本公开内容涉及具有两个抗原结合部位的抗体，例如其中围绕每一 个部位的位阻(steric hindrance)被减小至最小，以便对靶抗原的亲和 力不被所述形式不利地影响。
多价抗体是已知的。然而，即使基本概念在许多年以前已被公开， 但一直存在着与利用所述技术相关的实际困难，因此，其未曾被广泛用 于在开发中制备药物生物制品(pharmaceutical biologic product)。
非自然/非天然抗体形式可能难以表达，这可使产品成本显著增加 至不能维持的水平。所述形式与标准抗体或片段相比，可能增加免疫原 性或减小体内稳定性和/或可能具有不期望的药代动力学。
特别地，对于非天然形式，与制备同质产物相关的问题一直是被关 注的问题。例如，如果存在超过1种的用于组合组分单体的排列，则可 导致混合物。因此，可能需要精心的纯化方法，以便以令人满意的纯度 水平分离期望的实体/靶实体。
这已通过许多方法得到解决，例如，在双特异性双体抗体(diabody) 的产生中使用短接头据认为促进适当的二聚化。然而，数据已显示，可 变结构域的取向可影响该形式的表达和活性结合部位的形成。
强制以期望的排列或取向装配的一个方法称为“knob-in-hole”法， 其中将大的“knob”引入VH结构域(通过，例如在一些抗体中，用大的 残基苯丙氨酸交换缬氨酸137以及用色氨酸替代亮氨酸45)。在一些抗 体中，可以通过将苯丙氨酸98突变成甲硫氨酸以及将色氨酸87突变成 丙氨酸，在例如VL结构域中引入互补的“hole”。然而，对于几种构 建体，观察到减小的抗原-结合活性。
在本发明中，轻链中的CL和重链中的CH1的提供确保了所述链的正 确取向。
因此，提供了重组融合蛋白，其包含：
重链，其在序列上从N端开始包含，可变结构域(名称为VH1)、CH1 区和另外的可变结构域(名称为VH2)，
轻链，其在序列上从N端开始包含，可变结构域(名称为VL1)、CL 结构域和可变结构域(名称为VL2)
其中所述重链和轻链经匹配提供由VH1和VL1的第一可变结构域对 形成的第一结合部位和由VH2和VL2的第二可变结构域对形成的第二结 合部位，
其中在形成结合部位的可变结构域对之间，例如在VH1与VL1之间 和/或在VH2与VL2之间存在二硫键，并且
所述融合蛋白缀合至PEG聚合物。
本文中提供的重组融合蛋白还有利地具有与完整抗体的半衰期相 似的半衰期，从而可能适合用于治疗。
附图概述
图1显示了根据本公开内容的各种融合蛋白形式。
图2A显示了各种已知的抗体片段形式。
图2B显示了根据本发明的二聚体形式的一种可能的排列。
图3显示了抗体4D5的轻链氨基酸序列。
图4显示了抗体4D5的重链氨基酸序列。
图5显示了A26Fab-(3xG4S)-dsFv645，其中表面Cys突变的位置以 粗体显示。
图6显示了A26Fab-(3xG4S)-dsFv645，S182和S163的PEG化突变 体的非还原凝胶。
本文中使用的重链为包含CH1结构域的链。
通常，所述重链不包含Fc片段，也就是说CH2和/或CH3片段。
在一个实施方案中，重链只包含一个CH1结构域。
本文中使用的VH1和VH2意指，可变区位于根据本发明的抗体的重 链中的事实。其本身并不表示这样的可变区的来源。
本文中使用的VL1和VL2意指，可变区位于根据本发明的抗体的轻 链中的事实。其本身并不表示这样的可变区的来源。
本文中使用的轻链包含CL结构域。在一个实施方案中，轻链只包 含一个CL结构域。
本文中，在轻链中作为恒定区片段的CL与在重链中作为恒定区片 段的CH1的排列据认为使不适当的二聚化降至最低。
在一个实施方案中，根据本公开内容的融合蛋白包含铰链，例如作 为可变结构域的接头。
铰链可在与全长抗体中发现的位置对应的位置上被连接至CH1的C 末端并且可在CH1与VH2之间形成连接。在该实施方案中，还可在轻链 中提供接头，从而VL2被适当地放置以与重链中的VH2配对。轻链中使 用的接头可与重链中使用的铰链接头相同、相似或完全不同。
在备选实施方案中，轻链包含例如连接至CL结构域的C末端并且 将CL结构域与VL2连接的铰链。在该实施方案中，在重链中可能需要接 头来确保VL2和VH2结构域可适当地配对以形成活性部位。重链中的接 头可与轻链中使用的接头相同、相似或完全不同。
下文给出了适当的铰链的实例。
在每一条链中提供可变结构域，以便它们形成与靶抗原适当/充分 结合的预先确定的对(pre-defined pair)。
在一个实施方案中，可变结构域对对靶抗原具有100nm或更小，例 如50nm或更小，特别地1nm或更小的亲和力。
可以通过任何可能的方法，例如包括在宿主中产生抗体，随后筛选 B细胞的方法来鉴定合适的可变结构域对。备选地，合适的对可通过噬 菌体展示法来鉴定。
噬菌体展示法是本领域已知的，且包括由Br inkman等,J.Immunol. Methods,1995,182,41-50；Ames等,J.Immunol.Methods,1995, 184,177-186；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.,1994,24, 952-958；Pers ic等,Gene，1997187,9-18；和Burton等,Advances in Immunology，1994,57,191-280；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982和WO 95/20401； 和US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908； 5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225； 5,658,727；5,733,743和5,969,108公开的那些噬菌体展示法。
转基因小鼠或其它生物(包括其它哺乳动物)可用于产生人源化抗 体。
在一个实施方案中，可变结构域对(或每一个可变结构域对)为同源 对(cognate pair)。
本文中使用的同源对意指，可变结构域的天然对，即，从单个抗体 或表达抗体的细胞分离的可变结构域的天然对。
在一个实例中，同源对是协同结合抗原的互补VH/VL对，即，它们 为互补VH/VL对。
通常，同源对为来源于相同抗体的VH/VL对。
在一个实例中，同源对为，作为对从‘对文库’例如Fab噬菌体展 示文库分离的一对可变结构域。
在一个实例中，VH/VL对是单特异性的。
第一和第二结合部位是相对的项(相对于彼此)，并且为给予结合部 位的名称标记，用于区分一个结合部位与另一个结合部位。如果一个结 合部位被标记为“第一”，则另一结合部位被标记为“第二”。
第一同源对和第二对也是相对的标记，用于在名称上区分对。在本 文中，被标记为“第一对”的一个对在分子中的位置是未确定的。
可变结构域可以已被优化和/或人源化。来源于同源对的已被优化/ 人源化的可变结构域在优化/人源化后仍被认为是同源对。
本文中使用的CL是指轻链中的恒定区部分，其可以是天然存在的 轻链恒定区。
每一个可变结构域可直接连接至或通过接头连接至相关链中的恒 定结构域。
本文中使用的“直接连接至”意指，未被中断，即通过肽键直接连 接的连续氨基酸序列，例如直接连接至可变结构域或相反地恒定区片段 的序列，而不通过接头连接。将“非天然肽接头”插入氨基酸序列中断 了序列，从而在本说明书的意义内，包含“非天然肽接头”的序列被认 为未直接融合于相关部分。天然肽接头的添加也被认为中断了氨基酸序 列，如果其不被认为形成一个或多个相关组分(例如可变结构域或恒定 区片段(例如CL结构域或CH1结构域))的序列的一部分的话。
VH1通常被直接连接至CH1。
VL1通常被直接连接至CL。
在一个实施方案中，VH1CH1和VL1CL一起形成Fab或Fab′。
在一个实施方案中，VH2中的氨基酸(例如其N末端)通过肽键直接 连接至CH1的氨基酸(例如连接至CH1的C末端)。
在一个实施方案中，VH2的氨基酸(例如其N末端)通过接头间接连 接至CH1(例如连接至CH1的C末端)。
在一个实施方案中，VL2的氨基酸(例如其N末端)通过肽键直接连 接至CL的氨基酸(例如连接至CL的C末端)。
在一个实施方案中，VL2的氨基酸(例如其N末端)通过接头间接连 接至CL(例如连接至CL的C末端)。
在一个实施方案中，重链中的VH1为来自重链的可变结构域。即， 来源于抗体的天然重链或其相关片段，或来源于备选来源例如噬菌体展 示并且具有来源于重链的可变结构域的特征。
在一个实施方案中，重链中的VH1为来自轻链的可变结构域。即， 来源于抗体的天然轻链或其相关片段，或来源于备选来源例如噬菌体展 示并且具有来源于轻链的可变结构域的特征。
在一个实施方案中，重链中的VH2为来自重链的可变结构域。
在一个实施方案中，重链中的VH2为来自轻链的可变结构域。
在一个实施方案中，轻链中的VL1为来自重链的可变结构域。
在一个实施方案中，轻链中的VL1为来自轻链的可变结构域。
在一个实施方案中，轻链中的VL2为来自重链的可变结构域。
在一个实施方案中，轻链中的VL2为来自轻链的可变结构域。
在一个实施方案中，VH1为来自轻链的可变结构域并且VH2为来自轻 链的可变结构域。
在一个实施方案中，VH1为来自重链的可变结构域并且VH2为来自重 链的可变结构域。
在一个实施方案中，VH1为来自轻链的可变结构域并且VH2为来自重 链的可变结构域。
在一个实施方案中，VH1为来自重链的可变结构域并且VH2为来自轻 链的可变结构域。
在一个实施方案中，VL1为来自轻链的可变结构域并且VL2为来自轻 链的可变结构域。
在一个实施方案中，VL1为来自重链的可变结构域并且VL2为来自重 链的可变结构域。
在一个实施方案中，VL1为来自轻链的可变结构域并且VL2为来自重 链的可变结构域。
在一个实施方案中，VL1为来自重链的可变结构域并且VL2为来自轻 链的可变结构域。
在一个实施方案中，第一可变结构域对与第二可变结构域对结合相 同的表位。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白紧密地结合靶抗原。
在一个实施方案中，第一可变结构域对与第二可变结构域对结合相 同的抗原，例如第一可变结构域对与第二可变结构域对结合相同抗原上 的不同表位。
因此，在一个实施方案中，根据本公开内容的融合蛋白为单特异性 的。本文中使用的单特异性意指，所有结合部位结合相同靶抗原的事实。
在该实施方案的一个方面，所有结合部位结合所述抗原的相同表 位。
在可选择的实施方案中，至少两个结合部位结合所述靶抗原上的不 同表位。
在一个实施方案中，第一可变结构域对与第二可变结构域对结合不 同的/相异的抗原。
因此，在一个实施方案中，根据本公开内容的融合蛋白是双特异性 的，例如两个结合部位特异性地结合不同或相异的抗原。
本文中使用的特异性结合意指这样的抗体，它们对靶抗原(即，它 们对于其特异的抗原)具有高亲和力并且以低亲和力或低得多的亲和力 结合(或根本不结合)它们对于其不特异的抗原。测量亲和力的方法是本 领域技术人员已知的并且包括测定法如BIAcore。
在一个实施方案中，至少一个可变结构域对(例如同源对)的可变结 构域通过二硫键连接。
在一个实施方案中，例如在第一同源对中，在形成第一结合部位的 可变结构域之间存在二硫键。
在一个实施方案中，例如在第二同源对中，在形成第二结合部位的 可变结构域之间存在二硫键。
在一个实施方案中，在例如在VL2与VH2之间的二硫键不存在的情 况下，在VL1与VH1之间存在二硫键。
在一个实施方案中，在例如在VL1与VL2之间的二硫键不存在的情 况下，在VL2与VH2之间存在二硫键。
在一个实施方案中，在形成第一结合部位的可变结构域之间存在二 硫键，并且在形成第二结合部位的可变结构域之间存在另外的二硫键。
在一个实施方案中，二硫键在下列之间(除非上下文指出，否则在 下列列表中使用Kabat编号。无论何处提及Kabat编号，相关参考资料 为Kabat等,1987,in Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA):
·VH37+VL95C，参见例如Protein Science 6,781-788Zhu等人 (1997);
·VH44+VL100，参见例如;Biochemistry 33 5451-5459 Reiter 等人(1994);或Journal of Biological Chemistry第269卷No.28 pp.18327-18331 Reiter等人(1994);或Protein Engineering,第10 卷no.12pp.1453-1459Rajagopal等人(1997);
·VH44+VL105，参见例如J Biochem.118,825-831 Luo等(1995);
·VH45+VL87，参见例如Protein Science 6,781-788 Zhu等人 (1997);
·VH55+VL101，参见例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人 (1995);
·VH100+VL50，参见例如Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber 等人(1990);
·VH100b+VL49;
