木葡糖酸醋杆菌属菌株及其选育和生产细菌纤维素的方法.pdf

本发明提供的是一种木葡糖酸醋杆菌属菌株及其选育和生产细菌纤维素的方法，该菌株于2004年7月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCCNO.1186，命名为木葡糖酸醋杆菌323，分类命名为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)。其选育方法是筛选在常温下产纤维素膜厚、活力强的木葡糖酸醋杆菌，然后进行降温培养后经筛选，再进行降温培养，可筛选出能在10℃-20℃生产细菌纤维素的木葡糖酸醋杆菌属菌株。其生产细菌纤维素的方法包括菌株扩培、培养基制备、培养基装盘、接种发酵。本发明所提供的菌株能突破温度的限制，降低生产成本，有效防止生产中杂菌的污染，从而提高了得率。

1、  一种木葡糖酸醋杆菌属菌株，其特征是：它于2004年7月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.1186，命名为木葡糖酸醋杆菌323，分类命名为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)。

2、  一种权利要求1所述的木葡糖酸醋杆菌属菌株的选育方法，其特征是：其步骤如下：筛选在常温下产纤维素膜厚、活力强的木葡糖酸醋杆菌，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，选择培养箱温度28℃-31℃作为起始温度，培养2-5天后作为第一代菌种，降低培养箱温度3℃-5℃，筛选第一代菌种中产纤维素膜较厚的菌液作为种子液，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，培养2-5天后作为第二代菌种，以此类推，每转接一代培养温度降低3℃-5℃，同时每次筛选上一代菌种中产纤维素膜厚的菌液作为下一代培养的种子液，经过3-5代筛选后，可筛选出能在10℃-20℃生产细菌纤维素的耐低温的木葡糖酸醋杆菌属菌株。

3、  一种利用权利要求1所述的木葡糖酸醋杆菌属菌株生产细菌纤维素的方法，其特征是：其步骤如下：
①菌株扩培：将筛选出的菌株在液体培养基中培养，根据生产需要，按每代扩大10-25倍的产量，培养温度10℃-15℃，每代培养2-5天，通过2-3代的转代扩培，获得所需的种子液。
②培养基制备：将培养基调节pH值至3.0-6.5，培养基煮沸5min-30min。
③培养基装盘：将培养基趁热装入发酵浅盘中，冷却至室温。
④接种发酵：装有培养基的发酵浅盘移入低温发酵室，低温发酵室温度控制在10℃-20℃，待培养基温度降至与低温发酵室温度时，按培养基1％-10％的重量接入种子液，发酵3-15天即可生产得到细菌纤维素。

