应用发酵生产L苏氨酸的方法.pdf

本发明提供一种大肠杆菌变体，其是经过下述改性的大肠杆菌：(1)琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；(2)苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低；(3)天冬氨酸激酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的细胞内活性增强；(4)导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因。其中所述的高丝氨酸合成酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和苏氨酸脱氨酶分别源于大肠杆菌。本发明也提供一种发酵生产L-苏氨酸的方法，包括在合适的培养基中培养上述大肠杆菌变体，积累L-苏氨酸，然后从培养基中收集L-苏氨酸。

1、  一种大肠杆菌变体，其中琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性降低。

2、  根据权利要求1所述的大肠杆菌变体，其中所述的细胞内活性降低是通过化学诱变和紫外诱变完成的；其中经过所述化学和紫外诱变后，琥珀酰高丝氨酸合成酶的突变包括：脯氨酸取代第61位的丝氨酸，丝氨酸取代第107位的甘氨酸，组氨酸取代第165位的丝氨酸；二氢吡啶二羧酸合成酶的突变包括：丙氨酸取代第44位的苏氨酸，赖氨酸取代第55位的谷氨酸，和组氨酸取代第65位的天冬氨酸；经过上述诱变所得到的是大肠杆菌K16P2株。

3、  根据权利要求1或2所述的大肠杆菌变体，其中还包括苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低，所述的苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低是通过Red同源重组技术敲除苏氨酸脱氨酶基因完成的。

4、  根据权利要求1或2所述的大肠杆菌变体，其中还包括天冬氨酸激酶的细胞内活性增强，其中所述的天冬氨酸激酶的细胞内活性增强通过下述方法实现：改造与苏氨酸结合的位点，去除L-苏氨酸对天冬氨酸激酶I的反馈抑制作用和通过改造与赖氨酸结合位点去除L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制作用；优选的，其中所述去除L-苏氨酸对天冬氨酸激酶I(AK I)反馈抑制作用的突变包括：用另一种氨基酸取代109位上的丝氨酸，用另一种氨基取代163位上的丝氨酸；或者，其中用甘氨酸取代109位上丝氨酸；用丙氨酸取代163位上的丝氨酸。

5、  根据权利要求4所述的大肠杆菌变体，其是大肠杆菌BL1126P，该菌种的保藏号为：CGMCC No：2369。

6、  根据权利要求4所述的大肠杆菌变体，其中所述去除L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III(AKIII)的反馈抑制作用的突变包括：用另一种氨基酸取代330位上的甘氨酸，用另一种氨基酸取代400位上的半胱氨酸，用另一种氨基酸取代403位上的甘氨酸；或者，用天冬氨酸取代330位上的甘氨酸，用甘氨酸取代400位上的半胱氨酸，用天冬氨酸取代403位上的甘氨酸。

7、  根据权利要求6所述的大肠杆菌变体，其是大肠杆菌BL2125P，该菌种的保藏号为：CGMCC No：2367。

8、  根据权利要求1-7中任意一项所述的大肠杆菌变体，其中进一步包括天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸激酶中的至少一种酶的细胞内活性增强，优选的，其中所述细胞内酶活性的增强是通过增加质粒表达量而提高其细胞内活性。

9、  根据权利要求8所述的大肠杆菌变体，其中进一步包括导入了血红蛋白基因；优选的，其中所述的血红蛋白基因来源于透明颤菌的血红蛋白基因；且所形成的大肠杆菌变体是基因工程菌K21P3。

10、  一种生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在在合适的培养基中培养权利要求1-19中任意一项所述的大肠杆菌变体，在其培养基中产生和聚集L-苏氨酸，并从中收集L-苏氨酸；其中所述的细菌是经过下述改性的大肠杆菌：(1)琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；(2)苏氨酸脱氨酶细胞内活性降低；(3)天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶细胞内活性增强；和/或(4)导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因；其中所述的高丝氨酸合成酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和苏氨酸脱氨酶分别源于大肠杆菌；优选的，其中所述的大肠杆菌变体是基因工程菌K21P3；更优选的，其中所述的培养在有氧条件下进行36～60时；培养期间的温度控制在37℃左右；pH值控制在6～8之间；并可使用无机或有机酸或碱性物质以及氧气调节pH值。

应用发酵生产L-苏氨酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物工业。特别是涉及应用微生物发酵生产L-苏氨酸的方法，以及用于该生产方法的基因工程菌。
背景技术
苏氨酸是动物维持生长所必需的氨基酸，在以菜籽粕或大豆粕为蛋白质主要来源的生猪低蛋白质日粮中，赖氨酸是第一限制性氨基酸，苏氨酸是第二限制性氨基酸。L-苏氨酸广泛用于动物饲料和食品添加剂，以及用作医学或药物学用途的流体和合成材料。L-苏氨酸是使用衍生自野生型大肠杆菌、棒状杆菌属、杀雷氏菌(Serratia)、普罗威登斯菌(Providencia)等的合成突变体以及它们的二氨基庚二酸、甲硫氨酸、赖氨酸或异亮氨酸营养缺陷的合成突变体(日本专利申请公开号平2-219582，申请人Microbiolo.Biotechnol.，以及韩国专利公开号92-8365)。中国专利公开号85104604A公开了一种采用短杆菌属细菌的α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)和S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)双重抗性变异株生产L-苏氨酸的方法。韩国专利申请号90-22965公开了一种L-苏氨酸生产菌株TF4076(KFCC10718)，它是甲硫氨酸营养缺陷型并且抗苏氨酸类似物(AHV：α-氨基-β-羟基戊酸)、赖氨酸类似物(AEC：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、异亮氨酸类似物(α-氨基丁酸)和甲硫氨酸类似物(乙硫氨酸)。
在大肠杆菌中L-苏氨酸的合成路线主要是：