·VH98+VL 46，参见例如Protein Science 6,781-788Zhu等人 (1997);
·VH101+VL46；
·VH105+VL43，参见例如;Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90 卷pp.7538-7542Brinkmann等人(1993);或Proteins 19,35-47 Jung 等人(1994)；或
·VH106+VL57，参见例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人 (1995)。
上文中所列的氨基酸对位于有助于被半胱氨酸替换(以便可形成二 硫键)的位置上。可利用已知技术将半胱氨酸改造入这些位置。
因此，在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过 两个半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接， 其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和 VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、 VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个半 胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，所述半 胱氨酸残基在CDR外部，其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、 VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和 VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个半 胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，所述半 胱氨酸残基在CDR外部，其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、 VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和 VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个半 胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中VH的半胱氨酸残基在位置44上并 且VL的半胱氨酸残基在位置100上。
通常，将半胱氨酸对改造入VH和VL中的那些位置，因此在一个实 施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个工程改造的半胱 氨酸残基(一个在VH中，一个在VL中)之间的二硫键连接，其中工程改 造的半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和 VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、 VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可通过两个工 程改造的半胱氨酸残基(一个在VH中，一个在VL中)之间的二硫键连接， 所述半胱氨酸残基在CDR外部，其中工程改造的半胱氨酸残基对的位置 选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100 和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过两个工程改造的半 胱氨酸残基(一个在VH中，一个在VL中)之间的二硫键连接，所述半胱 氨酸残基在CDR的外部，其中工程改造的半胱氨酸残基对的位置选自 VH37和VL95、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和 VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过两个工程改造的半 胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中VH的工程改造的半胱氨酸残基在 位置44上并且VL的工程改造的半胱氨酸残基在位置100上。
在一个实施方案中，VH1直接融合至CH1并且VL1直接融合至CL，并 且在VH2与VL2之间存在二硫键。
在一个实施方案中，在一个或多个结合部位的可变区之间的一个或 多个二硫键具有稳定作用，例如帮助表达和/或使不适当的二聚化降至 最低程度。
在一个实施方案中，在第一同源对中的可变结构域之间和/或第二 同源对中的可变结构域之间存在二硫键，并且在恒定区片段之间例如 CH1与CL之间存在二硫键。
可提供本文中提供的任何形式，而在恒定结构域之间具有或不具有 二硫键。
CL结构域来源于κ或λ。在一个实施方案中CL为cκ。
在一个实施方案中，在CH1与CL之间存在“天然”二硫键。形成键 的‘链间’半胱氨酸的天然位置为人cκ和cλ中的214(Kabat编号第 4版，1987)。
CH1中的形成键的半胱氨酸或‘链间半胱氨酸’的确切位置取决于 实际使用的具体结构域。因此，例如在人γ-1中，形成二硫键的链间半 胱氨酸的天然位置位于位置233(Kabat编号第4版，1987)上。其它人 同种型例如γ2、3、4、IgM和IgD的键形成半胱氨酸的位置是已知的， 例如127。
各种链间二硫键以及其不存在示于图2A。
在一个实施方案中，根据本公开内容的融合蛋白在相应于天然存在 的CH1和CL中的位置的等同位置上具有二硫键。
在一个实施方案中，包含CH1或CL的恒定区具有位于非天然存在的 位置上的二硫键。其可通过在所需位置上将半胱氨酸引入氨基酸链来改 造入分子。该非天然二硫键是除了CH1与CL之间存在的天然二硫键以外 的二硫键或为所述天然二硫键的替代。
在一个实施方案中，CH1与CL之间不存在天然二硫键。在一个实施 方案中，CH1与CL之间的所有链间二硫键都不存在。
在一个实施方案中，每一个恒定区片段融合至至少一个可变结构 域。
在一个实施方案中，每一个恒定区片段还通过肽(例如人工/非天然 存在的接头，例如表1和/或2中的序列)连接至可变结构域，例如所述 可变结构域对于与其融合的可变结构域为非同源对。
在一个实施方案中，恒定区片段(例如重链中的恒定区片段)包含 CH1结构域。在一个实施方案中，恒定区片段由CH1结构域组成。
CH1可来源于人IgA、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4) 或I gM结构域及其同种型。
在一个实施方案中，轻链包含CL结构域。在一个实施方案中，轻 链中的恒定区由CL结构域组成。
在一个实施方案中，重链从N末端开始如下排列：可变结构域VH1 (第一同源对的部分)、CH1、可变结构域VH2(第二同源对的部分)。在该 排列中，CH1可以例如融合至来自第一同源对的可变结构域VL1，且通过 肽连接至第二同源对的可变结构域。
在一个实施方案中，轻链从N末端开始如下排列：VL1(第一同源对 的部分)、CL、VL2(第二同源对的部分)，例如CL可融合至第一同源对 的VL1，并且通过肽连接至第二同源对的VL2。
在下文例如表1中给出了合适的肽接头的实例。
表1.柔性接头序列
SEQ ID NO： 序列 1 SGGGGSE 2 DKTHTS 3 (S)GGGGS 4 (S)GGGGSGGGGS 5 (S)GGGGSGGGGSGGGGS 6 (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 7 (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 8 AAAGSG-GASAS 9 AAAGSG-XGGGS-GASAS
10 AAAGSG-XGGGSXGGGS-GASAS 11 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGS-GASAS 12 AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS 13 AAAGSG-XS-GASAS 14 PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY 15 ATTTGSSPGPT 16 ATTTGS 17 GS 18 EPSGPISTINSPPSKESHKSP 19 GTVAAPSVFIFPPSD 20 GGGGIAPSMVGGGGS 21 GGGGKVEGAGGGGGS 22 GGGGSMKSHDGGGGS 23 GGGGNLITIVGGGGS 24 GGGGVVPSLPGGGGS 25 GGEKSIPGGGGS 26 RPLSYRPPFPFGFPSVRP 27 YPRSIYIRRRHPSPSLTT 28 TPSHLSHILPSFGLPTFN 29 RPVSPFTFPRLSNSWLPA 30 SPAAHFPRSIPRPGPIRT 31 APGPSAPSHRSLPSRAFG 32 PRNSIHFLHPLLVAPLGA 33 MPSLSGVLQVRYLSPPDL 34 SPQYPSPLTLTLPPHPSL 35 NPSLNPPSYLHRAPSRIS 36 LPWRTSLLPSLPLRRRP 37 PPLFAKGPVGLLSRSFPP 38 VPPAPVVSLRSAHARPPY 39 LRPTPPRVRSYTCCPTP- 40 PNVAHVLPLLTVPWDNLR 41 CNPLLPLCARSPAVRTFP
在序列3至7中(S)是任选的。本公开内容中使用的接头可包括表1 中显示的接头。
根据本公开内容的融合蛋白中使用的刚性接头的实例包括，肽序列 GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:42)、PPPP(SEQ ID NO:43)和PPP。
在一个实施方案中，肽接头包括白蛋白结合肽。
白蛋白结合肽的实例提供于WO 2007/106120中并且包括：
表2
SEQ ID NO： 序列 45 DLCLRDWGCLW 46 DICLPRWGCLW 47 MEDICLPRWGCLWGD 48 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE 49 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV 50 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK 51 EDICLPRWGCLWEDD 52 RLMEDICLPRWGCLWEDD 53 MEDICLPRWGCLWEDD 54 MEDICLPRWGCLWED 55 RLMEDICLARWGCLWEDD 56 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG 57 RAPESFVCYWETICFERSEQ 58 EMCYFPGICWM
在一个实施方案中，接头具有效应子功能。
在一个实施方案中，本公开内容的融合蛋白是二聚化的，以提供在 本文中称为(Fab′Fv)2的分子。二聚化例如可以通过下列实现：在两个 根据本公开内容的融合蛋白(即Fab-dsFv)的每一个上的两个溶剂可及 的‘靶’半胱氨酸之间的二硫键的形成，或在两个Fab-Fv的每一个上 的‘靶’半胱氨酸、赖氨酸、糖部分或非天然氨基酸的化学交联。
当希望形成Fab-Fv间二硫键(分子间的键形成)时，Fab-Fv内只有 一个接头包含半胱氨酸。即，当CL与VL2之间的接头确实包含一个或多 个半胱氨酸时，CH1与VH2之间的接头通常不含半胱氨酸。
当CH1与VH2之间的接头包含一个或多个半胱氨酸时，则CL与VL2 之间的接头通常不含半胱氨酸。
接头可包含1至8个半胱氨酸并且可由包含1至8个半胱氨酸的任 何肽序列组成。
需要时，也可对表1、2和3中显示的适当肽序列和这些序列进行 工程改造以包含1至8个半胱氨酸。
铰链可用作接头来促进二聚化，因为它们具有天然柔性并且包含充 足的二级结构来促进有效且稳定的二硫键形成。特别地，当它们包含1 至8个半胱氨酸残基时，可使用任何种类或同种型的天然铰链或经修饰 的铰链。
当CL与VL2之间的天然或经修饰的铰链接头序列确实包含一个或多 个半胱氨酸时，那么CH1与VH2之间的接头通常不含半胱氨酸。
当CH1与VH2之间的铰链接头确实包含一个或多个半胱氨酸时，那 么CL与VL2之间的接头通常不含半胱氨酸。
可选择地，Fab-Fv间二聚化可通过VL1、VH1、cκ、cλ、CH1、VL2 或VH2的任何溶剂或表面可及区域上的‘靶’残基的工程改造来促进。 类似地，‘靶’残基可被工程改造为位于轻链或重链多肽的C末端，例 如在VH2之后或在VL2之后。这些靶残基，优选为紧接VL2或VH2的最后 一个残基之后或位于多肽的接头、铰链或间隔区中的半胱氨酸残基。