木葡糖酸醋杆菌属菌株及其选育和生产细菌纤维素的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物，具体涉及一种耐低温的木葡糖酸醋杆菌属菌株及其选育和应用方法。
背景技术
利用微生物(主要是醋杆菌)发酵产生的纤维素，一般称之为细菌纤维素或微生物纤维素，这种纤维素具有纯度高、吸水性强、结晶度高、聚合度高等许多不同于植物纤维素的结构特点，其纤维束直径在100纳米以下，是一种天然的纳米生物材料，是近年来生物材料研究开发的热点之一，在食品、造纸、声音振动膜、人造皮肤的制造及造纸行业有着广泛的应用前景。目前，这种细菌纤维素在食品方面有较广泛的应用，其主要方法是以椰子为培养基，经产纤维素的醋杆菌发酵后生产乳白色或透明的可食用的纤维素凝胶，俗称“椰果”、“椰纤果”或“纳塔”。
这种细菌纤维素目前主要在我国海南省、越南、菲律宾等热带或亚热带地区进行了规模化生产，一方面是因为这些地区有丰富的发酵生产细菌纤维素的天然培养基——热带果汁(如：椰子水、菠萝汁等)；另一方面这些地区常年气温较高，适合发酵生产。但近年来，有许多文献报道了利用非热带果汁(如：柑桔汁、西瓜汁等)作为培养基来生产细菌纤维素。因为细菌纤维素生产的特殊性，一般工业发酵所用的发酵罐培养并不能实现工业化生产，目前主要的规模化生产方式是浅盘培养，这种发酵方式是在一个相对洁净的发酵房内摆放相当数量的浅盘，在浅盘中装入经灭菌的培养基，然后接入能产纤维素的醋杆菌菌种，经静置发酵后，块状的纤维素膜就在浅盘中产生。显而易见，由于不是常规的发酵罐生产，发酵温度并不容易控制，上述浅盘发酵一般是在室温下生产细菌纤维素，这就解释了为何细菌纤维素规模化生产主要处在热带或亚热带地区，这些地区由于常年高温，能够满足微生物发酵所需的温度，即使在海南省，在冬季气温较低时生产“椰纤果”也需给发酵厂房供给热能，以保持发酵的温度。目前发酵生产细菌纤维素或“椰纤果”温度在30℃左右，一般不低于25℃，否则生产难以进行，这给细菌纤维素的生产带来了极大的限制，在气温较低的季节或区域，如果要实现细菌纤维素的规模化生产，必须额外供给大量热能以获得生产所需的温度，但这无疑增加了生产的成本。与此同时，由于浅盘发酵生产对环境的洁净度要求较高，在温度较高的环境中，培养基中极易滋生污染杂菌，从而影响发酵效果，造成产率降低。
文献“细菌纤维素耐低温生产菌株的诱变选育”(中国酿造，2008年第17期)中报道了利用紫外诱变的方法，以获取在低温条件下能高产细菌纤维素的突变株。然而文献中所提到的“低温”是指在25℃培养，这种温度在实际生产没有太大的价值。此外，利用紫外诱变的方法获得的菌株往往在遗传性能发生变化，其安全性还需进一步进行评估才能用于生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种能于低温下生产细菌纤维素的木葡糖酸醋杆菌属菌株。
本发明的另一目的是提供一种上述菌株的的选育方法。
本发明的另一目的是提供一种利用上述菌株在低温下生产细菌纤维素的方法。
发明人在冬季利用木葡糖酸醋杆菌在浅盘静置发酵生产细菌纤维素时发现，在温度在15℃左右时未向发酵房中供暖，一些浅盘中并未获得预期的代谢产物纤维素膜，然而并非所有的浅盘中都如此，仍有部分浅盘中产生了一定厚度的纤维素膜，纤维素膜的厚度不一，这说明有些木葡糖酸醋杆菌菌株能够适应较低温度，在较低温度下仍能生长代谢纤维素。发明人将浅盘中产纤维素膜较厚的菌株筛选出来，命名为323，通过选育，获得了能够在低温下生产的菌种。这种菌种能够在低温下稳定代谢纤维素，而无需供暖以保证发酵的温度，从而节省了大量的能源。
利用浅盘发酵生产细菌纤维素，由于供氧的原因，发酵容器内不能和外界隔绝，因此保持发酵房中的洁净度是必要的，一般是在发酵房内喷洒一定的杀菌剂，如：生石灰、酒精等，但这并不能完全保证发酵过程中杜绝污染的问题，一旦发酵浅盘内滋生了污染菌，如：能快速降解纤维素的霉菌或酵母，将会影响目标产物的得率。发明人将低温(15℃左右)与高温发酵(30℃左右)的方式进行了比较，发现在高温发酵与低温发酵相比，前者在发酵过程中更容易遭受污染，这是因为在这种温度正好是这些污染菌生长繁殖的最适温度，一些生产中常见污染菌如酵母、霉菌等极易在营养丰富的培养基中滋生，从而影响了生产，降低了纤维素的得率。而在低温发酵方式下，常见的微生物污染则不容易发生，因此低温发酵方式一种潜在的可以利用的优势是：可以有效降低浅盘发酵的污染情况的发生。即使是在春夏季生产，如果利用空调对发酵房的温度进行调节，虽然消耗了能源，但却可以大幅度降低污染，提高产物的得率，对于生产者而言，这种低温发酵方式也是可以接受的。
本发明的目的是这样实现的：
一种木葡糖酸醋杆菌属菌株，于2004年7月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏登记号为：CGMCC NO.1186，命名为木葡糖酸醋杆菌323，分类命名为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)。这种菌株能够在低温下稳定代谢纤维素，而无需供暖以保证发酵的温度，从而节省了大量的能源。
本发明的另一目的是这样实现的：
一种上述木葡糖酸醋杆菌属菌株的选育方法，其步骤如下：筛选在常温下产纤维素膜厚、活力强的木葡糖酸醋杆菌，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，选择培养箱温度28℃-31℃作为起始温度，培养2-5天后作为第一代菌种，降低培养箱温度3℃-5℃，筛选第一代菌种中产纤维素膜较厚的菌液作为种子液，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，培养2-5天后作为第二代菌种，以此类推，每转接一代培养温度降低3℃-5℃，同时每次筛选上一代菌种中产纤维素膜厚的菌液作为下一代培养的种子液，经过3-5代筛选后，可筛选出能在10℃-20℃生产细菌纤维素的耐低温的木葡糖酸醋杆菌属菌株。