在大肠杆菌中，L-苏氨酸的合成从天冬氨酸开始，天冬氨酸在天冬氨酸激酶I(AK I)催化下转变为天冬氨酰磷酸，经过还原最后生成高丝氨酸。天冬氨酸激酶I(AK I)是一个多功能酶，从天冬氨酸到高丝氨酸的代谢均由AK I催化。AK I由thrA基因编码。高丝氨酸在高丝氨酸激酶催化下磷酸化，磷酸化的高丝氨酸通过苏氨酸合成酶合成L-苏氨酸。高丝氨酸激酶由thrB基因编码，而苏氨酸合成酶由thrC基因编码。
对苏氨酸的代谢调节，现在研究得比较清晰。在L-苏氨酸的代谢过程中，thrA基因编码的AK I起决定作用。一般大肠杆菌合成苏氨酸的量有限，因为L-苏氨酸抑制AK I酶的活性，并通过苏氨酸-tRNAs调节苏氨酸操纵子的转录。苏氨酸类似物可以用来筛选苏氨酸生产菌种，如在α-氨基-β-羟基戊酸的抗性菌株中，thrA基因发生突变，突变基因编码的AK I酶抵抗苏氨酸的反馈抑制，从而导致苏氨酸的积累。在具有抗生素borrelidin抗性的大肠杆菌中，苏氨酸-tRNAs合成酶的构象发生变化，大大降低了与苏氨酸的亲和力，使苏氨酸大量积累。
限制苏氨酸大量合成的另一个主要因素来源于异亮氨酸，异亮氨酸的合成以L-苏氨酸为原料。因此，如果其合成途径不切断，只能导致异亮氨酸的积累，而L-苏氨酸含量不会增高；另一方面，异亮氨酸对thrA基因的转录水平具有强烈的反馈抑制，高含量的异亮氨酸阻断AK I酶的合成。
发明内容
本发明的主要目的是通过改变菌种的代谢调节，寻找到一种能高产苏氨酸的基因工程菌。为达到上述目的，本研究人员进行了不懈的努力和勤奋的研究，结果成功地获得了经过下述改性的大肠杆菌：(1)琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；(2)苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低；(3)天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶的细胞内活性增强；和/或(4)导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因。(下文也称“本发明的细菌”)
优选的，本发明的细菌是包括上述所有改性的大肠杆菌；最优选的，本发明改性的大肠杆菌是基因工程菌K21P3。
在本发明中，术语“细胞内活性增强”表示与野生型菌株(例如大肠杆菌BL21菌株)或亲本菌株(该菌株在本发明特定的组合中包括所有酶的细胞内活性都没有增强的菌株)相比，细胞内的酶促活性增强，还表示一种细菌具有一种野生型菌株或亲本菌株所没有的酶促活性。
在本发明中，术语“细胞内活性降低”表示与野生型菌株或亲本菌株相比，细胞内的酶促活性减弱。用于测定上述酶活性的方法是公知的，并且，本领域技术人员可以方便准确地证实酶在细胞内的活性是增强或是减弱。
本发明的细菌是大肠杆菌，其中，高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性降低。高丝氨酸合成酶，或琥珀酰高丝氨酸合成酶是催化高丝氨酸生成琥珀酰高丝氨酸的酶，是L-甲硫氨酸合成代谢途径的关键酶。二氢吡啶二羧酸合成酶是催化天冬氨酸-β-半醛生成二氢吡啶-2，6-二羧酸的酶，是L-赖氨酸合成代谢途径的关键酶。降低琥珀酰高丝氨酸合成酶和降低二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性，相应的增加了L-苏氨酸和L-异亮氨酸生成途径的代谢流，从而使L-苏氨酸和L-异亮氨酸过量积累。
在本发明的细菌中，高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶是通过化学诱变和紫外诱变的方法使其在细胞内的活性降低。使用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)和甲硫胺处理大肠杆菌，获得突变菌株，对突变株进行培养选育，并进一步对它进行紫外诱变和组成型选育。通过对选育后的突变株的发酵液离心，收集上清液，测定其苏氨酸的含量，最后将源于大肠杆菌突变株的琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶与源于大肠杆菌的野生型琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶进行氨基酸序列对比分析，发现：
琥珀酰高丝氨酸合成酶的突变包括：脯氨酸取代第61位的丝氨酸，丝氨酸取代第107位的甘氨酸，组氨酸取代第165位的丝氨酸。
二氢吡啶二羧酸合成酶的突变包括：丙氨酸取代第44位的苏氨酸，赖氨酸取代第55位的谷氨酸，组氨酸取代第65位的天冬氨酸。
本发明的细菌是大肠杆菌，其中，苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低。苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸生成α-酮基丁酸，再经过乙酰羟酸合成酶等，进一步生成L-异亮氨酸。苏氨酸脱氨酶是大肠杆菌中L-苏氨酸的分解酶，它的编码基因是tdc。如果上述合成途径不切断，只能导致异亮氨酸的积累，而苏氨酸的含量不高。
苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低可通过Red同源重组技术敲除苏氨酸脱氨酶基因实现。Red同源重组技术作为一种新型基因打靶技术，可用于构建具有特定突变的基因工程菌，以改变生物代谢途径。Red同源重组技术是将一段携带与靶基因两翼各有40-60bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用入噬菌体Red重组酶(EXO，Beta，Gam三种蛋白)的作用，使线性DNA片段与染色体的特定靶序列进行同源重组，使靶基因被线性DNA片段置换下来。
在本发明的细菌中，通过Red同源重组技术敲除苏氨酸脱氨酶的基因或已知CadA基因，构建苏氨酸脱氨酶基因缺陷株(异亮氨酸缺陷的大肠杆菌菌株)，从而使苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低。在本发明的细菌中，利用代谢工程技术构建苏氨酸脱氨酶基因缺陷株(异亮氨酸缺陷的大肠杆菌菌株)，有望降低L-苏氨酸的分解，积累L-苏氨酸，促进菌体生长。运用PCR技术，扩增出两翼与苏氨酸脱氨酶基因的上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化，将外源DNA片段分别转入大肠杆菌(K16P2)中。在Red重组酶的作用下，外源DNA片段与染色体上同源区域重组，将苏氨酸脱氨酶基因敲除，获得苏氨酸脱氨酶基因缺陷株(K16P3)(异亮氨酸缺陷的大肠杆菌菌株)。
增加酶的细胞内活性的方法包括以下方法，以及这些方法的任意组合，但并不局限于这些方法。
常用于增加细胞内活性的方法是提高所述酶的表达量的方法。具体地讲，提高酶表达量的方法包括以下方法：
(1)导入含有酶基因的质粒
作为质粒，是可以使用且能在大肠杆菌细胞中自主复制的载体，可以用公知方法将其导入。就是说，可以将目的(感兴趣的)基因插入所述载体，并且可以用该转载体转化大肠杆菌。该载体优选是多拷贝型质粒。所述目的基因可以由相同质粒或不同质粒携带，某些基因可以由相同质粒携带，导入所述基因的顺序没有特别限制。
(2)增加染色体上酶基因的拷贝数量
通过用Mu噬菌体等扩增染色体的DNA，增加所述拷贝数量。染色体DNA上的DNA可以是大肠杆菌原来就有的，或是通过使用转导，转座子(BergiD，E.和Burgc，M，生物技术，1，417(1983))(日本专利申请后期公开No.2-109985)的方法，或同源重组方法插入宿主微生物染色体中。
(3)改变酶基因的启动子序列
可以改变启动子序列，以便提高转录量，并进而提高表达量。例如，可以通过将一个突变导入启动子中来增强该启动子，以便提高位于该启动子下游的基因的转录量。除了将突变导入所述启动子之外，可以导入新的能在大肠杆菌中起作用的启动子，如lac、trp、tac、trc和PL。另外，可以通过导入新的增强子以提高基因的转录量。尽管所述启动子序列可以是染色体上酶基因的启动子或质粒上酶基因的启动子，但是优选染色体上酶基因的启动子。例如日本专利申请后期公开No.1-215280中披露了将诸如启动子的基因导入染色体DNA的方法。
本发明优选上述第一种导入含有酶基因质粒的方法。在本发明的细菌中，通过增加染色体外质粒的表达量，来增强天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶，苏氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶的细胞内活性。
对上述酶基因的来源没有特别限制，因此，各种来源的都可以使用，只要该基因能够在大肠杆菌中表达，并且其遗传产物能在大肠杆菌中起作用就行。
另外，作为提高酶比活性的方法，还包括导入具有增强比活性的突变的酶，包括去除其反馈抑制作用的酶等。在这里，“去除反馈抑制作用”表示对抑制作用大体上减弱，而不是要对抑制完全脱敏，只要反馈抑制作用程度低于源于大肠杆菌的野生酶的程度就行。而不论它是该生物的野生型或突变型酶。可以用公知的方法评估反馈抑制作用的程度。如披露于国际公开号WO95/16042中的实施例1和实施例2中的方法。
天冬氨酸激酶(以下简称为AK)是一种将天冬氨酸转化成β-磷酸天冬氨酸的酶，它是天冬氨酸及其衍生氨基酸生物合成途径的主要调节部位。大肠杆菌有三种类型的AK(AK I、AK II、AKIII)，前两种具有高丝氨酸脱氢酶(以下有时简称为HD)活性的双功能酶，一种是由thrA基因编码的AK I-HD I，另一种是由MetL(M)基因编码的AK II-HD II。
只有AKIII是单功能酶，它是称为lysC的基因的产物，并已知受赖氨酸的阻遏和反馈抑制。另一方面，AK I受苏氨酸和异亮氨酸的协同阻遏，并受苏氨酸抑制，而AK II则受甲硫氨酸阻遏。其细胞内活性的比例约为AK I∶AK II∶AKIII＝5∶1∶4。
本发明所述的大肠杆菌变体，其中还包括天冬氨酸激酶的细胞内活性增强。
在本发明的细菌中，通过改造与苏氨酸的结合位点，去除天冬氨酸激酶I(AK I)的L-苏氨酸的反馈抑制作用和通过改造与赖氨酸的结合位点，去除天冬氨酸激酶III(AKIII)的L-赖氨酸的反馈抑制作用，以增强天冬氨酸激酶的细胞内活性。
去除对天冬氨酸激酶I(AK I)L-苏氨酸反馈抑制作用的突变包括：用另一种氨基酸，优选甘氨酸取代第109位上的丝氨酸，用另一种氨基酸，优选丙氨酸取代第163位上的丝氨酸。
进行以上改性后得到的本发明所述的大肠杆菌变体，是大肠杆菌BL1126P。
去除对天冬氨酸激酶III(AKIII)L-赖氨酸反馈抑制作用的突变包括：用另一种氨基酸，优选天冬氨酸取代第330位上的甘氨酸，用另一种氨基酸，优选甘氨酸取代第400位上的半胱氨酸，用另一种氨基酸，优选天冬氨酸取代第403位上的甘氨酸。
进行以上改性后得到的本发明所述的大肠杆菌变体，是大肠杆菌BL2125P。
众所周知的是，在种之间或菌株之间可能存在不影响其活性的氨基酸序列差异，并且，本领域技术人员会很容易地识别于上述特定氨基酸残基。
用于DNA体外诱变处理的制剂的例子包括羟胺等，羟胺是通过将胞嘧啶变成N4-羟基胞嘧啶，导致胞嘧啶被胸腺嘧啶取代的化学诱变处理剂。当对微生物本身进行诱变处理时，是用紫外线辐射或常用于诱变的诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)以及上面提到硫酸二乙酯(DES)、甲硫胺和亚硝等诱变剂进行。
我们可以用以下方法获得编码去除苏氨酸、赖氨酸的反馈抑制作用的突变型AK I、AKIII的DNA。例如，对含有野生型AK I、AKIII的基因或具有突变的其它AK I、AKIII基因的DNA进行体外诱变处理，并将经过诱变处理的DNA与和宿主兼容的载体DNA连接，制备重组DNA。将重组的DNA导入宿主微生物中，筛选能表达突变型AK I、AKIII的转化体，这样的转化体具有突变型AK I、AKIII的基因。或者，可以将含有野生型AK I、AKIII基因或具有突变的其它AK I、AKIII基因的DNA与宿主兼容的载体DNA连接，以便制备重组DNA。然后，对重组DNA进行体外诱变处理，并且将其导入宿主微生物中，筛选能表达突变型AK I、AKIII的转化体，这样的转化体同样具有该突变型基因。
另外，在本发明的大肠杆菌中，研究人员优先选用下列方法：对产生野生型天冬氨酸激酶的微生物进行诱变处理，获得能产生去除对L-苏氨酸、L-赖氨酸反馈抑制作用的天冬氨酸激酶的突变菌株，然后，从该突变菌株中获得去除对L-苏氨酸、L-赖氨酸反馈抑制作用的天冬氨酸激酶的突变型基因。之后，将突变型AK I、AKIII基因的DNA和宿主兼容的载体DNA连接，制备重组DNA，然后将其导入宿主微生物中，筛选能表达突变型AK I、AKIII的转化体，这样的转化体具有该突变型基因。
由于基因工程菌中外源基因的表达，含有重组质粒的细胞会需要更多的氧，从而可能会改变细胞的能量代谢，而不利于细胞的生长(Khoravi，M，Ryanw，webter，D，A等等，质粒，1990，23：138-143)在大规模高密度的发酵中，细胞大量生长造成溶解氧浓度急剧下降。因此，提高设备通氧条件，使细胞处于有氧呼吸状态，成为基因工程菌发酵中关键问题之一。现有的改进方法主要是提高搅拌速度，增加通气量，加入助溶剂，提高气液传质系数等等，但效果有限，并且会大大增加生产成本。
本发明的细菌是大肠杆菌，通过宿主菌中引入细菌血红蛋白基因，使其在宿主中表达，提高大肠杆菌基因工程菌的氧传递体系，增加氧传递量。透明颤菌是一种生长于贫氧环境中的专性好氧革兰氏阴性细菌，能诱导合成一种血红蛋白，透明颤菌血红蛋白(Vitreocilla，Hemoglobin，VHb)是一种氧结合蛋白，这种蛋白的同源二聚体对氧的亲和力与真核生物相近，有很高的氧解离常数，具有很强的氧传输能力，尤其是它自身基因的启动子在贫氧条件下能大量有效地启动该基因表达，可提高发酵液中氧的传递速度，从而促进细胞生长和蛋白质的合成。Vgb在大肠杆菌的表达能增加电子传递数目，跨膜pH值和ATP合成速率。
在本发明中，将透明颤菌中血红蛋白基因(Vgb)插入质粒PT5，构建含有Vgb基因的克隆的质粒PT6(参见实施例8)，然后转入大肠杆菌中。
本发明所述的大肠杆菌变体中进一步包括天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸激酶中的至少一种酶的细胞内活性增强。其中所述细胞内酶活性的增强是通过增加质粒表达量而提高其细胞内活性。
本发明所述的大肠杆菌变体中进一步导入了血红蛋白基因，所述的血红蛋白基因来源于透明颤菌的血红蛋白基因。
在本发明的细菌中，高丝氨酸合成酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和苏氨酸脱氨酶分别源于大肠杆菌，血红蛋白酶源于透明颤菌。
经过以上改性的本发明的大肠杆菌变体是基因工程菌K21P3。
本发明的另一目的是提供生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在在合适的培养基中培养本发明的大肠杆菌，并在其培养基中产生和聚集L-苏氨酸，并从中收集L-苏氨酸。所使用的各种培养基可选用苏氨酸生产中常规使用的各种培养基，例如使用下述配方的培养基：
1、斜面培养基(g/l)
葡萄糖2.0，NH₄Cl 1.0，KH₂PO₄ 1.5，Na₂HPO₄ 3.5，MgSO₄·7H2O0.1，琼脂20.0，加蒸馏水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，0.8Kg/cm2灭菌30分钟，冷却至50℃左右加入氨苄青霉素溶液，最终浓度为50γ/ml。
2、摇瓶种子培养基(g/l)
葡萄糖40.0，KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，(NH₄)₂SO₄ 10.0，玉米浆2.0，CaCO₃ 15，氨苄青霉素50γ/ml，加双蒸水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8Kg/cm2灭菌30分钟，接种前加入CaCO₃(121℃，60分钟灭菌，烘干)和氨苄青霉素。
3、摇瓶发酵培养基(g/l)
葡萄糖80.0，(NH₄)₂SO₄ 25.0，KH₂PO₄ 2.0，MgSO₄·7H₂O 1.0，MnSO₄·5H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.5，CaCO₃ 30.0，加自来水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8Kg/cm2灭菌30分钟，接种前加入CaCO3(121℃，60分钟灭菌，烘干)
4、种子罐培养基
葡萄糖4％，(NH₄)₂SO₄ 1％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，玉米浆0.2％，泡敌0.01％。加水溶解pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容400L。接种前加入无菌氨苄青霉素50ug/L。
5、发酵罐培养基
葡萄糖8％，(NH₄)₂SO₄ 2.5％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，FeSO₄·5H₂O 0.05％，MnSO₄·5H₂O 0.05％，泡敌0.01％。加自来水溶解pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容5.1M3。1.0Kg/cm²灭菌20分钟。
本发明方法中所使用的细菌是经过下述改性的大肠杆菌：(1)琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；(2)苏氨酸脱氨酶细胞内活性降低；(3)天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶，苏氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶细胞内活性增强；和/或(4)导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因。其中所述的高丝氨酸合成酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和苏氨酸脱氨酶分别源于大肠杆菌。
本发明的方法中，优选的大肠杆菌优选是具有上述所有改性的大肠杆菌；最优选的大肠杆菌是基因工程菌(K21P3)。
优选的，本发明提供了一种生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在在上述合适的培养基中培养经过上述改性和导入血红蛋白基因后得到的基因工程菌(K21P3)，在其培养基中产生和聚集L-苏氨酸，并从中收集L-苏氨酸。更优选的，所述的培养在有氧条件下进行36～60小时；培养期间将温度控制在37℃左右；pH值控制在6～8之间，可使用无机或有机酸或碱性物质以及氧气调节pH。
应用本发明的新的基因工程菌，可通过多种途径优化发酵培养过程中L-苏氨酸的生成和聚集，提高L-苏氨酸的产量。
除此之外，本发明的方法的还有以下有益效果：
1、原始菌株在经过基因工程改造后，除在L-苏氨酸代谢途径上有少量变化之外，其它生理特征不变，因此不影响菌株的发酵。
2、本发明的基因工程菌株的天冬氨酸激酶I不受苏氨酸反馈抑制，因此在L-苏氨酸合成过程中，细菌生长和L-苏氨酸代谢不受影响。
3、本发明的基因工程菌株为异亮氨酸缺陷菌株，异亮氨酸合成是以L-苏氨酸合成为前体，因此，异亮氨酸缺陷可以使L-苏氨酸大量累积。
4、本发明的基因工程菌在一定浓度抗生素下正常生长，其中的质粒保持稳定。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步地说明，但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。其中涉及没有说明单位的百分比浓度时，所述的浓度单位是指每100ml溶液中的溶质克数。
实施例1：高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶弱化菌株的筛选
用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺处理经过筛选的广谱碳源大肠杆菌菌株(K16)，获得突变菌K16P1菌株。
配置pH7.0的磷酸缓冲液100ml灭菌，将经过筛选的广谱碳源大肠杆菌菌种(K16)(本菌由本实验室保存)(该菌种是已知的，可由市场上买到)在肉汤培养基中培养20h，然后取浓度约为2.5×10⁸的培养菌液用生理盐水离心洗涤两次，用玻璃珠振荡约20min，再用摇瓶机振荡20min，使之均匀分散。菌液用磷酸缓冲液配制。诱变试剂用0.8％-1％(g/100ml)的硫酸二乙酯(DES)溶液5ml，配制方法是先加少量乙醇溶解，然后加入磷酸缓冲液混匀。甲酰胺试剂的浓度是70％，其制法与上述方法相似。取菌液和试剂溶液各2.5ml，37℃摇瓶机振荡30min，。处理后的菌液用2％Na₂S₂O₃终止反应，稀释后涂布平皿，再用分离筛选用培养基分离培养，所用培养基如下：葡萄糖150g/l，蛋白胨10g/l.(NH₄)₂SO₄35g/l，KH₂PO₄ 1.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，CaCO₃ 30g/l，pH7.0，获得突变菌K16P1菌株。
对该突变株进行培养选育，并进一步对它进行紫外诱变：吸取4-5ml菌悬液，放入平皿，皿内菌液厚度不要超过2mm，将皿置于距灯管30cm下照射，磁力搅拌器的转速为100r/min，诱变时间5min，吸0.1ml照射后悬液加入肉汁胨平板，摇匀。培养组成型突变株的选育是将紫外线诱变后的菌株用两种培养基，即肉汁胨培养基和含桔皮粉的筛选用培养基交替培养的方法，反复交换培养3次，从群体中选育组成型突变株。由此可获得选育后菌株K16P2。
将所获得的菌株K16P2在上述液体摇瓶发酵培养基中，按所述培养条件进行培养，同时，将未诱变处理的菌株K16也在同样的培养基中作为对照培养，积累L-苏氨酸，按照常规方法从培养基中收集苏氨酸，并且比较大肠杆菌K16和K16P2菌株的L-苏氨酸的产量。
表1