当‘靶’残基通过化学交联剂连接时，可改变长度、组成、活性或 异-功能性以细调抗原可及性、功能亲合力、血清半衰期、纯化性质或 贮存及配制性质。化学交联剂可部分由聚乙二醇组成，或可包含用于添 加第三特异性或活性剂的另外的反应性基团。
在一个实施方案中，使用聚合物例如PEG来二聚化本发明的融合蛋 白，从而第一融合蛋白中的一条链缀合至多肽，例如抗体或片段以形成 异二聚体。
在一个实施方案中，使用聚合物将本发明的融合蛋白与根据本公开 内容的第二融合蛋白二聚化，以形成异二聚体或同二聚体。
图2B显示包含本公开内容的两种蛋白质的PEG连接的二聚体形式 的实例。PEG接头在一个融合蛋白中的CH1与第二融合蛋白的CH1之间连 接。然而，可掺入具有适当性质的铰链，用于将PEG接头分子缀合至其 上。可选择地，CL结构域可用于将PEG缀合至其上。
一个或多个可变结构域对之间的二硫键的位置可位于本文中描述 的任何位置。
还可提供在恒定区之间具有或不具有二硫键的形式，其实例在上文 中进行了更详细地论述。
铰链可以是天然铰链或经修饰的铰链。可按照表3使用经修饰的铰 链。
许多经修饰的铰链区已描述于例如US5,677,425、US6642356、 WO9915549、WO2005003170、WO2005003169、WO2005003170、WO9825971 和WO2005003171中，并且这些文献通过引用并入本文。铰链的具体实 例包括表3中显示的那些铰链。
表3.铰链接头序列
SEQ ID NO： 序列 59 DKTHTCXX 60 DKTHTCPPCPA 61 DKTHTCPPCPATCPPCPA 62 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA 63 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY 64 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY 65 DKTHTCCVECPPCPA 66 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA 67 DKTHTCPSCPA 68 DKTHTSXX 69 DKTHTCPPSPA 70 DKTHTSPPCPA 71 DKTHTSPPSPA 72 DKTHTCPPCPATCPPSPA 73 DKTHTCPPCPATSPPCPA 74 DKTHTCPPSPATCPPCPA 75 DKTHTSPPCPATCPPCPA 76 DKTHTCPPCPATSPPSPA 77 DKTHTCPPSPATCPPSPA 78 DKTHTSPPCPATCPPSPA 79 DKTHTSPPSPATCPPCPA 80 DKTHTSPPCPATSPPCPA 81 DKTHTCPPSPATSPPCPA
82 DKTHTSPPSPATSPPSPA 83 DKTHTCPPSPATSPPSPA 84 DKTHTSPPCPATSPPSPA 85 DKTHTSPPSPATCPPSPA 86 DKTHTSPPSPATSPPCPA 87 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPSPA 88 DKTHTCPPCPATCPPCPATSPPCPA 89 DKTHTCPPCPATCPPSPATCPPCPA 90 DKTHTCPPCPATSPPCPATCPPCPA 91 DKTHTCPPSPATCPPCPATCPPCPA 92 DKTHTSPPCPATCPPCPATCPPCPA 93 DKTHTCPPCPATCPPCPATSPPSPA 94 DKTHTCPPCPATCPP SPATCPPSPA 95 DKTHTCPPCPATSPPCPATCPPSPA 96 DKTHTCPPSPATCPPCPATCPPSPA 97 DKTHTSPPCPATCPPCPATCPPSPA 98 DKTHTCPPCPATCPPSPATSPPCPA 99 DKTHTCPPCPATSPPCPATSPPCPA 100 DKTHTCPPSPATCPPCPATSPPCPA 101 DKTHTSPPCPATCPPCPATSPPCPA 102 DKTHTCPPCPATSPPSPATCPPCPA 103 DKTHTCPPSPATCPPSPATCPPCPA 104 DKTHTSPPCPATCPPSPATCPPCPA 105 DKTHTCPPSPATSPPCPATCPPCPA 106 DKTHTSPPCPATSPPCPATCPPCPA 107 DKTHTSPPSPATCPPCPATCPPCPA 108 DKTHTCPPCPATCPPSPATSPPSPA 109 DKTHTCPPCPATSPPCPATSPPSPA 110 DKTHTCPPSPATCPPCPATSPPSPA 111 DKTHTSPPCPATCPPCPATSPPSPA 112 DKTHTCPPCPATSPPSPATCPPSPA 113 DKTHTCPPSPATCPPSPATCPPSPA
114 DKTHTSPPCPATCPPSPATCPPSPA 115 DKTHTCPPSPATSPPCPATCPPSPA 116 DKTHTSPPCPATSPPCPATCPPSPA 117 DKTHTSPPSPATSPPCPATCPPCPA 118 DKTHTSPPSPATCPPSPATCPPCPA 119 DKTHTSPPSPATCPPCPATSPPCPA 120 DKTHTSPPSPATCPPCPATCPPSPA 121 DKTHTCPPSPATSPPSPATCPPCPA 122 DKTHTCPPSPATSPPCPATSPPCPA 123 DKTHTCPPSPATCPPSPATSPPSPA 124 DKTHTCPPSPATSPPSPATCPPSPA 125 DKTHTSPPSPATSPPCPATCPPSPA 126 DKTHTSPPSPATSPPSPATCPPCPA 127 DKTHTSPPSPATSPPCPATSPPCPA 128 DKTHTSPPSPATSPPCPATCPPSPA 129 DKTHTCPPSPATSPPSPATSPPCPA 130 DKTHTCPPSPATSPPSPATSPPSPA 131 DKTHTSPPSPATSPPSPATSPPCPA 132 DKTHTSPPCPATSPPSPATSPPSPA 133 DKTHTSPPSPATCPPSPATSPPSPA 134 DKTHTSPPSPATSPPCPATSPPSPA 135 DKTHTSPPSPATSPPSPATCPPSPA 136 DKTHTSPPSPATSPPSPATSPPSPA 137 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTSY 138 DKTHTCPPSPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY 139 DKTHTSPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY 140 DKTHTCPPSPAGKPTLYNSLVMSDTAGTSY 141 DKTHTSPPSPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY 142 DKTHTSPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTSY 143 DKTHTSPPSPAGKPTLYNSLVMSDTAGTSY 1441 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTSY 145 DKTHTCPPSPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
146 DKTHTSPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY 147 DKTHTCPPSPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTSY 148 DKTHTSPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTSY 149 DKTHTSPPSPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY 150 DKTHTSPPSPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTSY 151 DKTHTCCVECPPSPA 152 DKTHTCCVESPPCPA 153 DKTHTCSVECPPCPA 154 DKTHTSCVECPPCPA 155 DKTHTCCVESPPSPA 156 DKTHTCSVECPPSPA 157 DKTHTSCVECPPSPA 158 DKTHTCSVESPPCPA 159 DKTHTSSVECPPCPA 160 DKTHTCSVESPPSPA 161 DKTHTSSVECPPSPA 162 DKTHTSSVESPPCPA 163 DKTHTSSVESPPSPA 164 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRSPA 165 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPSPRCPA 166 DKTHTCPRCPEPKSSDTPPPCPRCPA 167 DKTHTCPRSPEPKSCDTPPPCPRCPA 168 DKTHTSPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA 169 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPSPRSPA 170 DKTHTCPRCPEPKSSDTPPPCPRSPA 171 DKTHTCPRSPEPKSCDTPPPCPRSPA 172 DKTHTSPRCPEPKSCDTPPPCPRSPA 173 DKTHTCPRCPEPKSSDTPPPSPRSPA 174 DKTHTCPRSPEPKSCDTPPPSPRSPA 175 DKTHTSPRCPEPKSCDTPPPSPRSPA 176 DKTHTCPRSPEPKSSDTPPPCPRSPA 177 DKTHTSPRCPEPKSSDTPPPCPRSPA
178 DKTHTSPRSPEPKSCDTPPPCPRSPA 179 DKTHTCPRSPEPKSSDTPPPSPRCPA 180 DKTHTSPRCPEPKSSDTPPPSPRCPA 181 DKTHTSPRSPEPKSSDTPPPCPRCPA 182 DKTHTCPRSPEPKSSDTPPPSPRSPA 183 DKTHTSPRSPEPKSSDTPPPCPRSPA 184 DKTHTSPRSPEPKSCDTPPPSPRSPA 185 DKTHTSPRCPEPKSSDTPPPSPRSPA 186 DKTHTSPRSPEPKSSDTPPPSPRSPA 187 DKTHTCPSSPA 188 DKTHTSPSCPA 189 DKTHTSPSSPA
其中X代表任何氨基酸，例如XX可代表AA。
在一个实施方案中，根据本公开内容的融合蛋白不包含铰链。
发明人相信，通过在最终构建体中提供作为同源对的可变结构域， 优化并维持了由相关对形成的结合部位的抗原结合性质。
同源对中的二硫桥被认为是有利的，因为它们有助于稳定形式。
应理解，可对本发明提供的抗体可变结构域进行一个或多个氨基酸 置换、添加和/或缺失，而不显著改变抗体结合靶抗原和中和其活性的 能力。任何氨基酸置换、添加和/或缺失的影响可由本领域技术人员例 如使用体外测定例如BIAcore测定容易地测试。
在一个实施方案中，轻链与重链之间的链间二硫键不存在，并且将 不形成键的一个或两个半胱氨酸(链间半胱氨酸)缀合至聚合物。可使用 基因工程技术，用替代氨基酸例如丝氨酸替换相应的链间半胱氨酸来选 择性地缀合一个链间半胱氨酸。
可适当地利用强还原剂，将两个链间半胱氨酸缀合至聚合物。链间 半胱氨酸的各种安排或它们的不存在示于图2A中。
可通过用合适的聚合物进行化学缀合来修饰κ或λ结构域。
在一个实施方案中，本公开内容的融合蛋白中的人cκ在C末端上 包含选自下列的序列:
SFNRGEC(SEQ ID NO:190);
SFNRGCS(SEQ ID NO:191);
SFNRCES(SEQ ID NO:192);
SFNCGES(SEQ ID NO:193);
SFCRGES(SEQ ID NO:194);和
SCNRGES(SEQ ID NO:195)。
cκ的C末端中的一个或多个半胱氨酸，例如如上文中直接描述的， 可用于将PEG聚合物缀合于其上。
cκ中用于缀合的适当位置包括：
1.上c κ，其与本公开内容的融合蛋白中的VL1和VL2几乎等距， 例如Glu143、Gln199和/或Val110(线性且Kabat编号),
2.中cκ，其远离可能是有效抗原结合所必需的所有运动和柔性基 序，例如Lys145和/或Gln147(线性且Kabat编号)和/或
