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一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
水稻基部节间上生长的分枝一般被称为分蘖，是水稻特定类型的分枝。分蘖在水稻生产中是一个重要的农艺性状。一方面，单株有效分蘖数决定了单位面积的穗数，而穗数又决定了单位面积的产量；另一方面，单株分蘖数目是组成株型结构的重要因素，理想的株型结构有助于通风透光、提高光合效率、合理地吸收分配矿质营养，从而促进有效分蘖和抑制无效分蘖。在生产实践中，一方面，根据分蘖生长发育规律，采取适当的栽培措施促进分蘖成穗；另一方面，根据遗传学的理论培育具有理想分蘖数目的品种。因此，水稻分蘖机理的研究对于农业生产具有重要的指导意义。
一般认为水稻的分蘖数目是受到多个基因控制的数量性状，很容易受环境影响。已报道多达23个影响水稻分蘖数目的数量性状位点(QTLs)，分布在除第9，第10号之外其余的10条染色体上。此外，过去的研究还将与水稻分蘖生长相关的性状如水稻分蘖芽的休眠及叶龄进行了QTL分析，并把这些相关位点在十二条染色体上都作了定位。尽管水稻的分蘖数目受多基因控制，但一些主效基因的单位点突变就能够引起分蘖数目发生显著变化。到目前为止，已经分离和研究了一些分蘖数目发生改变的水稻突变体。日本科学家用γ射线辐射诱变水稻种子，分离得到5个不同的少分蘖突变体，分别命名为rcn1(reduced culm number)、rcn2、rcn3、rcn4和rcn5。这些rcn突变体明显受环境条件的影响，在高温和高氮素营养条件下，其分蘖数目几乎恢复到正常水平。据此推测，rcn突变体分蘖芽分化形成过程可能不受影响，而在随后的生长发育过程中存在缺陷，导致分蘖芽不能伸长，从而引起分蘖数目减少。遗传学分析表明，rcn突变体是由单个隐性基因控制，并且rcn1，rcn2，rcn5被分别定位在水稻的第6，4，6号染色体上。在水稻同属禾本科大麦中，也发现了一些少分蘖突变体如uniculm和rnt。水稻的另一类分蘖突变体，表现为单株分蘖数目增加。至少6个非等位的矮化突变体即d3、d10、d14、d17、d27和d53表现出很强的分蘖能力，并且这些突变体植株矮小丛生。经过遗传连锁分析，控制这些性状的基因位点大多被定位在相关染色体的标记位点附近。其中，D3，D10和D17基因已经被相继克隆。上述基因的研究结果表明水稻分蘖生长调控涉及十分复杂的植物激素调控及信号转导途径。
最近，一类新的调控植物分枝发育的激素或激素合成的前体物质独角金内酯(strigolactones)被鉴定出来，其化学结构上属于类萜内酯类，从植物的根部分泌出来，能防止植物过度分枝。独角金内酯首先作为根寄生杂草的种子发芽促进剂被研究，全世界约有3000多种寄生植物，它们广泛分布于不同的生态环境中，其共同特性是必须从寄主中掠夺某些营养物质和水分等以满足自身生育的需要。寄生植物依其植株叶绿素的有无，分为半寄生植物和全寄生植物；同时依其寄生部位不同，又可分为根寄生植物和茎叶寄生植物。其中列当属和独脚金属分别为全寄生和半寄生植物，两者均为寄生植物中最为重要的根寄生杂草，并在其生育与寄生习性等方面有许多相似性。根寄生植物的生活史包括两个主要的生命阶段：自养阶段和寄生阶段。列当与独脚金种子经过预培养阶段后，在寄主根系分泌的独角金内酯的诱导下萌发，萌发后种子的胚根通过吸器寄生到寄主植物根上，此时寄生物就开始由自养生长向异养生长阶段(寄生状态)转变，即开始吸附在寄主根上并穿入寄主根，通过与寄主根的维管束联结来吸收其营养物质与水分等，直至寄生物植株长大出土、开花、结籽成熟。另有研究发现，这种天然萌发刺激物能召集有助于植物吸收营养的共生菌，这一发现突出显示了植物和真菌之间的密切关系。虽然目前关于独角金内酯的合成及作用机理尚有待于进一步明确。但独角金内酯这种新的植物分枝控制因子为研究农业和自然生态系统中有益真菌共生体和破坏性寄生杂草的控制提供一个新的研究方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植物分蘖控制相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的蛋白名称为D27，来源于水稻，具体为如下(a)或(b)所示的蛋白：
(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物分蘖相关的由(a)衍生的蛋白质。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指保持与序列4所示蛋白具有30％以上同源性的取代和/或缺失和/或添加。
(b)中所述蛋白的氨基酸序列具体可如序列表中序列5所示。
为了使(a)或(b)中的蛋白便于纯化，可在所述蛋白的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列

  标签  残基  序列  Poly-Arg  5-6(通常为5个)  RRRRR  Poly-His  2-10(通常为6个)  HHHHHH  FLAG  8  DYKDDDDK  Strep-tag II  8  WSHPQFEK  c-myc  10  EQKLISEEDL
上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1、2或3所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起。
本发明所提供的编码基因具体可为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)所示的基因：
1)序列表中序列1自5′末端起第2237-7205位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列1所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子；