实施例2：构建大肠杆菌K16P3
根据大肠杆菌的苏氨基酸脱氢酶基因，设计下列PCR引物：
ILVAP1：5’-ATGGCTGACTCGCAACCCCTGTCCGGTGCTCCGGAAGGTGTCAGTGGAACTCCGTCG--3’(SEQ ID NO：1)，
ILVAP2：5’-CTAACCCGCCAAAAAGAACCTGAACGCCGGGTTATTGGTTTGTAAAACGTCCGAAGGCC--3’(SEQ ID NO：2)
其中ILVAP1，ILVAP2靠近5’端的区域与苏氨酸脱氨酶基因的两翼序列同源，ILVAP1，ILVAP2靠近3’端的区域与质粒PKF3上Cat基因两侧序列互补，以质粒PKF3(含有氯霉素抗性基因Cat基因)(军事医学科学院生物工程研究所惠赠，为已知菌，可从大连宝生物工程公司可以购买到)为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件是：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min.，16℃，30min.。PCR扩增出两翼与苏氨酸脱氨酶基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因的1.1kbDNA片段。
挑取大肠杆菌K16P2/pKD46的单菌落，接种于新鲜LB培养基(含有终浓度为50ug/ml的氨苄青霉素)中，30℃振荡过夜培养，然后转接于50mLLB培养基中，继续培养至A₆₀₀＝0.2-0.3。向培养基中加入L-阿拉伯糖，终浓度为1mmol/l，继续培养至A₆₀₀＝0.5-0.6。将菌液置于冰浴中15-20分钟，于4℃，5000×g离心10分钟。用经过灭菌的10％甘油洗涤菌体3次，将菌体重悬于0.5mL10％甘油中，制成感受态细胞。移取上述PCR产物5ul与感受态细胞100ul混合，电击(电击参数25μF，200，2.5kv)后加入1ml预冷的LB培养基，30℃培养1小时。移取200μl菌液涂布于含有氨苄青霉素(终浓度为50ug/ml)和氯霉素(终浓度为50ug/ml)的LB平板上，30℃培养，筛选阳性转化子。上述经PCR扩增的DNA片段转入大肠杆菌K16P2菌株后，在Red重组酶的作用下，DNA片段与染色体上的同源区域重组，敲除了苏氨酸脱氨酶基因，得到苏氨酸脱氨酶基因缺陷的阳性菌株K16P3。
将上述获得的重组大肠杆菌K16P3在上述培养基培养，同时，将未将苏氨酸脱氨酶基因敲除的菌株K16P2也在同样的培养基中作为对照培养，积累L-苏氨酸，从培养中收集L-苏氨酸，并且比较大肠杆菌K16P3和K16P2的L-苏氨酸的产量(表2)
表2