3.下cκ，例如Lys190、Asn210、Arg211和/或Glu213(线性且 Kaba t编号)。
需要时，可利用已知技术，例如用半胱氨酸替代这些氨基酸。
在一个实施方案中，融合蛋白例如在cκ中，特别是在氨基酸序列 的位置108-214(Kabat编号)上包括序列：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS156GNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS202S203PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：196)
在一个实施方案中，本公开内容的融合蛋白中的人CH1在C末端包 含选自如下的序列：
KSC,
KSS和
KCS。
在一个实施方案中，融合蛋白在例如CH1中，特别是在氨基酸序列 的位置121-218(Kabat编号)上包含序列：
S120ASTKGPSVFPLAPSSKSTS139GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS163GALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC222(SEQ ID NO：197)
以粗体标示的氨基酸S120不是CH1的基因/外显子定义的一部分，但 被认为是结构‘肘’的一部分；
以下划线标示的序列不是CH1的基因/外显子定义的一部分，但为上 铰链的一部分。
CH1中用于缀合的适当位置包括:
1.上CH1，其与根据本发明的融合蛋白中的VH1和VH2几乎等距， 例如Asn211(216)和/或Thr123(按Kabat编号，Asn216和/或Thr116)，
2.中CH1，其远离可能是有效抗原结合所必需的所有运动和柔性基 序，例如Ser163和/或Ser127(按Kabat编号，Ser163和/或Ser120)， 和/或
3.下CH1，例如Lys 136、Ser 137和/或Ser222(按Kabat编号， Lys129、Ser130、Ser232)。
需要时，可利用已知技术，例如用半胱氨酸替代这些氨基酸。因此， 在一个实施方案中，根据本发明的工程改造的半胱氨酸是指，其中已用 半胱氨酸残基替代给定的氨基酸位置上的天然存在的残基。
可使用本领域已知的任何方法来进行工程改造的半胱氨酸的引入。 此类方法包括但不限于，PCR延伸重叠诱变、定点诱变或盒式诱变(通常 参见，Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY,1989; Ausbel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing&Wiley-Interscience,NY,1993)。定点诱变试剂盒是可 商购获得的，例如Site-Directed Mutagenesis试剂盒 (Stratagen,La Jolla,CA)。可基于Wells等,1985,Gene,34:315-323 进行盒式诱变。可选择地，可通过重叠寡核苷酸的退火、连接和PCR扩 增和克隆，通过总基因合成来产生突变体。
在一个实施方案中，融合蛋白在CH1和/或CL区中不具有用于缀合 至聚合物的半胱氨酸。
在一个实施方案中，VH1融合至CH1并且连接所述VH1和CH1的氨 基酸序列在本文中称为肘。在一个实施方案中，所述肘具有一个或多个 (例如一个)缀合至其的PEG聚合物。所述PEG聚合物例如在与VH1和VH2 等距的位置上缀合，例如缀合至Thr123(按Kabat编号，Thr 116)和/ 或S119(按Kabat编号，Ser 112)和/或S122(Kabat编号，Ser115) 残基。提供二硫键，例如通过将半胱氨酸改造入分子中的适当位置，以 提供用于将PEG聚合物缀合至其上的底物。
在一个实施方案中，VL1融合至CL，并且连接所述VL1和CL的氨 基酸序列在本文中被称为肘。在一个实施方案中，所述肘具有一个或多 个(例如一个)缀合至其的PEG聚合物。所述PEG聚合物例如在与VL1和 VL2等距的位置上缀合，例如缀合至Lys107、Arg108和/或Thr109(线 性且Kabat编号)残基。如上文中所论述的，需要时，可提供半胱氨酸 用于缀合。
在一个实施方案中，将PEG缀合至在空间上邻近具有聚集倾向的区 域的残基。有利地，邻近此类区域的PEG化可在溶液中在适合于治疗剂 量的浓度上充分遮蔽目标区域，避免分子间相互作用。在轻链中，缀合 可以例如在Thr109或Gln199(线性且Kabat编号)上或其附近，例如以 使ValAla-AlaLys点无效，和/或在Lys149或Asn152(线性且Kabat 编号)上或其附近，例如以使单个Leu点无效。在重链中，缀合可以例 如在Gln178(按Kabat编号Gln179)或Ser180(按Kabat编号Ser182) 或Gly181(按Kabat编号Gly183)上或其附近，以处理ValLys-Tyr点。
在一个实施方案中，将PEG分子连接至溶剂可及的，反应性和/或 表面暴露/可及的氨基酸例如半胱氨酸。
本文中使用的表面暴露的胱氨酸(游离半胱氨酸)意指，当融合蛋白 以“天然”折叠构象存在时，可被接近以将效应分子例如PEG分子缀合 至其上的半胱氨酸。表面半胱氨酸是在抗体或片段的亲水部分中发现的 半胱氨酸。如何工程改造该类型的游离半胱氨酸的实例也提供于 US7,521,541中。
可被半胱氨酸替代的4D5的轻链(序列示于图3中)中的适当氨基酸 包括：
丝氨酸(S):7、9、10、12、14、26、56、60、63、67、76、77、 114、121、127、156、159、168、171、202、203，
苏氨酸(T):5、20、22、31、69、72、74、129、197、206，
甘氨酸(G):16、41、57、68、128、143、157、200、212，
天冬氨酸(D):17、28、70、122、151、167、170，
精氨酸(R):18、24、61、211，
谷氨酰胺(Q):27、79、147、160、195、199，
天冬酰胺(N):30、152、158、210，
丙氨酸(A):34、153，
赖氨酸(K):39、42、126、145、149、169，
谷氨酸(E):55、81、123、161、213。
上文中使用的编号为PDB晶体结构序列文件1FVE中显示的抗体一 级序列编号。这些编号也相应于Kabat编号。本公开内容还扩展至本发 明的融合蛋白中包含的其它抗体或片段中的相应氨基酸(使用Kabat编 号)的替换。
因此，在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包含工程改造的半 胱氨酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S9、S10、S12、 S14、S26、S56、S60、S63、S67、S76、S77、S114、S121、S127、S156、 S159、S168、S171、S202、S203、T5、T20、T22、T31、T69、T72、T74、 T129、T197、T206、G16、G41、G57、G68、G128、G143、G157、G200、 G212、D17、D28、D70、D122、D151、D167、D170、R18、R24、R61、R211、 Q27、Q79、Q147、Q160、Q195、Q199、N30、N152、N158、N210、A34、 A153、K39、K42、K126、K145、K149、K169、E55、E81、E123、E161 和E213。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包含工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S9、S10、S12、S14、 S26、S56、S60、S63、S67、S76、S77、S114、S121、S127、S156、S159、 S168、S171、S202、S203、T5、T20、T22、T31、T69、T72、T74、T109、 T129、T197、T206、G16、G41、G57、G68、G128、G143、G157、G200、 G212、D17、D28、D70、D122、D151、D167、D170、R18、R24、R61、R108、 R211、Q27、Q79、Q147、Q160、Q195、Q199、N30、N152、N158、N210、 A34、A153、K39、K42、K107、K126、K145、K149、K169、K190、E55、 E81、E123、E143、E161和E213。
其它合适的残基描述于文献中，包括WO2006/034488和 WO2008/038024。因此，在一个实施方案中，将半胱氨酸改造入融合蛋 白的轻链，例如:
用C替代V15,
用C替代A43,
用C替代V110,
用C替代S114,
用C替代S121,
用C替代S127,
用C替代A144,
用C替代A153,
用C替代N158,
用C替代S168,
用C替代V205,
用C替代S171,
用C替代S156,
用C替代S202，和/或
用C替代S203。
上述编号参照图3中显示的轻链序列，但本文中的公开内容还扩展 至其它轻链中的相应Kabat位置。
在一个实施方案中，将半胱氨酸改造入融合蛋白的轻链，例如:
用C替代S171,
用C替代S156,
用C替代S202，和/或
用C替代S203。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S9、S10、S12、S14、 S26、S56、S60、S63、S67、S76、S77、S114、S121、S127、S156、S159、 S168、S171、S202、S203、T5、T20、T22、T31、T69、T72、T74、T109、 T129、T197、T206、V15、V110、V205、G16、G41、G57、G68、G128、 G143、G157、G200、G212、D17、D28、D70、D122、D151、D167、D170、 R18、R24、R61、R108、R211、Q27、Q79、Q147、Q160、Q195、Q199、 N30、N152、N158、N210、A34、A43、A144、A153、K 39、K42、K107、 K126、K145、K149、K169、K190、E55、E81、E123、E143、E161和E213。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S9、S10、S12、S14、 S26、S56、S60、S63、S67、S76、S77、S159、T5、T20、T22、T31、T69、 T72、T74、T109、T129、T197、T206、G16、G41、G57、G68、G128、G143、 G157、G200、G212、D17、D28、D70、D122、D151、D167、D170、R18、 R24、R61、R108、R211、Q27、Q79、Q147、Q160、Q195、Q199、N30、 N152、N210、A34、K39、K42、K107、K126、K145、K149、K169、K190、 E55、E81、E123、E143、E161和E213。
在一个实施方案中，将半胱氨酸改造入融合蛋白的轻链恒定区CL， 例如:
用C替代T109,
用C替代E143,
用C替代K145,
用C替代K149，和/或
用C替代N210。
在一个实施方案中，将半胱氨酸改造入融合蛋白的轻链可变区，例 如:
用C替代SEQ ID NO:44的S77，和/或
用C替代SEQ ID NI:44的K107。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包含工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S77、K107、T109、E143、 K145、K149和N210。
上文中指定的所有残基来源于IgG1，但本文中的公开内容还扩展至 来自其它种类和同种型的抗体的其它轻链的相应Kabat位置。
因此，在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包含工程改造的半 胱氨酸，其中所述工程改造的半胱氨酸位置选自，根据Kabat编号系统 编号的5、7、9、10、12、14、15、16、17、18、20、22、24、26、27、 28、30、31、34、39、41、42、43、55、56、57、60、61、63、67、68、 69、70、72、74、76、77、79、81、107、108、109、110、114、121、 122、123、126、127、128、129、143、144、145、147、149、151、152、 153、156、157、158、159、160、161、167、168、169、170、171、190、 195、197、199、200、202、203、205、206、210、211、212和213。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，根据Kaba t编号系统编 号的5、7、9、10、12、14、16、17、18、20、22、24、26、27、28、 30、31,34、39、41、42、55、56、57、60、61、63、67、68、69、70、 72、74、76、77、79、81、107、108、109、122、123、126、128、129、 143、145、147、149、151、152、157、159、160、161、167、169、170、 190、195、197、199、200、206、210、211、212和213。