4)序列表中序列3所示的DNA分子；
5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA分子杂交且编码所述植物分蘖相关蛋白的DNA分子；
6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列有70％以上同源性且编码所述植物分蘖相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。
扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对具体可为如下1)、2)或3)：
1)一条引物的序列如序列表中序列6所示，另一条引物的序列如序列表中序列7所示；
2)一条引物的序列如序列表中序列8所示，另一条引物的序列如序列表中序列9所示；
3)一条引物的序列如序列表中序列10所示，另一条引物的序列如序列表中序列11所示；
上述任一所述蛋白在调节植物分蘖中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述编码基因在调节植物分蘖中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述蛋白在调节植物中独角金内酯含量中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述编码基因在调节植物中独角金内酯含量中的应用也属于本发明的保护范围。
所述植物具体可为水稻。
本发明的最后一个目的是提供一种培育分蘖增多的植物的方法。
本发明所提供的培育分蘖增多的植物的方法，是将植物中含有的上述任一所述编码基因灭活，获得分蘖增多的植物。
其中，所述灭活具体可以通过RNA干扰实现。所述植物具体可为水稻。
本发明利用图位克隆的方法从水稻矮杆多分蘖突变体d27中克隆并鉴定了控制分蘖数目的基因D27。转基因互补实验证明该基因编码的蛋白D27在水稻体内参与独角金内酯的合成，调控植株的分蘖或侧枝的发育。独角金内酯是一类新的分枝调控因子，可以促进根寄生杂草种子的发芽，召集有助于植物吸收营养的共生菌。因此，可以利用基因工程技术调控水稻的分蘖性状，调节植株养分利用效率及有效控制破坏性寄生杂草；D27基因在研究农业和自然生态系统中有益真菌共生体和破坏性寄生杂草的控制方面具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1为水稻多分蘖突变体d27的表型。
图2为pD27C载体图谱及功能互补实验的转基因水稻表型。
图3为RNA干扰的转基因水稻表型。
图4为质谱分析水稻多分蘖突变体d27中独角金内酯的含量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
水稻品种Shiokari和dwarf27(简称d27)(Ishikawa S，Maekawa M，Arite T，etal.Suppression of tiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice.PlantCell Physiol.2005，46，79-86.)。
带有Ubiquitin启动子的载体pTCK303(Wang Z，Chen C，Xu Y，et al.A practicalvector for efficient knockdown of gene expression in rice(Oryza sativa L.).PlantMol.Biol.Rep.2004，22，409-417.)。
下述实施例中水稻是按照如下方法栽培得到的：(1)水稻材料的田间栽培：水稻种子在水中浸种2天后，移入37℃培养间催芽3天，然后将露白的种子播在苗床上进行育秧，到4叶期时将水稻秧苗移栽入水田。(2)水稻材料的水培培养：参照Kamachi等的方法(Kamachi K，Yamaya T，Mae T，et al.A role for glutaminesynthetase in the remobilization of leaf nitrogen during natural senescence inrice leaves.Plant Physiol.1991，96，411-417.)。水稻种子去壳后用70％的乙醇消毒1分钟，再用30％的市售漂白液消毒2小时，用灭菌水漂洗6次后，点播在漂浮于水培溶液的尼龙网上。水培溶液每两天更换一次。
实施例1、蛋白及其编码基因的发现
将水稻(Oryza sativa L.)矮杆多分蘖突变体dwarf27(d27)的种子、野生型Shiokari的种子分别按照上述田间栽培方法进行栽培，苗的形态如图1所示(A表示野生型Shiokari，B表示矮杆多分蘖突变体d27)。然后取叶片进行DNA的提取。
水稻基因组DNA的提取：
采用改进的CTAB方法(Mou Z，He Y，Dai Y，et al.Deficiency in fatty acidsynthase leads to premature cell death and dramatic alterations in plantmorphology.The Plant Cell.2000，12，405-418.)从水稻叶片中提取基因组DNA。取100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl MQ H₂O中。
按照如下步骤进行图位克隆：
1、D27基因的初步定位(通过SSR和CAPS标记定位D27基因)
由于D27基因被初步定位在第11染色体长臂上，首先在第11染色体上选取一些SSR引物进行目的基因的连锁分析，发现目标基因和微卫星RM206标记紧密连锁。根据该标记附近区域已经公布的EST序列数据设计引物，扩增突变体和野生型基因组，发现STS标记C189与该基因连锁，目标基因被定位在这两个标记间区域，遗传距离为3.1cM。