实施例3：构建pT1质粒
构建pT1质粒，用于构建质粒载体。
以pBR322质粒(购自大连宝生物工程公司)为模板，用FP2(SEQID NO：3)、RP2(SEQ ID NO：4)为引物，及Pfu酶进行PCR扩增(PCR的反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃，10min)，获得2583bp的基因片段。再以上述扩增的片段为模板，用FP1(SEQ ID NO：5)、RP1(SEQ ID NO：6)为引物，及EXTaq酶进行PCR扩增(PCR的反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环72℃，10min)，获得2607bp的基因片段。将该2607bp的基因片段连到载体pGEM-T(购自大连宝生物工程公司)中，形成质粒pGEM-TPL1。用EcoR I酶切pGEM-TPL1，回收2601bp片段，用T₄ DNA连接酶环化此片段，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，获得pT1质粒，该质粒含有EcoRI KpnI BamHI HindIII NcolI EcoR I酶切位点。
实施例4：构建大肠杆菌K17P3
根据大肠杆菌天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)的已知核苷酸序列，设计并制备出两种类型的寡核苷酸引物ASDF1(SQE ID NO：7)和ASDR1(SQE ID NO：8)；ASDF2(SQE ID NO：9)和ASDR2(SQE ID NO：10)。以ASDF1、ASDR1为引物，以pGEMT-UPM质粒(由本实验室保存。该质粒是已知的，可由市场上买到。所述的pGEMT是已知载体，可在市场上买到；UPM是含有79个碱基的启动子)为模板，进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环72℃，10min.)；以ASDF2、ASDR2为引物，用pfu酶对K型，即普通型大肠杆菌DNA进行扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min.)。以上述两种PCR产物各1μl为模板，以ASDF1、ASDR1为引物，用ExTaq酶进行扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min)，回收1195bp的扩增片段，连接到载体pGEM-T中，转化大肠杆菌DH5α，提取并纯化质粒。将该质粒用BamH I酶切，并与同样用BamH I酶切的pT 1质粒连接，获得重组质粒pT 2。
将所获得的重组质粒(是pT2)转化实施例3中的大肠杆菌K16P3，获得大肠杆菌K17P3。在基本培养基中培养(培养基：胰化蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCl 1g/100ml，琼脂1.5-2g/100ml。培养条件：pH7.0，0.1Mpa 20分钟)，同时将未导入质粒pT2的K16P3菌株也在同样的培养基中作为对照培养，积累L-苏氨酸，从培养物收集L-苏氨酸，并且比较大肠杆菌K16P3和K17P3的L-苏氨酸的产量(表3)。
表3