因此，在一个实施方案中，抗体融合蛋白的轻链包括工程改造的半 胱氨酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，根据Kabat编号系 统编号的位置77、107、109、143、145、149和210。
可被半胱氨酸替代的4D5的重链(序列示于图4)的适当氨基酸包 括：
丝氨酸(S):7、17、21、63、71、86、119、120、122、127、134、 135、137、139、160、163、168、179、180、193、194、195、210、222，
苏氨酸(T):58、69、123、138、167、198、200，
甘氨酸(G):8、9、10、15、16、26、66、100、101、103、140、 141、164、169、181、197，
天冬氨酸(D):62、73、102、215，
精氨酸(R):59、67、87，
谷氨酰胺(Q):3、13、112、155、199、219，
天冬酰胺(N):84、211，
丙氨酸(A):88、121、165
赖氨酸(K):43、65、124、136、208、213、217，
谷氨酸(E):89。
上文中使用的编号为PDB晶体结构序列文件1FVE中显示的抗体一 级序列编号。本公开内容还扩展至本发明的融合蛋白中包含的其它抗体 或片段中的相应氨基酸(使用Kabat编号)的替换。
重链中的所述位置的等价Kabat序列编号为:
丝氨酸(S):7、17、21、62、70、82b、112、113、115、120、127、 128、130、134、156、163、168、180、182、195、196、197、215、232，
苏氨酸(T):57、68、116、133、167、200、205,
甘氨酸(G):8、9、10、15、16、26、65、96、97、99、135、136、 164、169、183、199，
天冬氨酸(D):61、72、98、220，
精氨酸(R):58、66、86，
谷氨酰胺(Q):3、13、105、203，
天冬酰胺(N):82a、216，
丙氨酸(A):84、114、165
赖氨酸(K):43、64、117、129、213、218、222，
谷氨酸(E):85。
因此，在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半 胱氨酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S17、S21、S62、 S70、S82b、S112、S113、S115、S120、S127、S128、S130、S134、S156、 S163、S168、S180、S182、S195、S196、S197、S215、S232、T57、T68、 T116、T133、T167、T200、T205、G8、G9、G10、G15、G16、G26、G65、 G96、G97、G99、G135、G136、G164、G169、G183、G199、D61、D72、 D98、D220、R58、R66、R86、Q 3、Q13、Q105、Q203、N82a、N216、A84、 A114、A165、K43、K64、K117、K129、K213、K218、K222和E85。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S17、S21、S62、S70、 S82b、S112、S113、S115、S120、S127、S128、S130、S134、S156、S163、 S168、S180、S182、S195、S196、S197、S215、S232、T57、T68、T116、 T133、T167、T200、T205、G8、G9、G10、G15、G16、G26、G65、G96、 G97、G99、G135、G136、G164、G169、G183、G199、D61、D72、D98、 D220、R58、R66、R86、Q 3、Q13、Q105、Q179、Q203、N82a、N216、A84、 A114、A165、K43、K64、K117、K129、K213、K218、K222和E85。
其它合适的残基描述于文献包括WO2006/034488和WO2008/038024 中。因此，在一个实施方案中，将半胱氨酸改造入融合蛋白的重链，例 如:
用C替代A40,
用C替代L86,
用C替代A88,
用C替代S119,
用C替代S120,
用C替代A121,
用C替代S122,
用C替代A175,
用C替代V176，和/或
用C替代S179。
上述编号参考图4中显示的重链序列，但本文中的公开内容还扩展 至其它重链中的相应Kabat位置。
根据Kabat编号的等同位置如下：
用C替代A40,
用C替代L82c,
用C替代A84,
用C替代S112,
用C替代S113,
用C替代A114,
用C替代S115,
用C替代A176,
用C替代V177，和/或
用C替代S180。
因此，在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半 胱氨酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S17、S21、S62、 S70、S82b、S112、S113、S115、S120、S127、S128、S130、S134、S156、 S163、S168、S180、S182、S195、S196、S197、S215、S232、T57、T68、 T116、T133、T167、T200、T205、G8、G9、G10、G15、G16、G26、G65、 G96、G97、G99、G135、G136、G164、G169、G183、G199、D61、D72、 D98、D220、R58、R66、R86、Q3、Q13、Q105、Q179、Q203、N82a、N216、 A40、A84、A114、A165、A176、V177、L82c、K43、K64、K117、K129、 K213、K218、K222和E85。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S7、S17、S21、S62、S70、 S82b、S120、S127、S128、S130、S134、S156、S163、S168、S182、S195、 S196、S197、S215、S232、T57、T68、T116、T133、T167、T200、T205、 G8、G9、G10、G15、G16、G26、G65、G96、G97、G99、G135、G136、G164、 G169、G183、G199、D61、D72、D98、D220、R58、R66、R86、Q3、Q13、 Q105、Q179、Q203、N82a、N216、A165、K43、K64、K117、K129、K213、 K218、K222和E85。
在一个实施方案中，将半胱氨酸改造入融合蛋白的重链恒定区CH1， 例如:
用C替代T116,
用C替代S163,
用C替代S182，和/或
用C替代N216。
在一个实施方案中，将半胱氨酸改造入融合蛋白的重链可变结构域 VH，例如:
用C替代SEQ ID NO:227中的S82b。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自S82b、T116、S163、S182 和N216。
上文中指定的所有残基来源于IgG1，但本文中的公开内容还扩展至 来自其它种类和同种型的抗体的其他重链中的相应Kabat位置。
因此，在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半 胱氨酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，根据Kabat编号系 统编号的位置3、7、8、9、10、13、15、16、17、21、26、40、43、57、 58、61、62、64、65、66、68、70、72、82a、82b、82c、84、85、86、 96、97、98、99、105、112、113、114、115、116、117、120、127、 128、129、130、133、134、135、136、156、163、164、165、167、168、 169、176、177、179、180、182、183、195、196、197、199、200、203、 205、213、215、216、218、220、222和232。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，根据Kabat编号系统编 号的位置3、7、8、9、10、13、15、16、17、21、26、43、57、58、61、 62、64、65、66、68、70、72、82a、82b、85、86、96、97、98、99、 105、116、117、120、127、128、129、130、133、134、135、136、156、 163、164、165、167、168、169、179、182、183、195、196、197、199、 200、203、205、213、215、216、218、220、222和232。
在一个实施方案中，抗体融合蛋白的重链包括工程改造的半胱氨 酸，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，根据Kabat编号系统编 号的位置82b、116、163、182和216。
在一个实施方案中，本发明的重组融合蛋白通过重链的位置163和 /或182上的工程改造的半胱氨酸进行PEG化。
在一个实施方案中，融合蛋白包括与PEG分子连接或可与PEG分子 连接的游离半胱氨酸。在一个实施方案中，融合蛋白或其部分包括一个 或多个选自下列的序列:
LVTVCSASTKGPS(SEQ ID NO:198)
LVTVSCASTKGPS(SEQ ID NO:199)
LVTVSSCSTKGPS(SEQ ID NO:200)和/或
HTFPCVLQSSGLYS(SEQ ID NO:201)。
在一个实施方案中，提供了经半胱氨酸工程改造的融合蛋白，其包 括游离半胱氨酸并且任选地包括选自下列的一个或多个的序列：
在一个实施方案中，提供了轻链，其包括序列：
在一个实施方案中，提供了重链，所述重链包含序列：
在一个实施方案中，将PEG聚合物缀合至下轻链可变结构域(例如， VL1和/或VL2)中的位置，所述位置适当地远离CDR，且接近/邻近肘区 域但不在其中编码，例如Ser12、Ser14、Gln79或Glu81，以便实体的 结合不以任何方式减少或受到不利地影响。这些轻链残基的编号与使用 Kabat编号产生的编号相同。
在一个实施方案中，将PEG聚合物缀合至下重链可变结构域(例如， VH1和/或VH2)中的位置，所述位置适当地远离CDR，且接近/邻近肘区 域但不在其中编码，例如Gln13(根据Kabat编号，Gln13)或Glu89(根 据Kabat编号，Glu85)，以便实体的结合不以任何方式减少或受到不利 地影响。
在一个实施方案中，重链包括SEQ ID NO:225和/或227中给出的 序列。
在一个实施方案中，轻链包括SEQ ID NO:228和/或44中给出的序 列。
本文中的所有实施方案是这样的实施方案，其中PEG聚合物至实体 的缀合不减少或不负面地影响本公开内容的融合蛋白的结合/亲和力。
合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物例如聚(乙二醇)或，特别是甲氧 基聚(乙二醇)或其衍生物，特别地具有约15000Da至约40000Da的分子 量。其它合适的聚合物例如淀粉、复杂糖形例如N-GlucNac等等。研究 的聚合物包括，基于氨基酸的那些聚合物，例如聚-GGGGS、聚谷氨酸和 聚天冬氨酸(Schlapschy等,2007;Jultani等,1997;Zunino等, 1982)；基于碳水化合物的那些聚合物，例如氧化葡聚糖、羧甲基葡聚 糖、淀粉和聚唾液酸(Fagnani等,1990;Baudys等,1998;Gregoriadis 等,2000)；以及完全合成的聚合物，例如聚(N-乙烯基砒咯烷酮)、聚 (N-丙烯酰吗啉)、聚氧乙烯醚丙三醇(polyoxyethylated glycerol)、 羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、蝶形领结树枝状聚合物(bow tie dendrimer)和PEG(Kaneda等,2004;Caliceti等,1999;Soucek等, 2002)。