2、D27基因的精细定位
为了进一步缩小目的基因的界定区域，扩大定位群体并发展了更多的CAPS标记。首先，选配和构建了d27-ZF802/ZF802、d27-ZF802/莲塘早和d27-ZF802/协B三个杂交组合。从这三个组合的F₂分离群体筛选6000多个突变体表型单株用于基因连锁分析。其次，通过比对已经公布的93-11和日本晴在定位区间内籼粳稻亚种间基因组序列，寻找差异位点，发展CAPS标记。在F₂突变体群体中进行标记和目的性状的连锁分析时，首先用标记RM206和C189筛选与目的基因之间发生交换的单株，然后用新的CAPS标记对这些交换单株进行连锁分析，最后发现分子标记P3和P6和目的基因紧密连锁，与目的基因之间分别有3个和1个交换单株。最终将目的基因定位在BAC3上的两个CAPS标记界定的18kb区间内。
3、候选基因的鉴定和比较分析
为了确定候选基因，测定了定位区域内的突变体和野生型基因序列，序列比对发现在定位区域内的突变体的基因组序列发生了AAGG 4个碱基缺失。为了明确该4碱基缺失导致突变体表型，对8个野生型品种和6个突变表型单株对应序列进行扩增和测序，结果表明所有野生型材料在这个位点都正常，而与标记P3和P6共分离的交换单株在这个位点都发生了4个碱基缺失。这说明该位点突变导致突变体产生多分蘖表型。基因预测软件GENESCAN分析表明在定位区域18-kb区间内有两个开放阅读框，突变位点发生在其中一个开放阅读框内，因此将该基因确定为候选基因。
4、基因序列的获得
候选基因在KOME数据库内没有对应的全长cDNA序列，为了确定该基因表达而且碱基突变发生在基因的外显子上，以野生型品种Shiokari幼苗的cDNA的第一条链为模板，采用Clonetech RACE技术对候选基因cDNA 5’上游和3’下游非翻译区序列进行扩增。RACE实验结果表明，该基因的5’上游非翻译区序列长217bp，3’下游非翻译区序列长200bp，整个cDNA全长为1,254bp。比对全长cDNA和基因组序列发现该基因有7个外显子和6个内含子。缺失突变发生在该基因的第4个外显子上，最终导致蛋白翻译提前终止。

实施例2、基因的功能与应用
一、基因的制备
提取野生型品种Shiokari幼苗的mRNA，反转录获得cDNA，用引物对D27F/D27R进行PCR扩增，将产物测序，得到野生型品种中D27基因的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
提取d27突变体幼苗的mRNA，反转录获得cDNA，用引物对D27F/D27R进行PCR扩增，将产物测序，得到突变体d27中D27基因的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
D27F：5’-ATGGAGACCACCACGCTTGTGC-3’(序列6)，
D27R：5’-TCAGATGGAGCAATTCACACC-3’(序列7)。
与野生型水稻中D27基因的cDNA序列相比，突变体d27中D27基因的cDNA序列缺失了4个核苷酸(其碱基为AAGG)，缺失突变发生在序列4的自5′末端起第557-560位。缺失突变发生在基因的第4个外显子上，最终导致蛋白翻译提前终止。
二、基因功能互补实验
双元载体pCAMBIA1300购自Takara公司；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105购自Takara公司。
对含有全长基因的BAC克隆OSJNBa0029K08(中国科学院国家基因研究中心)。进行酶切图谱分析，发现这个BAC克隆经限制性内切酶BamHI和KpnI消化可以得到一个含有全长基因的片段。该片段包括基因起始密码子ATG上游2,236bp和终止密码子TGA下游2,044bp，共9,249bp(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)。将该片段亚克隆到具有相同酶切位点的双元载体pCAMBIA1300上，得到重组质粒pD27C(图2A)；将质粒pD27C通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，筛选得到含有重组质粒pD27C的重组农杆菌菌株。
为了便于水稻材料转化，我们通过回交的方式获得的日本晴背景的d27突变体，把该突变体的成熟种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基中，培养3周后，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。
用含有重组质粒pD27C的重组农杆菌菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，后移栽到水田中，获得的转基因植株为T₀代，收获T₀代苗的种子，按照上述田间栽培的方法进行栽培，并通过常规分子检测，获得T₁代转基因苗。观察转基因植株的分蘖情况，获得的6个T₀代转基因株系及其后代转基因植株的分蘖数和株高都恢复到野生型水平。多蘖矮秆突变体转D27基因植株分蘖和株高的功能互补证实D27基因控制水稻的株高和分蘖生长(图2B，1表示野生型日本晴，2表示转入空载体pCAMBIA1300的d27突变体，3表示转入重组载体pD27C的T₁代植株)。
三、RNA干扰实验
1、干扰片段的获得
以Shiokari幼苗的cDNA为模板，分别用引物对D27RNAi1F/D27RNAi1R和引物对D27RNAi2F/D27RNAi2R进行PCR扩增，获得的产物进行测序。两对引物分别扩增得到的产物中基因片段的核苷酸序列如序列表中序列2自5′末端起第164位-820位核苷酸所示，长657bp。
表2、引物序列