大肠杆菌K17P3(asd)由于转入了含有天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)的质粒pT 2，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因在启动子的作用下进行复制，增加了大肠杆菌中的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因的拷贝数量，从而使L-苏氨酸的产率得到提高。
实施例5：构建大肠杆菌K18P3
按照与实施例1类似的方法，用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺处理大肠杆菌菌株BL1126(该菌种是已知的，可由市场上买到。由本实验室保存。)，对突变株进行培养选育，并进一步对它进行紫外诱变和组成型选育。
配置pH7.0的磷酸缓冲液100ml灭菌，将经过筛选的广谱碳源大肠杆菌菌种(K16)(本菌由本实验室保存)在肉汤培养基中培养20h，然后取浓度约为2.5×10⁸的培养菌液用生理盐水离心洗涤两次，用玻璃珠振荡约20min，再用摇瓶机振荡20min，使之均匀分散。菌液用磷酸缓冲液配制，诱变试剂用浓度为0.8％-1％的硫酸二乙酯(DES)溶液5ml，配制方法是先加少量乙醇溶解，然后加入磷酸缓冲液混匀。甲酰胺(70％)试剂的制法与此相似，取菌液和试剂溶液各2.5ml，37℃摇瓶机振荡30min。处理后的菌液用2％Na₂S₂O₃终止反应，稀释后涂布平皿，再在分离筛选用培养基中分离培养，使用如下的培养基：葡萄糖150g/l，蛋白胨10g/l.(NH₄)₂SO₄35g/l，KH₂PO₄ 1.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，CaCO₃30g/l.PH 7.0))，获得突变菌K16P1菌株。
对突变株进行培养选育，并进一步对它进行紫外诱变，吸取4-5ml菌悬液，放入平皿，皿内菌液厚度不要超过2mm，将皿置于距灯管30cm下照射，磁力搅拌器的转速为100r/min，诱变时间5min，吸0.1ml照射后悬液加入肉汁胨平板，摇匀。培养组成型突变株的选育是将紫外线诱变后的菌株用两种培养基，即肉汁胨培养基和含桔皮粉的筛选用培养基交替培养的方法，反复交换培养3次，从群体中选育组成型突变株，筛选积累苏氨酸产量多或对苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I的菌株。经过筛选，获得突变菌株BL1126P，该菌种具有对苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I(该菌种的保藏号为：CGMCC No：2369，保存日期：2008年1月28日)。
根据大肠杆菌苏氨酸操纵子的已知核苷酸序列，设计并制备出两种类型的寡核苷酸引物THRF1(SQE ID NO：11)、THRR1(SQE ID NO：12)；THRF2(SQE ID NO：13)、THRR2(SQE ID NO：14)。以THRF1、THRR1为引物，以pGEMT-UPM质粒(由本实验室保存。pGEMT是已知载体，在市场上可以购买；UPM是含有79个碱基的启动子)为模板进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min)；以THRF2、THRR2为引物，以上述大肠杆菌BL1126P的DNA为模板进行扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，72℃，10min)。以上述两个PCR产物各1μl为模板，以THRF1、THRR1为引物，用ExTaq进行扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，30个循环，72℃，10min)。回收4775bp的扩增片段，连接到载体pGEM-T(购自大连宝生物工程公司)中，转化大肠杆菌DH5α并提取和纯化所获得的质粒。将所获得的质粒用HindIII酶切，并与同样用HindIII酶切的pT 2质粒连接，获得重组质粒pT3(其中含有对苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I)。
将所获得的重组质粒pT3转化实施例4中的大肠杆菌K17P3，得到大肠杆菌K18P3。在基本培养基中培养(胰化蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCl 1g/100ml，琼脂1.5-2g/100ml。条件：pH7.0，0.1Mpa 20分钟)，同时将未导入质粒pT3的大肠杆菌K17P3菌株和实施例3中的K16P3菌株也在同样的培养基中作为对照培养，积累L-苏氨酸，从培养物中收集L-苏氨酸，并且比较大肠杆菌K16P3、K17P3和K18P3的L-苏氨酸的产量(表4)。
表4