聚合物的大小可根据需要改变，但通常以500Da至80000Da，例如 5000至50000Da例如20000至40000Da的平均分子量存在。可特别地基 于产物的期望的用途(例如，定位至某些组织例如肿瘤的能力或延长循 环半衰期的能力)来选择聚合物的大小(关于综述参见Chapman,2002, Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当期 望产物离开循环并且渗入组织，例如用于肿瘤的治疗时，可以有利地使 用小分子量聚合物(例如具有约5000Da的分子量)。对于其中产物保留 在循环中的应用，可以有利地使用更高分子量的聚合物(例如具有范围 在20000Da至40000Da内的分子量)。
可通过位于抗体片段中的任何可获得的氨基酸侧链或末端氨基酸 官能团(例如任何游离氨基、亚胺基、巯基、羟基或羧基)连接PEG分子。 此类氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA法(参见例如US 5,219,996;US 5,667,425;WO98/25971)改造入片段中。在一个实例中， 本发明的抗体分子是经修饰的Fab片段，其中修饰是，将一个或多个氨 基酸添加至其重链的C末端，以允许效应分子的连接。适当地，另外的 氨基酸形成铰链区，所述链链区包含可与效应分子连接的一个或多个半 胱氨酸残基。多个位点可用于连接两个或更多个PEG分子。
在一个实施方案中，用一个或两个PEG分子PEG化Fab或Fab′。
在一个实施方案中，将PEG分子连接至轻链中的半胱氨酸171，例 如参见WO2008/038024(其通过引用并入本文)。
在一个实施方案中，通过溶剂或表面可及的半胱氨酸PEG化Fab或 Fab′。
适当地，可通过位于融合蛋白中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共 价连接PEG分子。可将连接至融合蛋白的每一个聚合物分子共价地连接 至位于蛋白质内的半胱氨酸残基的硫原子。共价连接通常是二硫键或特 别地，硫-碳键。当巯基用作适当地激活的PEG分子的连接点时，例如 可使用巯基选择性衍生物例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。激活的 PEG分子可在包含上述分子的聚合物-融合蛋白的制备中用作起始材料。 激活的PEG分子可以是包含巯基反应性基团(例如，α-卤代羧酸或酯例 如碘乙酰胺，二酰亚胺例如马来酰亚胺，乙烯基砜或二硫化物)的任何 聚合物。此类起始材料可商购获得(例如来自Nektar,USA;Nippon Oils and Fats(NOF),Japan;Dr Reddy,UK;JenKem,China;Pan Asia Bio, China;SunBio,South Korea;Biovectra,USA)或可使用常规化学方 法从商购可得的起始材料制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG- 胺和20K甲氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如来自Nippon Oils and Fats(NOF),Japan;Dr Reddy,UK;JenKem,China;Pan Asia Bio, China;SunBio,South Korea;Rapp Polymere,Germany)。
可通过许多不同的方法(包括通过醛糖，或更常见地通过位于抗体 片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如任何游离氨 基、亚胺基、巯基、羟基或羧基)来将效应分子例如PEG分子连接至融 合蛋白。效应分子的连接位点可以是随机的或位点特异性的。
通常通过氨基酸例如赖氨酸获得随机连接，这导致效应分子例如 PEG分子在整个抗体片段的许多位点(取决于赖氨酸的位置)被连接。虽 然这在一些情况下已获得成功，但不能控制连接的效应分子例如PEG分 子的确切位置和数目，这可导致活性的丧失(例如如果太少PEG被连接) 和/或亲和力的丧失(例如如果它们干扰抗原结合位点)(Chapman 2002 Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，效应分子例 如PEG分子的受控的、位点特异性连接通常是优选的方法。
效应分子例如PEG分子的位点特异性连接最常见地通过与半胱氨酸 残基连接来获得，因为此类残基在抗体片段中相对稀少。抗体铰链是用 于位点特异性连接的常见区域，因为这些区域包含半胱氨酸残基并且远 离可能参与抗原结合的融合蛋白的其它区域。合适的铰链可天然存在于 片段中或可使用重组DNA技术(参见例如US 5,677,425;WO98/25971; Leong等,2001Cytokine,16,106-119;Chapman等,1999 Nature Biotechnology,17,780-783)来产生。可选择地，或此外，还可将位 点特异的半胱氨酸改造入抗体片段，例如以产生用于连接效应分子的表 面暴露的半胱氨酸(US 5,219,996)。
在一个实施方案中，根据本发明的融合蛋白包含铰链作为CL与VL2 间隔区之间的接头，其具有大致相应于铰链的长度。
已描述了技术，其中天然和工程改造的半胱氨酸用于效应分子例如 PEG分子的位点特异性连接(参见WO2005003169、WO2005003170和 WO2005003171)。在所有这些片段中，重链与轻链恒定区(CH1和CL)之 间的天然链间二硫键不存在，因为链间半胱氨酸已被用作效应分子的连 接位点或因为链间半胱氨酸已被另一种氨基酸替代以避免效应分子连 接至这些半胱氨酸。这些片段还可包含工程改造的半胱氨酸，用作效应 分子的连接位点。在一个实例中，这些工程改造的半胱氨酸是在抗体片 段起始材料的重链与轻链恒定区之间形成二硫键连接的成对的工程改 造的半胱氨酸；然而一旦将效应分子连接至这些半胱氨酸，所述二硫键 连接就消失。
在一个实施方案中，提供了融合蛋白PEG分子缀合物，其中抗体片 段的重链和轻链通过工程改造的链间二硫键(其不是天然链间二硫键) 连接。该工程改造的链间二硫键在效应分子的连接过程中(即使使用了 强还原剂)得到保留。还在轻链:重链界面提供了位点，其中可成功地工 程改造成对的半胱氨酸，以引入被充分包埋的二硫键，从而极大地减少 了所述二硫键被还原剂和效应分子接触的机会，‘包埋的二硫键’的实 例示于WO2007010231中。
这类片段的特别有利的方面在于，工程改造的链间半胱氨酸之间的 二硫键在效应分子连接过程中保持完整。
因此，在根据本发明的一个实施方案中，提供了可将一个或多个效 应分子与其连接的融合蛋白，其特征在于重链(CH1)与轻链(CL)恒定区 之间的天然链间二硫键不存在，且重链(CH1)与轻链(CL)恒定区通过一 对工程改造的半胱氨酸(一个存在于轻链(CL)恒定区中并且另一个存在 于重链恒定(CH1)区中)之间的链间二硫键连接。
在一个实施方案中，将PEG缀合至表面可及的半胱氨酸。
本文中所使用的术语‘天然链间二硫键’是指，在天然存在的种系 抗体基因中编码的重链与轻链恒定区中的半胱氨酸之间存在的链间二 硫键。特别地，天然链间半胱氨酸为轻链恒定区(CL)中的半胱氨酸和重 链的第一恒定区(CH1)中的半胱氨酸，它们在天然存在的抗体中通过二 硫键彼此连接。此类半胱氨酸的实例通常可见于轻链的位置214和人 IgG1的重链的位置233、人IgM、IgE、IgG2、IgG3、IgG4的重链的位 置127以及人IgD和IgA2B的重链的位置128，如由Kabat等,1987,in Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA定义的。应理解，如果已对 抗体片段进行任何修饰例如缺失、插入和/或置换，那么这些半胱氨酸 的确切位置可与天然存在的抗体中的位置不同。
因此，在一个或多个实施方案中，天然链间二硫键不存在。天然链 间二硫键可因一个或多个效应分子与其连接而不存在。
在另一个实施方案中，天然链间二硫键不存在于本发明的抗体片段 中，因为链间半胱氨酸已被另一种氨基酸例如丝氨酸替代。
在本发明的抗体片段中，重链和轻链恒定区通过轻链和/或重链中 的工程改造的半胱氨酸之间的链间二硫键连接。
本发明的融合蛋白适当地具有高结合亲和力(特别地皮摩尔结合亲 和力)。可使用本领域已知的任何合适的方法(包括BIAcore)测量亲和 力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约100pM或更好的结 合亲和力。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白具有约50pM或更好 的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白具有约40pM或 更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白具有约30pM 或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白是完全人 或人源化的并且具有约100pM或更好的结合亲和力。
需要时，可将本发明的融合蛋白缀合至一个或多个其它的效应分 子。应理解，效应分子可包括单个效应分子或被连接以形成可连接至本 发明的抗体的单个部分的两个或更多个此类分子。当期望获得连接至效 应分子的抗体片段时，其可通过标准化学或重组DNA法来制备，其中将 抗体片段直接或通过偶联剂连接至效应分子。用于将此类效应分子缀合 至抗体的技术是本领域公知的(参见，Hellstrom等,Controlled Drug Delivery,第2版,Robinson等,eds.,1987,pp.623-53;Thorpe 等,1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等,1999, Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体的化学方法包括 例如WO 93/06231,WO 92/22583,WO 89/00195,WO 89/01476和 WO03031581中描述的方法。备选地，当效应分子为蛋白质或多肽时，可 使用重组DNA法(例如WO 86/01533和EP0392745中描述的)来实现连接。
本文中使用的术语效应分子包括例如，抗肿瘤剂、药物、毒素、生 物活性蛋白质例如酶、其它抗体或抗体片段、合成的或天然存在的聚合 物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段、放射性核素特别地放射性 碘、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团例如荧光化合物或 可利用NMR或ESR光谱术检测的化合物。
效应分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害 (例如杀伤)的任何试剂。实例包括考布他汀(combrestatins)、多拉司 他汀、埃博霉素、星孢菌素、maytansinoids、海绵抑制素、根霉素 (rhizoxin)、软海绵素、杆孢菌素、hemiasterlins、紫杉醇、细胞松 弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊 苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、 柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢 睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉 素及其类似物或同源物。
效应分子还包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、 6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、 thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环 磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺 铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔 比星)、抗生素类(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光 辉霉素、安曲霉素(AMC)、卡奇霉素或多卡米星)和抗有丝分裂剂(例如 长春新碱和长春碱)。
其他效应分子可包括螯合的放射性核素例如111In和90Y、Lu177、铋 213、锎252、铱192和钨188/铼188;或药物例如但不限于，烷基磷酸胆碱、 拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷(taxoid)和舒拉明。