  引物名称  引物序列  D27RNAi1F  5’-AAGAGCTCCCAAGAAGACGGAGACGGC-3’  D27RNAi1R  5’-AAACTAGTCACCATGATTCTGCTTTGCG-3’  D27RNAi2F  5’-AAGGATCCCCAAGAAGACGGAGACGGC-3’  D27RNAi2R  5’-AAGGTACCCACCATGATTCTGCTTTGCG-3’
D27RNAi1的前后引物5’端分别加SacI和SpeI接头，D27RNAi2的前后引物5’端分别加BamHI和Kpn I接头。
该D27基因657bp片段经全基因组比对分析确认在水稻基因组中无其它同源序列。
2、干扰载体D27-RNAi的构建：
将引物对D27RNAi1F/D27RNAi1R扩增得到的产物用SacI和SpeI进行酶切，插入带有Ubiquitin启动子的载体pTCK303的SacI和SpeI位点，得到载体1；将引物对D27RNAi2F/D27RNAi2R扩增得到的产物用BamHI和Kpn I进行酶切，插入得到载体1的BamHI和Kpn I位点，得到重组表达载体D27-RNAi(即干扰载体D27-RNAi)，插入片段表达后形成发夹结构。
将干扰载体D27-RNAi通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，筛选得到含有干扰载体D27-RNAi的重组农杆菌菌株。
将野生型水稻日本晴的成熟种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基中，培养3周后，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。
用含有干扰载体D27-RNAi的重组农杆菌菌株侵染野生型水稻愈伤组织。在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，后移栽到水田中，获得的转基因植株为T₀代，观察T₀代苗的分蘖情况。结果表明，将日本晴中D27基因RNAi后，转基因植株明显出现矮生多分蘖的表型(图3，A表示野生型日本晴，B表示转入D27-RNAi的T₀代转基因植株)。
四、系统分析鉴定水稻多分蘖突变体d27中独角金内酯(strigolactones)的含量
参照文献(Umehara M，Hanada A，Yoshida S，et al.Inhibition of shoot branchingby new terpenoid plant hormones.Nature.2008，455，195-200.)所述方法进行独角金内酯的提取及LC/MS/MS测定。
本实验用的实验材料是水稻矮杆多分蘖突变体d27的种子、野生型品种Shiokari的种子。
主要参照Kamachi等的方法(Kamachi K，Yamaya T，Mae T，et al.A role forglutamine synthetase in the remobilization of leaf nitrogen during naturalsenescence in rice leaves.Plant Physiol.1991，96，411-417.)方法将水稻种子进行水培。选取水培生长3至4周的水稻材料，用自来水彻底清洗水稻根系，置于新鲜配制的水培溶液中培养，24小时后收集水培溶液；用等体积的乙酸乙酯萃取三次(即用1/3体积的乙酸乙酯对水培溶液进行萃取，收集乙酸乙酯相I，用1/3体积的乙酸乙酯对水培溶液再次进行萃取，收集乙酸乙酯相II，用1/3体积的乙酸乙酯对水培溶液进行第三次萃取，收集乙酸乙酯相III)，将三次收集的乙酸乙酯相合并，再用1/5体积的0.2M的K₂HPO₄洗涤，收集乙酸乙酯相，加入无水Na₂SO₄以除去乙酸乙酯内水分，通过真空旋转蒸发仪将乙酸乙酯旋干，样品溶于50％乙腈，LC-MS/MS测定。
LC-MS/MS测定的条件为：
Waters高效液相色谱-质谱系统(Quattro Premier XE，Waters MStechnologies，Manchester，UK，Acquity UPLCTM，Waters，Milford，MA，USA)。
色谱分离条件：
色谱柱：Waters BEH-C₁₈柱，2.1×50mm，粒径1.7μm；柱温：25℃；样品温度：25℃；流动相梯度洗脱条件：流动相由30％乙腈的水溶液在6和15min分别线性增长到40％和70％。流速：0.4ml/min。
质谱条件：
脱溶剂气流量(Desolvation Gas FLow)：800L/hr；毛细管电压(CapiLLary)：3.80kV；锥孔电压(Sample Cone)：30V；脱溶剂气温度(Desolvation Temperature)：350℃；离子源温度(Source Temperature)：120℃；碰撞电压(collision energy)：15V，epi-5DS MRM检测离子反应通道331.16＞216.10。在如上实验条件下，epi-5DS标准品的保留时间是9.14min。
实验设3次重复。
本发明利用乙酸乙酯通过液液萃取方式从水稻根系分泌物中分离提取strigolactones，并通过LC/MS/MS测定已明确鉴定的2’-epi-5-deoxystrigol(epi-5DS)来分析strigolactones的含量，结果表明在水稻矮杆多分蘖突变体d27的根系分泌物中检测不到epi-5DS(图4，其中1表示epi-5DS标准品的检测结果，2表示野生型品种Shiokari，3表示水稻多分蘖突变体d27)。
上述结果表明水稻矮杆多分蘖突变体d27中独角金内酯的含量降低，证明水稻D27基因参与独角金内酯的合成。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用
<130>CGGNARC92262
<160>11
<210>1
<211>9249
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa L.)