大肠杆菌K18P3(asd ThrA^*+thrB+ThrC)由于转入了质粒pT3，而质粒pT3上连接了天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)和对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因(ThrA^*)、高丝氨酸激酶基因(ThrB)和苏氨酸合成酶基因(ThrC)。因此，通过pT3质粒的复制，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因和对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因、高丝氨酸激酶基因和苏氨酸合成酶基因得到增强，拷贝数量增加，从而而使L-苏氨酸的产率得到提高。
实施例6：构建大肠杆菌K19P3
按照与实施例1类似地方法，用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺处理大肠杆菌菌株BL2125((该菌种是已知的，可由市场上买到，由本实验室保存)，对突变株进行培养选育并进一步对它进行紫外诱变和组成型选育。
配置pH7.0的磷酸缓冲液100ml灭菌，将经过筛选的广谱碳源大肠杆菌菌种(K16)(本菌由本实验室保存)在肉汤培养基中培养20h，然后取浓度约为2.5×10⁸的培养菌液用生理盐水离心洗涤两次，用玻璃珠振荡约20min，再用摇瓶机振荡20min，使之均匀分散。菌液用磷酸缓冲液配制，诱变试剂用0.8％-1％(g/100ml)硫酸二乙酯(DES)溶液5ml，先加少量乙醇溶解，然后加入磷酸缓冲液混匀。甲酰胺试剂70％的制法与此相似，取菌液和试剂溶液各2.5ml，37℃摇瓶机振荡30min，处理后的菌液用2％Na₂S₂O₃终止反应，稀释后涂布平皿，再在分离筛选用培养基分离培养，使用下述培养基：葡萄糖150g/l，蛋白胨10g/l.(NH₄)₂SO₄35g/l，KH₂PO₄1.0g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，CaCO₃30g/l.PH 7.0)，获得突变菌K16P1菌株，并进一步对它进行紫外诱变，吸取4-5ml菌悬液，放入平皿，皿内菌液厚度不要超过2mm，将皿置于距灯管30cm下照射，磁力搅拌器的转速为100r/min，诱变时间5min，吸0.1ml照射后悬液加入肉汁胨平板，摇匀。培养组成型突变株的选育是将紫外线诱变后的菌株用两种培养基，即肉汁胨培养基和含桔皮粉的筛选用培养基交替培养的方法，反复交换培养3次，从群体中选育组成型突变株，筛选积累赖氨酸产量多或对赖氨酸不敏感的天冬氨酸激酶III的菌株，获得突变得大肠杆菌BL2125P(对赖氨酸不敏感的天冬氨酸激酶III的菌株)，该菌种的保藏号是：CGMCC No：2367保存日期：2008年1月28日。
根据对L-赖氨酸不敏感的天冬氨酸激酶III基因(lysC^*)的已知核苷酸序列，设计并制备出两种类型的寡核苷酸引物LYSCF1(SQE IDNO：15)和LYSCR1(SQE ID NO：16)；LYSCF2(SQE ID NO：17)和LYSCR2(SQEID NO：18)。以LYSCF1、LYSCR1为引物，以pGEMT-UPM质粒(含有79碱基的启动子UPM)(由本实验室保存，pGEMT是已知载体，在市场上可以购买；UPM是含有79个碱基的启动子.)为模板进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min)；以LYSCF2、LYSCR2为引物，以上述对赖氨酸不敏感的大肠杆菌BL2125P的DNA为模板进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min)，议上述两种PCR产物各1μl为模板，以LYSCF1、LYSCR1为引物，用ExTaq进行PCR扩增(扩增条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃，10min)。回收1441bp扩增片段，连接到载体pGEM-T(该质粒购自大连宝生物工程公司)中，转化大肠杆菌DH5α，提取并纯化质粒。将所获得的质粒用Ncol I酶切，并与同样用Ncol I酶切的pT3质粒连接，获得重组质粒pT4。
将所获得的重组质粒pT4转化实施例5中的大肠杆菌K18P3，得到K19P3菌株。在基本培养基中培养(胰化蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCl 1g/100ml，琼脂1.5-2g/100ml。条件：pH7.0，0.1Mpa 20分钟)，同时将未导入pT4的大肠杆菌K18P3、K16P3和K17P3也在同样的培养基中作为对照培养，积累L-苏氨酸，从培养物中收集L-苏氨酸，并且比较它们的L-苏氨酸的产量(表5)
表5