本发明的另一目的是这样实现的：
一种利用上述菌株生产细菌纤维素的方法，其利用上述经筛选的耐低温的木葡糖酸醋杆菌作为菌株，可以直接在低温下生产的细菌纤维素。其步骤如下：
①菌株扩培：将筛选出的菌株在液体培养基中培养，根据生产需要，按每代扩大10-25倍的产量，培养温度10℃-15℃，每代培养2-5天，通过2-3代的转代扩培，获得所需的种子液。
②培养基制备：将培养基调节pH值至3.0-6.5，培养基煮沸5min-30min。
③培养基装盘：将培养基趁热装入发酵浅盘中，冷却至室温。
④接种发酵：装有培养基的发酵浅盘移入低温发酵室，低温发酵室温度控制在10℃-20℃，待培养基温度降至与低温发酵室温度时，按培养基1％-10％的重量接入种子液，发酵3-15天即可生产得到细菌纤维素。
上述生产步骤③中，若室温已经处于10℃-20℃，则可直接接入种子液发酵3-15天，接种量按培养基1％-10％的重量接入。
本发明提供了一种耐低温的木葡糖酸醋杆菌属菌株及其选育和生产细菌纤维素的方法，这种方法与现有生产细菌纤维素方法比较存在如下优势：
1、可以突破由于气温较低、在生产时必须供暖的限制，可以降低生产成本。
2、本发明提供的在低温下生产细菌纤维素的方法，可以有效防止生产中杂菌的污染，从而提高了得率。
具体实施方式
下面结合非限定性具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例一
筛选在常温下产纤维素膜厚、活力强的木葡糖酸醋杆菌，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，选择培养箱温度30℃作为起始温度，培养3天后作为第一代菌种，调节培养箱温度为25℃，筛选第一代菌种中产纤维素膜较厚的菌液作为种子液，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，培养3天后作为第二代菌种，以此类推，每转接一代培养温度降低5℃，同时每次筛选上一代菌种中产纤维素膜厚的菌液作为下一代培养的种子液，经过5代筛选后，可筛选出能在10℃下生产细菌纤维素的木葡糖酸醋杆菌属菌株，将菌株冷冻干燥后保藏。
利用上述经筛选的耐低温木葡糖酸醋杆菌作为菌种，直接在低温下生产的细菌纤维素。其主要生产步骤包括：
①菌株扩培：将筛选出的菌株在液体培养基中培养，根据生产需要，按每代扩大10倍的产量，通过3代的转代扩培，每代培养3天，培养温度10℃，获得所需的种子液。
②培养基制备：将生产培养基调节pH值3.7，培养基煮沸5min。
③培养基装盘：将培养基趁热装入发酵浅盘中，冷却至室温。
④接种发酵：装有培养基的发酵浅盘移入低温发酵室，其温度控制在10℃，待培养基温度降至与低温发酵室同样温度时，按培养基5％的重量接入种子液，发酵10天。
实施例二
筛选在常温下产纤维素膜厚、活力强的木葡糖酸醋杆菌，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，选择培养箱温度28℃作为起始温度，培养2天后作为第一代菌种，调节培养箱温度为25℃，筛选第一代菌种中产纤维素膜较厚的菌液作为种子液，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，培养3天后作为第二代菌种，以此类推，每转接一代培养温度降低3℃，同时每次筛选上一代菌种中产纤维素膜厚的菌液作为下一代培养的种子液，经过5代筛选后，可筛选出能在16℃下生产细菌纤维素的木葡糖酸醋杆菌属菌株。
利用上述经筛选的耐低温木葡糖酸醋杆菌作为菌株，可以直接在低温下生产的细菌纤维素。其主要生产步骤包括：
①菌株扩培：将筛选出的菌种在液体培养基中培养，根据生产需要，按每代扩大10倍的产量，通过3代的转代扩培，培养温度16℃，每代培养3天，获得所需的种子液。
②培养基制备：将生产培养基调节pH值4.1，培养基煮沸15min。
③培养基装盘：将培养基趁热装入发酵浅盘中，冷却至16℃。
④接种发酵：按培养基1％-10％的重量接入种子液，发酵7天。
实施例三
筛选在常温下产纤维素膜厚、活力强的木葡糖酸醋杆菌，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，选择培养箱温度30℃作为起始温度，培养3天后作为第一代菌种，调节培养箱温度为25℃，筛选第一代菌种中产纤维素膜较厚的菌液作为种子液，接入灭菌后的培养基中进行静置培养，培养3天后作为第二代菌种，以此类推，每转接一代培养温度降低5℃，同时每次筛选上一代菌种中产纤维素膜厚的菌液作为下一代培养的种子液，经过3代筛选后，可筛选出能在20℃下生产细菌纤维素的木葡糖酸醋杆菌属菌株。
利用上述经筛选的耐低温木葡糖酸醋杆菌作为菌株，可以直接在低温下生产的细菌纤维素。其主要生产步骤包括：
①菌株扩培：将筛选出的菌株在液体培养基中培养，根据生产需要，按每代扩大10倍的产量，通过2代的转代扩培，培养温度20℃，每代培养3天，获得所需的种子液。
②培养基制备：将生产培养基调节pH值3.7，培养基煮沸10min。
③培养基装盘：将培养基趁热装入发酵浅盘中，冷却至室温。
④接种发酵：装有培养基的发酵浅盘移入低温发酵室，其温度控制在20℃，待培养基温度降至与低温发酵室同样温度时，按培养基5％的重量接入种子液，发酵5天。