<400>1
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attatttata ttcctaaggt ttgacttaaa cattgttcta aacgatttct tttacgagta    1920
cggagtactg agggggtata ttccaattag ctatcaacat actaattaac tatcaacctt    1980
aataaaaaca taattattag acactttgat tccttattcc caccacaacc aagatgccct    2040
ctccatgcca tttggtctct tctctctccc tccttgcaaa ttgcatgacc ctctctctct    2100
ctctccactt ctctctataa accttcctct ctcccataac ttctttccat tttcaaccta    2160
caaatatact aatctctctc tagctagtct tcacctacaa atctctctct ctctctctct    2220
ctctctctct ctcttcatgg agaccaccac gcttgtgctg cttcttcctc atggcggcgc    2280
cggcggcgta cggccggcgg cagcggcaac ggcgaagcga agctacgtga tgaggaggtg    2340
ttgctcgacg gtgagggcgg tcatggcgag gccgcaagag gcgccggcgt cggcgccggc    2400
caagaagacg gagacggcgg cgatgatgtc gacggtgcag acggagacgg cggcggcgcc    2460
gccggcgacg gtgtaccggg acagctggtt cgacaagctc gccattggtt acctgtccag    2520
gaaccttcaa gaagcttctg gttcgtgcct ataatctact gaatatatct gatgtattgt    2580
gtgcatgtac atgcaatctt tcggatgaat taatgaatga tcaaatcaac catgcatgca    2640
tatatgtgtg tatttatgat gtttttgcca tggctgattt gattttttga gtggaagaaa    2700
taacatatat atggtgaata aaccaatgtt cttcagttat ttttgtgaca attaaattat    2760
atgtgtattc tacgatcatc cttttcttct tatcgtttgg ttattaatac ccttctcgtc    2820
catgtggaac ataaattctt tgattttttt tattacatgt tgctttggcc agcgtgggtg    2880
tacttgcaat tgcatgcttt ctgtcatatt ataattgaat tagctcttga tttttacatg    2940
caaaagaata atttatttat tgagttgctg atgatcacgt aagcctatgc atgtgagatg    3000
tgatgtgttc tccggcctaa ttaagtatcg acgtactata tatatgcacg tacatcaagt    3060
acggccgtat ttcataattt gattattgtt actgtaccag acaaacctag tgcttaatta    3120
ttgacatata cccaacatcg attaaagtca gtgtgacaca attggcagaa gaagataaca    3180
aaaatcatag aagacatata taccacaaca gtaaaaatta cagtgcaaaa agggatacca    3240
gaagcttctt aattaggtga atggtcacat ttagtagtag taatacacag taataacaca    3300
ttatttgacg aataaattaa gcggaagtgc atgatcagca gcatataagc aagcaactac    3360
gagaggtcaa ccgttgatcc gtgaaaatgt gaggttcaca ttctaggaat cttttagtgc    3420
ttgaatctaa tcctttcgtt tgttttcccg tggacttttt actttgatcg aataaactta    3480
tctgaataat gcgaaggtca aacatcacat gtacgtgccc ggttcttctt ctagaaattc    3540
agccgcttac tataatcgat gctggttttt gaattttttt aaagacattt attttggaac    3600
aacttaaaaa aagtgcacaa accagggttt accaaaccgt ttgaagtgag gttactgcca    3660
ctccatggtt tggcaattat cacgaggtgc gtcgtggttc caaaaactaa taaggttatc    3720
gtatgtgata accgcgataa ctgacggttt tgtaaaccct gcacagacaa cataattata    3780
tttacaggac tgtttggact tcattaacac tgtagcatcc actacatccg tcacctcctt    3840
ggctctctta catgtttagc aaagtcaatc atacagacaa accagaaaag ttcccaacag    3900
acacagaatg ctacttttct agtatgggta attaagcata taagagaaac ttgaaagcat    3960
acaggaaacc gatgttcact agtcctgagt ttttttttgg tgttgttcag gtgcaaatta    4020
actgcaaagg ttgattccct gaaaggaact tgtagcactt gctgactgac acgaacatgc    4080
atgcaatgta atgcagggct aaagaatgaa aaggatggct acgagagcct gatagatgcc    4140
gccctagcca tctcaagaat cttcagtctg gataaacaaa gcgagattgt gacccaagct    4200
cttgaaagag cacttccaag ctacatcctc acaatggtaa gtaccataat ccatgacaat    4260
tggcaatcat gtatgaatta ttgaaattta aaaaacctaa aacttttttt tatttgaaca    4320
ggaagtaaaa ttcagcattt attctctctt ttttttttga ggaaaataca gaacttctgt    4380
aaagggagga aactttaaaa gttctcttct tttatttctt acctcaactt tgattgagaa    4440
ttctgtcggc agatcaaggt gatgatgcca ccttcaagat tttccaggga gtactttgct    4500
gcattcacca cgatattttt tccttggttg gttgggccgt gtgaggtata tattacatac    4560
acagttcctc cttttgttac ttcagttcag aaaggaatag ctgcctgata cctgattagt    4620
gcgtcttcac aagaatgaat tcatgattgt gcctctgctg aaggtagccc tgcagaatga    4680
attgatacga agccacacgt taatttgaga aatattgcta cagaagatct taaaatgctg    4740
ttgaatgtag gttgcgacat ataatatctc tttgttttca ggacattaca ttgtttaaag    4800
tagttgtacg aagcatttgt ggtgcaaata tcatataaag tatggaataa atgcccttgt    4860