其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。目的酶包括但不限于蛋白水解 酶、水解酶、裂合酶、异构酶、转移酶。目的蛋白质、多肽和肽包括但 不限于免疫球蛋白、毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外 毒素或白喉毒素、蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β- 干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织型纤溶酶原激活物、 凝血剂或抗血管生成剂例如血管他丁(angiostatin)或内皮他丁 (endostatin)或生物学应答调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1 (IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免 疫球蛋白。
其他效应分子可包括用于例如诊断的可检测的物质。可检测的物质 的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射 性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)和非放射性顺磁 性金属离子。关于可被缀合至抗体以用作诊断剂的金属离子，通常参见 美国专利4,741,900。适当的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;适当的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物 素蛋白和生物素;适当的荧光材料包括伞形酮,荧光素,异硫氰酸荧 光素,罗丹明,二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白;适当的发 光材料包括鲁米诺;适当的生物发光材料包括萤光素酶,萤光素和水 母荧光素;以及适当的放射性核素包括125I,131I,111In和99Tc。
在另一个实例中，效应分子可增加抗体的体内半衰期，和/或减小 抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障至免疫系统的递送。该类 型的适当的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白 蛋白结合化合物例如WO 05/117984中描述的化合物。
当效应分子是聚合物时，其通常可以是合成的或天然存在的聚合 物，例如任选地被取代的直链或支链聚亚烷基(polyalkylene)、聚亚烯 基(polyalkenylene)或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene)聚合物或分支 或未分支的多糖例如同多糖或杂多糖。
可存在于上述合成聚合物上的具体的任选取代基包括一个或多个 羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选地被取代的直链或支链聚(丙二醇) 聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选地被取代的聚(乙二醇)例如甲氧基 聚(乙二醇)或其衍生物。
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其 衍生物。
如本文中所用的，“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如巯基选 择性反应性基团，例如马来酰亚胺等。可将反应性基团直接或通过接头 区段连接至聚合物。应当理解，此类基团的残基在一些情况下可以作为 融合蛋白与聚合物之间的连接基团构成产物的部分。
本发明还提供了编码本文中描述的抗体或其重链或轻链的其片段 的分离的DNA。
在其它方面，提供了包含所述DNA的载体。
可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法对于本领域技术 人员来说是公知的。在该方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York 和由Cold Spring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。
在其它方面，提供了包含所述载体和/或DNA的宿主细胞。
任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的融合蛋白分子 的DNA序列的表达。可使用细菌例如大肠杆菌(E.coli)和其他微生物 系统或也可使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。适当的哺乳动 物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了用于产生根据本发明的融合蛋白分子的方法，其包 括在适合于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培 养包含本发明的载体(和/或DNA)的宿主细胞，和分离所述抗体分子。
为了产生包含重链和轻链的产物，可用两个载体(编码轻链多肽的 第一载体和编码重链多肽的第二载体)转染细胞系。可选择地，可使用 单个载体，所述载体包含编码轻链和重链多肽的序列。
根据本公开内容的融合蛋白分子以良好的水平从宿主细胞表达。因 此，融合蛋白分子的性质得到优化并且有助于商业加工。
本发明的融合蛋白分子在治疗和/或预防病理学状况中是有用的。
因此，提供了用于治疗的融合蛋白分子(例如通过施用治疗有效量 的所述融合蛋白分子)。在一个实施方案中，以包含药学上可接受的赋 形剂的药物制剂的形式施用融合蛋白分子。
因此，本发明还提供了包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、 稀释剂或载体组合的本发明的融合蛋白分子的药物或诊断组合物。因 此，提供了本发明的融合蛋白分子用于制造药物的用途。通常将组合物 作为通常包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的部分来提供。本 发明的药物组合物可额外地包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，其包括添加和 混合本发明的融合蛋白分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释 剂或载体。
融合蛋白分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分或可伴 随其他活性成分，包括其他抗体成分例如抗-TNF、抗-IL-1β、抗-T细 胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体或非抗体成分例如黄嘌呤。其他适当的活性 成分包括能够诱导耐受性的抗体，例如抗-CD3或抗-CD4抗体。
在其他实施方案中，将根据本公开内容的融合蛋白分子或组合物与 其他药学活性剂例如皮质类固醇(例如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动 剂(例如沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增 殖的抑制剂(例如雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤)或可选地CD28和/或 CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个 实施方案中，抑制剂是特异于靶的抗体。
药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的抗体。如本文中所使 用的，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向的疾病或状态或 展示可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初 可在细胞培养测定法或动物模型中，通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或 灵长类动物中估计治疗有效量。动物模型也可用于测定施用的适当的浓 度范围和途径。然后此类信息可用于确定用于人施用的有用剂量和途 径。
用于人受试者的精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重性、受 试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间 和频率、药物组合、对治疗的反应灵敏度和耐受性/应答。该量可通过 常规实验测定并且在临床医生的判断能力之内。通常，治疗有效量可为 0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。可方便地以每 剂量包含预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式提供药物组合物。
可将组合物单独地给患者施用，或可将其与其他试剂、药物或激素 组合(例如，同时、依次地或分开地)施用。
本发明的融合蛋白分子的施用剂量取决于待治疗的病况的性质、呈 现的炎症的程度以及抗体分子是用于预防性用途还是用于治疗已存在 的病况。
剂量频率取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体 分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，那么可能必需每天提供一个 或多个剂量。可选地，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2至15天)， 那么可能只需每天1次、每周1次或甚至每1或2个月1次提供剂量。
药学上可接受的载体本身不应当诱导对接受组合物的个体有害的 抗体产生并且不应当具有毒性。适当的载体可以是大的、缓慢代谢的大 分子例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基 酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如矿物酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、 磷酸盐和硫酸盐，或有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯 甲酸盐。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可额外地包含液体例如水、 盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物 质，可存在于此类组合物中。此类载体使得药物组合物能够被配制为用 于患者摄入的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂和 悬浮液。
用于施用的适当的形式包括适合于胃肠外施用(例如通过注射或输 注，例如通过弹丸注射(bolus injection)或连续输注)的形式。当产物 用于注射或输注时，其可采取在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或 乳剂的形式，并且其可包含配制剂例如混悬剂、防腐剂、稳定剂和/或 分散剂。可选地，抗体分子可以为干燥形式，用于在使用前利用适当的 无菌液体重构。
在配制后，可将本发明的组合物给受试者直接施用。待治疗的受试 者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，组合物适合于给人受 试者施用。
适当地，在根据本公开内容的制剂中，最终制剂的pH与抗体或片 段的等电点的值不相似，例如如果制剂的pH为7，那么8-9或以上的 pI可以是适当的。然而不希望受理论束缚，据认为，这最终可提供具有 提高的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保持在溶液中。
可通过许多途径施用本发明的药物组合物，包括但不限于口服、静 脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见 WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、局部、舌下、阴道内或直 肠途径。还可使用皮下注射器施用本发明的药物组合物。通常，可将治 疗性组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液。还可制备适合于在注射 之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。
