为阴性。结果表明，试剂甲或试剂乙的特异性很好，结果与预计相符。0067二、试剂的灵敏度测定00681、总RNA提取和各个稀释液的制备0069用植物总RNA提取试剂盒从感染CRSV的叶片中提取总RNA，用核酸蛋白分析仪BIOPHOTOMETER测定其OD值，得出其浓度和纯度值。浓度值为46NG/L，纯度值为0D260/280220，OD260/230238。0070用DEPC水将提取的总RNA进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。各个稀释液中，RNA浓度分别为46NG/L、460PG/L、46PG/L、46PG/L、460FG/L、46FG/L、46FG/L、046FG/。
29、L、0046FG/L、00046FG/L。00712、反转录合成CDNA0072用反转录试剂盒分别将各个稀释液进行反转录，得到CDNA；DEPC水作为总RNA的对照。0073反应体系25L5LPRIMERSCRIPTTMBUFFER5，125LPRIMERSCRIPTTMENZYMEMIXI，125LOLIGODTPRIMER50M，125LRANDOM6MERS100M，2L稀释液，加DEPC水至25L。0074反应条件37、15MIN，85、5S。00753、试剂的灵敏度说明书CN102002534ACN102002545A6/6页80076用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂试剂甲。
30、或试剂乙将步骤2中的CDNA进行实时荧光PCR。0077试剂甲的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，CRSV1F15M1L，CRSV1R15M1L，CRSV1P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0078试剂乙的反应体系25LPCRBUFFER2125L，ROX05L，CRSV2F15M1L，CRSV2R15M1L，CRSV2P10M1L，CDNA20L，补充DEPC水至25L。每个CDNA设置2个重复。0079试剂甲和试剂乙的反应体系均在ABIPARISM7000的96孔板中进行；循环条件为50、2MIN；95、2MIN；95、。
31、15S，60、30S，45个循环。0080采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图3。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图4。应用试剂甲可以判为阳性的最低稀释度为046FG/L植物总RNACT值35；应用试剂乙可以判为阳性的最低稀释度为046FG/L植物总RNACT值36。结果表明，应用试剂甲或试剂乙检测的灵敏度可达108，即046FG/L植物总RNA。0081三、试剂甲和试剂乙的扩增效率对比00821、总RNA提取0083用植物总RNA提取试剂盒从感染CRSV的叶片中提取总RNA。用核酸蛋白分析仪BIOPHOTOMETER测定其OD值，得出其浓度和纯度值。00842、反转录合成CDNA0085用反转。
32、录试剂盒将总RNA进行反转录，得到CDNA；DEPC水作为总RNA的对照。0086反应体系同步骤一的2。00873、试剂的灵敏度0088用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂试剂甲或试剂乙将步骤2中的CDNA进行实时荧光PCR。0089方法同步骤一的3。0090实时荧光PCR结果见图5。采用试剂甲的CT值13；采用试剂乙的CT值13。结果表明，试剂甲和试剂乙的扩增效率几乎完全一样。说明书CN102002534ACN102002545A1/4页90001序列表CN102002534ACN102002545A2/4页1000020003序列表CN102002534ACN102002545A3/4页110004序列表CN102002534ACN102002545A4/4页12序列表CN102002534ACN102002545A1/3页13图1图2说明书附图CN102002534ACN102002545A2/3页14图3图4说明书附图CN102002534ACN102002545A3/3页15图5说明书附图CN102002534A。