atggataact tgtcttctga gtgatcattc tgtcattgaa caaaggttat ggaatctgaa    4920
gttgaaggaa ggaaagagaa aaacgtggta tatatcccca aatgcaggta attcaatcat    4980
catcaagaaa ttgtttcaca agtttgacta ggaggaacat ttgtaaagaa aatttcttca    5040
actgctgggt atcacgtaac atatcggtca aacggtttcc tactcccagc tcttcatagg    5100
cagactacaa aaattttcag gtctataagt agtaacctga tgatttgcaa ttaacatatg    5160
actctgcagc catcaattag ttctgaatga attgttgcag tatgtcaact cttactcaag    5220
ttaatccact catgaaaaac aaattgaaga actatggctg ggacacaagt tgtattgtca    5280
acgtcgtaat tgtggcaact gacaatccta ctcacactcc acaagctgct tattatcaat    5340
tctacccacg ttagacaaac taccatgatt aacactgggt taagaaaaaa atagaatttt    5400
aagtgcagat atatcaataa atactgaaga accaccttaa aaatacataa atactgaaga    5460
acaggatttc tactggtgtt gctgtttttc ttttcttttt ttttaatctc caatcctatt    5520
tgtggcagat ttctggaaag tacaaattgt gttggtatgt gcacaaacct ttgcaagatt    5580
ccatgccaga agttcatcca agattcactt ggcatgaagg tctacatgtc tcccagtaag    5640
cttcctctgc tctgattcat caggaaagcc tgaatatcag tgggtaaaca caacaactta    5700
aatataattt ggtagaataa ggtaaaaata atcaaactcc attcctttgc ataaagttgg    5760
caagaaacta ataatggatt gtcatatcaa catcatctca aagttgaaaa tttgggttga    5820
aacctggtgt gcctctaact tctcaggaca ttgacctaat tttactatag cggatcatta    5880
tacggactgc cgctaaaaca taagtgaact caaaatatca actttcgact ttaagcagaa    5940
ttagtgaagt aaagttgaat caatgtaata ggtccataga ccaccaacgg tttagagcta    6000
tgagaaatac agaacttaat ttgacatatt aatttcatgc cacctctacc taccgacaat    6060
ctgaggactg tgcccttttt gggtatggga accactggcc accattcagg aaacagaaag    6120
ggctgaagtg gggccaacat gtttgcaggt tactacctcc gttttttaat ttataacgtc    6180
gatgactttt tagatatata tgatcattcg tcttattcaa aaaaaaatgc aattatcatt    6240
tattttattg tgacttaatt tatcatcaaa tgttctttaa gcatgactta aatttttttt    6300
atatttgcac aataattttg aataagatga atggtcaaat gtttgtcaaa aagtcaacaa    6360
cgtcatacat taaaaaacgg agggagtaca aagcaatcac aagcaagttg tacagaagaa    6420
gaaagtgcta gcccctactt gtcattctta gtgggaaacg gcaaattgca tggacaagtt    6480
gtggaacagt agtgtgaaat ccagaaatcc acaatgtagt gctgtgaaaa tacagtacaa    6540
gcaccttcac atggcagtga cgagccagca tgtctcgata atcagagcaa tatggttcaa    6600
tttcacttat gagaagcact agttttgaat gttagtcttc tatggtgata cactgaatat    6660
ttcaacatca atcatttttt ctaggtcaaa agatactgat attttatgac atcaccccac    6720
agaatcagat atcaacctct gttggaattt gcaaggctct ctttcctttt tatcctgtcg    6780
agtggttaga tctaggagta agcaatgaat gttatttact gccagtgcta ctaaatagtc    6840
ctatacagct tatttccaat taagcaagaa ggttttttcc aatactaggt caataaaaac    6900
gagaataaag cagagtccct aaagataata gtgaatgtat caagagaaat gtaacataat    6960
tacttacatc aactatatat ttattcttca gattttgaag acatgagctg tgagatgata    7020
tttggacagc aacctcctga agatgaccct gcattgaagc agccatgctt ccggacaaaa    7080
tgtaaggaat tccgcactga ggcaccttca tggattcaat caacactcct ctatattcat    7140
actttttact tcgtgtatat gcaggcgtcg caaagcagaa tcatggtgtg aattgctcca    7200
tctgatctga aagaaattat caatagatag atttcaaatc agtaaaatgc cttaagctcc    7260
atttccttta ttcctttgga aaaaaaatta gcaccatcat tgtttttgcc cacaacacca    7320
gcatgtttgg aacatacact cttcattgta atccaaaagt aatctaagag gaaatgaaag    7380
gcccaacagt aaccatttta aggtacatct actccatatg ttgttaaaag aggaattgaa    7440
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aattaaatcg atgcacccct tgcagagaca tattctattt attactgtaa ttgtagaaaa    7560
tttcagttaa ttacagaaag atgtgagtgg aaaccaagta ctatttcatg gacgaaaatt    7620
ataatgcacg gattcctcta aaagaattta ttttaaaact ctaactgata taactctcga    7680
tccactatca gttattaggg gaaatattct atttgtcact aagtattttg aggaaaatag    7740
aattctatat atgtatatgg ctgtctatgc actgtctcat ccacccaatg tgctaaaaga    7800
tttgagcagg gacattgaaa ttattagaga tggcaatttt taaagtttgc atgactatcg    7860
aggcatatgg gacatatagg acagtgccta actcataaat atatgtcaga aaaccattct    7920
ccacactaca tcaggatatt agtatgaaat ggggaaactg aacatatcta catgtacttc    7980