通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射来实现组合物的直接 递送或将其递送至组织的胞间隙。还可将组合物施用至伤口内。给药治 疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
应理解，组合物中的活性成分可以是融合蛋白分子。因此，其在胃 肠道中易于降解。因此，如果通过利用胃肠道的途径来施用组合物，那 么组合物必须包含保护抗体免受降解并且一旦其从胃肠道被吸收，就释 放抗体的试剂。
药学上可接受的载体的详尽论述可获自Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)。
在一个实施方案中，以用于局部施用(包括吸入)的制剂提供制剂。
适当的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含抛射剂气体的计量气雾剂 或不含抛射剂气体的可吸入溶液。包含活性物质的根据本公开内容的可 吸入粉剂可仅由上述活性物质组成或可由上述活性物质与药学上可接 受的赋形剂的混合物组成。
此类可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如 乳糖、蔗糖、麦芽糖)、低聚糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨 醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或此类物质彼此的混 合物。可适当地使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别地但非排他 地以它们的水合物形式使用。
用于在肺中沉着的颗粒需要小于10微米，例如1-9微米，例如0.1 至5μm，特别地1至5μm的颗粒大小。活性物质(例如抗体或片段) 的颗粒大小是最重要的。
可用于制备可吸入气雾剂的抛射剂气体在本领域内是已知的。适当 的抛射剂气体选自烃类例如正-丙烷、正-丁烷或异丁烷和卤代烃例如甲 烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上 述抛射剂气体可单独使用或以其混合物形式使用。
特别适合的抛射剂气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的 卤代烷衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227 (1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别适合的。
含有抛射剂气体的可吸入气雾剂还可包含其他成分例如共溶剂、稳 定剂、表面活化剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调整pH的 工具。所有这些成分在本领域内是已知的。
根据本发明的含有抛射剂气体的可吸入气雾剂可包含多至按重量 计算5%的活性物质。根据本发明的气雾剂包含例如，按重量计算 0.002-5%、按重量计算0.01-3%、按重量计算0.015-2%、按重量计算 0.1-2%、按重量计算0.5-2%或按重量计算0.5-1%的活性成分。
可选地，对肺的局部施用还可以是液体溶液或悬浮液制剂的施用， 例如利用装置例如雾化器，例如与压缩机连接的雾化器(例如，由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的与Pari Master(R) 压缩机连接的Pari LC-Jet Plus(R)雾化器)进行施用。
可递送分散在溶剂中，例如以溶液或悬浮液的形式存在的本发明的 融合蛋白分子。可将其悬浮在适当的生理溶液例如盐水或其它药学上可 接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可包含0.05mg至 0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚 山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸 钠/1ml水，以获得约4.0至5.0的pH。悬浮液可利用例如冻干的抗体。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂在本 领域内是公知的并且包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲 剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、 磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、 山梨醇和甘油。可将溶液或悬浮液封装在脂质体或生物可降解的微球体 中。通常利用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过下列来生产和灭菌：过滤用于制剂的缓冲溶剂/溶液、 将抗体无菌悬浮于无菌缓冲溶剂溶液中，和利用本领域技术人员熟悉的 方法将制剂分配至无菌容器中。
可以提供根据本公开内容的可雾化制剂，例如作为包装在箔封袋中 的单个剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)。每一个小瓶在例如2ml 的溶剂/溶液缓冲液的体积中包含单位剂量。
本公开内容的融合蛋白分子被认为适合于通过喷雾法进行递送。
本说明书上下文中的包含意指包括。
当技术上适当时，可组合本发明的实施方案。
实施方案在本文中被描述为包含某些特征/元素。本公开内容也扩 展至由或大体上由所述特征/元素组成的分开的实施方案。
在参考附图的下列实施例中，通过举例说明的方式进一步描述本发 明，其中:
图1显示根据本公开内容的各种融合蛋白形式。
图2A显示各种已知的抗体片段形式。
图2B显示根据本发明的二聚体形式的一种可能的排列。
图3显示抗体4D5的轻链氨基酸序列。
图4显示抗体4D5的重链氨基酸序列。
图5显示A26Fab-(3xG4S)-dsFv645，表面Cys突变的位置以粗体显 示。
图6显示A26Fab-(3xG4S)-dsFv645、S182和S163的PEG化突变体 的非还原凝胶。
实施例
Fab-dsFv
如WO2010/035012中所述，制备Fab-dsFv形式的抗体融合物。 Fab-dsFv包含WO2010/096418中描述的和图5(SEQ ID NOS:225和228) 中给出的称为A26的OX-40抗体的可变区，以及WO2010/035012中描述 的和图5(SEQ ID NOs:227和44)中所示的称为645的抗人血清白蛋白 抗体的可变区序列。形式为A26Fab-ds645Fv。
Fab-dsFv A26-645中的特定残基被选择用于引入半胱氨酸残基作 为PEG化位点。所选择的突变在重链和轻链中并且在Fab和Fv内。小 心地选择远离CDR和任何其它结构上重要的基序的残基，以限制对蛋白 质产生、折叠、亲和力和稳定性的影响。
所选择的残基示于图5和表4中。给特定残基编号，且在图5中以 粗体突出显示。
表4
将突变5和13作为对照，其中促成链间二硫键的两个半胱氨酸残 基之一被突变成丝氨酸，而另一个留下作为PEG化位点。
Fab-dsFv的诱变
如下进行Fab-dsFv A26-645的根据Kabat编号系统编号的表4中的 各位置上的定点诱变：使用标准‘重叠PCR法’将编码Fab-dsFv A26-645 的载体经历定点诱变。简而言之，将两个诱变寡核苷酸与两个侧翼寡核苷 酸一起用于在两个分开的PCR反应中产生两个突变的PCR产物。将来自各 反应的小体积(通常约1ul)的粗制重叠PCR产物在使用相同的两个侧翼 寡核苷酸的第3组装PCR中用作模板。这导致全长突变DNA序列的产生， 所述序列通过限制性酶切/连接克隆入表达质粒，然后通过DNA测序进 行验证。
用于在哺乳动物细胞中表达的Fab-dsFv融合质粒的构建
将每一个Fab-dsFv重链突变体克隆入在HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列控制下的哺乳动物表达载体。将这些突变体与包含相应 Fab-dsFv轻链的相似载体配对，用于在哺乳动物细胞中表达(参见下 文)。
Fab-dsFv的哺乳动物表达
按照制造商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂用 重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简而言之，将2μg重链质粒+2μg 轻链质粒与10μl 293fectin+340μl Optimem培养基于RT下一起温育 20分钟。随后将混合物添加至以悬浮液存在的5x106个HEK293细胞， 在37℃下振荡温育4天。
蛋白质G纯化
通过离心澄清哺乳动物表达悬浮液，使用10kDa分子量截断离心浓 缩器将上清液浓缩至2mL。以16000xg离心浓缩的上清液10分钟，以除 去任何沉淀，随后以1ml/分钟将1.8mL装载至1ml HiTrap Protein-G 柱(GE Healthcare)。用20mM磷酸盐,40mM NaCl pH7.4洗涤柱子，用 0.1M甘氨酸/HCl pH2.7洗脱结合的材料。收集洗脱峰(2.5mL)，且用 100μL的2M Tris/HCl pH8.5将pH调整至~pH7。使用10kDa分子量截 断离心浓缩器将pH经调整的洗脱液渗滤至PBS中且将其浓缩至~500μL。
所有Fab-dsFvs(除Thr109Cys和Asn216Cys外)表达相当好。验证 两个表达较差的突变体的DNA序列，由于不存在序列问题且两者仍然具 有极低的产率，因此，不再进一步分析轻链上的Thr109Cys和重链上的 Asn211Cys。
Biacore
利用在Biacore 3000上进行的表面等离子共振术(SPR)，使用CM5 传感器芯片和HBS-EP(10mM HEPES(pH7.4),150mM NaCl,3mM EDTA, 0.05%v/v表面活性剂P20)电泳缓冲液测定Fab-dsFv构建体的相互作 用的结合亲和力和动力学参数。使用人F(ab′)2-特异性山羊Fab (Jackson ImmunoResearch,109-006-097)或内部产生的抗人CH1单克 隆抗体将Fab-dsFv样品捕获至传感器芯片表面。利用标准胺偶联化学 实现捕获抗体的共价固定。
每一个测定循环由如下步骤组成：首先使用1分钟注射捕获 Fab-dsFv，然后进行由3分钟抗原注射组成的结合期(association phase)，之后监控解离20分钟。在每一个循环后，通过2x1分钟的 40mM HCl注射，然后30秒的5mM NaOH注射来再生捕获表面。所使用的 流速为10μl/分钟(用于捕获)、30μl/分钟(用于结合和解离期)以及 10μl/分钟(用于再生)。
关于动力学测定，进行抗原的滴定，将空白流动池用于参照扣除， 提供缓冲液-空白注射，以扣除仪器噪声和漂移。
通过使用Biacore 3000 Evaluation软件将所得的传感图与标准 1∶1结合模型同时全局拟合(global-fitting)来测定动力学参数。
表5：A26-645突变体对HSA和Ox40的亲和力
Fab-dsFv-Cys的还原和PEG化
通过以1mM的终浓度添加100mM的于0.1M磷酸盐,2mM EDTA pH6 中的β-巯基乙胺(βMEA)，还原0.1M磷酸盐,2mM EDTA pH6中的在CH1 的S182C或S163C上含有引入的半胱氨酸PEG化位点的蛋白质-G纯化的 Fab-dsFv。将还原反应在环境温度下温育1小时，然后在Sephacryl-200 10/30柱上通过SE-HPLC分级分离(以0.1M磷酸盐,2mM EDTA pH6的等 强度梯度运行)。鉴定含有最多单体Fab-dsFv的500μl级分，将其分成 两份。向一半中添加5μl的于0.1M磷酸盐,2mM EDTA pH6中的150mg/ml SUNBRIGHT ME-200MA PEG(NOF)，其是20kDa的马来酰亚胺活性PEG。 向另一半中添加5μl的于0.1M磷酸盐,2mM EDTA pH6中的100mM N- 乙基马来酰亚胺(NEM)。将所有样品在环境温度下温育过夜。在非还原 性4-20%丙烯酰胺Tris/甘氨酸凝胶上分析样品。如制剂商的说明书中 所述，使用Owl Silver Stain试剂盒对凝胶进行银染。参见图6。
图6
A=S182C CH1+PEG
B=S163C CH1+PEG
C=S182C CH1+NEM
图6的泳道C显示，还原未破坏Fab-dsFv内的链内和链间二硫键。 当与未经历还原和NEM加帽的标准(数据未显示)相比较时，在与正确二 硫键键合的Fab-dsFv相同的位置上跑出唯一存在的条带。在泳道A和B 中存在2个条带，较低的条带对应于正确二硫键键合的Fab-dsFv，较高 的条带为PEG化的正确二硫键键合的Fab-dsFv。凝胶上的偏移指示一个 20k PEG的添加。由于使用马来酰亚胺化学，该数据显示Fab-dsFv在 CH1的S182C和S163C上引入的半胱氨酸PEG化位点处位点特异性PEG 化。