大肠杆菌K19P3(asd ThrA^*+thrB+ThrC lysC^*)由于转入了质粒pT4，而质粒pT4上连接了天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)、对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因(ThrA^*)、高丝氨酸激酶基因(ThrB)、苏氨酸合成酶基因(ThrC)以及对L-赖氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因(lysC^*)。因此，通过pT4质粒的复制，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因、对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因、高丝氨酸激酶基因、苏氨酸合成酶基因以及对L-赖氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因得到增强，基因的拷贝数量增加，从而使L-苏氨酸的产率得到提高。
实施例7：制备大肠杆菌K20P3
根据大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(ppc)的已知核苷酸序列，设计并制备出两种类型的寡核苷酸引物PCKF1(SQE ID NO：19)和PCKR1(SQE ID NO：20)；PCKF2(SQE ID NO：21)和PCKR2(SQE ID NO：22)。以PCKF1和PCKR1为引物，以pGEMT-UPM质粒(含有79碱基的启动子UPM)(由本实验室保存pGEMT是已知载体，在市场上可以购买UPM是含有79个碱基的启动子.)为模板进行PCR扩增(PCR扩增条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min)；以PCKF2和PCKR2为引物，以普通大肠杆菌BW3110DNA A进行PCR扩增(反应条件：94变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min)。以上述两种P C R产物各1μl为模板，以PCKF1和PCKR1为引物，用ExTaq进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min10s，30个循环，72℃，10min)。回收1714bp的扩增片段，连接到载体pGEM-T(该质粒购自大连宝生物工程公司)中，转化大肠杆菌DH5α，提取并纯化质粒。对所获的质粒用EcoR I酶切，并与同样用EcoR I酶切的pT4质粒连接，获得重组质粒pT5。
将所获得的重组质粒pT5转化实施例6中的大肠杆菌K19P3，得到K20P3菌株。在基本培养基中培养(胰化蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCl 1g/100ml，琼脂1.5-2g/100ml。条件：pH7.0，0.1Mpa，20分钟)，同时将未导入pT5的K19P3、K16P3、K17P3和K18P3菌株也在同样的培养基中作为对照培养，积累L-苏氨酸，从培养物中收集L-苏氨酸，并比较L-苏氨酸的产量(表6)。
表6