tcatcagctt gcattttgta caaaaaaaaa accaaaacca agattgcaat gccagacctg    8040
cgggattttt aagttggaaa agaaaatgat tcagcacctc cagagaggtc catggttcta    8100
gcaaatacca aaagaaagta gctatctcac atattgattc tggagacatt ggtacaccaa    8160
ttatgacaga cttgaccaaa attgtataaa gtaacacaac tttaacatat tgtagaaaaa    8220
aaatagttgg gatctaccac actgatgaaa ccactttttg agacctagag cacttacagg    8280
ataaattcac ataaagaatt caaatgtcac aacaaaatca tgacagggat aaccattgct    8340
actgacaagg ggatcgtgcg ccacattact gttctttgtc tcctgatgca tgatcgtttc    8400
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cctgatgcat gatctgtttt cataactcta ttgggtattg gctttagttg ttctccaaaa    8520
gattcagata aggtcctgac tgaatgtact acataactat agtctccatt aggattgctg    8580
gttcagtata acaaatggtg tacgcagaat tcaacaacca ttgagaaggc cagtttttat    8640
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aacccaagcc aagccacatc ctacatgaat gtcattacaa gtgcaaatct aatgaagctc    8820
caggttgtcc cagttttata ttgtacaaga taatctgcac gaatcatgat atttgattgt    8880
aaaaaggaaa acctaatact tcaaagtcag ttcaagaacg atgcaaatat gtgcagtact    8940
ttttgcaaat tagcttattg aaagaacgat ttaacaaata agaaacagga gaaacacaac    9000
attcctagct gttcactttt gcatgatatt caactaggag ccttgtgggg tggtggtgcc    9060
attttgcaag tgatacactt agtatggcac ctagctaatt tccaacctta tatacaataa    9120
tcaggtcaag gcctcactag gcttcaaaaa tgttagaacc tctgcagaaa tatcttacta    9180
tatattgata ctttaaaaaa ttgcaatctt gaaaagaaac tgtaaacaca aatgtatggt    9240
attggtacc                                                            9249
<210>2
<211>837
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa L.)
<400>2
atggagacca ccacgcttgt gctgcttctt cctcatggcg gcgccggcgg cgtacggccg    60
gcggcagcgg caacggcgaa gcgaagctac gtgatgagga ggtgttgctc gacggtgagg    120
gcggtcatgg cgaggccgca agaggcgccg gcgtcggcgc cggccaagaa gacggagacg    180
gcggcgatga tgtcgacggt gcagacggag acggcggcgg cgccgccggc gacggtgtac    240
cgggacagct ggttcgacaa gctcgccatt ggttacctgt ccaggaacct tcaagaagct    300
tctgggctaa agaatgaaaa ggatggctac gagagcctga tagatgccgc cctagccatc    360
tcaagaatct tcagtctgga taaacaaagc gagattgtga cccaagctct tgaaagagca    420
cttccaagct acatcctcac aatgatcaag gtgatgatgc caccttcaag attttccagg    480
gagtactttg ctgcattcac cacgatattt tttccttggt tggttgggcc gtgtgaggtt    540
atggaatctg aagttgaagg aaggaaagag aaaaacgtgg tatatatccc caaatgcaga    600
tttctggaaa gtacaaattg tgttggtatg tgcacaaacc tttgcaagat tccatgccag    660
aagttcatcc aagattcact tggcatgaag gtctacatgt ctcccaattt tgaagacatg    720
agctgtgaga tgatatttgg acagcaacct cctgaagatg accctgcatt gaagcagcca    780
tgcttccgga caaaatgcgt cgcaaagcag aatcatggtg tgaattgctc catctga       837
<210>3
<211>833
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa L.)
<400>3
atggagacca ccacgcttgt gctgcttctt cctcatggcg gcgccggcgg cgtacggccg    60
gcggcagcgg caacggcgaa gcgaagctac gtgatgagga ggtgttgctc gacggtgagg    120
gcggtcatgg cgaggccgca agaggcgccg gcgtcggcgc cggccaagaa gacggagacg    180
gcggcgatga tgtcgacggt gcagacggag acggcggcgg cgccgccggc gacggtgtac    240
cgggacagct ggttcgacaa gctcgccatt ggttacctgt ccaggaacct tcaagaagct    300
tctgggctaa agaatgaaaa ggatggctac gagagcctga tagatgccgc cctagccatc    360
tcaagaatct tcagtctgga taaacaaagc gagattgtga cccaagctct tgaaagagca    420
cttccaagct acatcctcac aatgatcaag gtgatgatgc caccttcaag attttccagg    480
gagtactttg ctgcattcac cacgatattt tttccttggt tggttgggcc gtgtgaggtt    540
atggaatctg aagttgaagg aaagagaaaa acgtggtata tatccccaaa tgcagatttc    600
tggaaagtac aaattgtgtt ggtatgtgca caaacctttg caagattcca tgccagaagt    660
tcatccaaga ttcacttggc atgaaggtct acatgtctcc caattttgaa gacatgagct    720
gtgagatgat atttggacag caacctcctg aagatgaccc tgcattgaag cagccatgct    780
tccggacaaa atgcgtcgca aagcagaatc atggtgtgaa ttgctccatc tga           833
<210>4
<211>278
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa L.)
<400>4
Met Glu Thr Thr Thr Leu Val Leu Leu Leu Pro His Gly Gly Ala Gly
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Lys Arg Ser Tyr Val Met
            20                  25                  30
Arg Arg Cys Cys Ser Thr Val Arg Ala Val Met Ala Arg Pro Gln Glu
        35                  40                  45
Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ala Lys Lys Thr Glu Thr Ala Ala Met Met
    50                  55                  60
Ser Thr Val Gln Thr Glu Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Asp Ser Trp Phe Asp Lys Leu Ala Ile Gly Tyr Leu Ser Arg Asn
                85                  90                  95
Leu Gln Glu Ala Ser Gly Leu Lys Asn Glu Lys Asp Gly Tyr Glu Ser
            100                 105                 110
Leu Ile Asp Ala Ala Leu Ala Ile Ser Arg Ile Phe Ser Leu Asp Lys
        115                 120                 125
Gln Ser Glu Ile Val Thr Gln Ala Leu Glu Arg Ala Leu Pro Ser Tyr
    130                 135                 140
Ile Leu Thr Met Ile Lys Val Met Met Pro Pro Ser Arg Phe Ser Arg
145                 150                 155                 160
Glu Tyr Phe Ala Ala Phe Thr Thr Ile Phe Phe Pro Trp Leu Val Gly
                165                 170                 175
Pro Cys Glu Val Met Glu Ser Glu Val Glu Gly Arg Lys Glu Lys Asn
            180                 185                 190
Val Val Tyr Ile Pro Lys Cys Arg Phe Leu Glu Ser Thr Asn Cys Val
        195                 200                 205
Gly Met Cys Thr Asn Leu Cys Lys Ile Pro Cys Gln Lys Phe Ile Gln
    210                 215                 220
Asp Ser Leu Gly Met Lys Val Tyr Met Ser Pro Asn Phe Glu Asp Met
225                 230                 235                 240
Ser Cys Glu Met Ile Phe Gly Gln Gln Pro Pro Glu Asp Asp Pro Ala
                245                 250                 255
Leu Lys Gln Pro Cys Phe Arg Thr Lys Cys Val Ala Lys Gln Asn His
            260                 265                 270
Gly Val Asn Cys Ser Ile
        275
<210>5
<211>227
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa L.)
<400>5
Met Glu Thr Thr Thr Leu Val Leu Leu Leu Pro His Gly Gly Ala Gly
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Lys Arg Ser Tyr Val Met
            20                  25                  30
Arg Arg Cys Cys Ser Thr Val Arg Ala Val Met Ala Arg Pro Gln Glu
        35                  40                  45
Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ala Lys Lys Thr Glu Thr Ala Ala Met Met
    50                  55                  60
Ser Thr Val Gln Thr Glu Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Asp Ser Trp Phe Asp Lys Leu Ala Ile Gly Tyr Leu Ser Arg Asn
                85                  90                  95
Leu Gln Glu Ala Ser Gly Leu Lys Asn Glu Lys Asp Gly Tyr Glu Ser
            100                 105                 110
Leu Ile Asp Ala Ala Leu Ala Ile Ser Arg Ile Phe Ser Leu Asp Lys
        115                 120                 125
Gln Ser Glu Ile Val Thr Gln Ala Leu Glu Arg Ala Leu Pro Ser Tyr
    130                 135                 140
Ile Leu Thr Met Ile Lys Val Met Met Pro Pro Ser Arg Phe Ser Arg
145                 150                 155                 160
Glu Tyr Phe Ala Ala Phe Thr Thr Ile Phe Phe Pro Trp Leu Val Gly
                165                 170                 175
Pro Cys Glu Val Met Glu Ser Glu Val Glu Gly Lys Arg Lys Thr Trp
            180                 185                 190
Tyr Ile Ser Pro Asn Ala Asp Phe Trp Lys Val Gln Ile Val Leu Val
        195                 200                 205
Cys Ala Gln Thr Phe Ala Arg Phe His Ala Arg Ser Ser Ser Lys Ile
    210                 215                 220
His Leu Ala
225
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
atggagacca ccacgcttgt gc                              22
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
tcagatggag caattcacac c                               21
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
aagagctccc aagaagacgg agacggc                         27
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
aaactagtca ccatgattct gctttgcg                             28
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
aaggatcccc aagaagacgg agacggc                              27
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
aaggtaccca ccatgattct gctttgcg                             28