大肠杆菌K20P3(asd ThrA^*+thrB+ThrC lysC^*ppc)由于转入了质粒pT5，而质粒pT5上连接了天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)、对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因(ThrA^*)+高丝氨酸激酶基因(ThrB)、苏氨酸合成酶基因(ThrC)、对L-赖氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因(lysC^*)和大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(ppc)，通过质粒pT5的复制，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因、对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因、高丝氨酸激酶基因、苏氨酸合成酶基因、对L-赖氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因和大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因得到增强，基因的拷贝数量增加，从而使L-苏氨酸的产率得到提高。
实施例8：制备大肠杆菌K21P3
根据对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的已知核苷酸序列，设计并制备出两种类型的寡核苷酸引物VGBF1(SQE ID NO：23)和VGBR1(SQE IDNO：24)；VGBF2(SQE ID NO：25)和VGBR2(SQE ID NO：26)。以VGBF1和VGBR1为引物，以pGEMT-UPM质粒(含有79碱基的启动子UPM)(质粒的来源)为模板进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环72℃，10min.)；以VGBF2和VGBR2为引物，用pfu酶对透明颤菌DNA(该菌种是已知的，由北京大学农业分子生物学实验室惠赠)进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min10s，30个循环，72℃，10min，在16℃保温)。以上述两个PCR产物各1μl为模板，以VGBF1、VGBR1为引物，用ExTaq进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃，10min，在16℃保温)。回收532bp的扩增片段，连接到载体pEGM-T(购自大连宝生物工程公司)中，转化大肠杆菌DH5α，提取并纯化质粒。对所获得质粒用Kpn I酶切，并与同样用Kpn I酶切的pT5质粒连接，获得重组质粒pT6。
将所获得的重组质粒pT6转化大肠杆菌K20P3(本实验室保存，参见实施例7)，获得K21P3菌株。在基本培养基中培养(胰化蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，NaCl 1g/100ml，琼脂1.5-2g/100ml。培养条件：pH7.0，0.1Mpa 20分钟)，同时未导入质粒pT6的K20P3、K16P3、K17P3、K18P3和K19P3菌株也在同样的培养基中作为对照培养，积累L-苏氨酸，从培养物中收集L-苏氨酸，并比较它们的L-苏氨酸的产量(表7)。
表7

大肠杆菌K21P3(asd ThrA^*+thrB+ThrC lysC^* ppc vgb)由于转入了质粒pT6，而质粒pT6连接了天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)、对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因(ThrA^*)、高丝氨酸激酶基因(ThrB)、苏氨酸合成酶基因(ThrC)、对L-赖氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因(lysC^*)、大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(ppc)和透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。通过质粒pT6的复制，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因、对L-苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因、高丝氨酸激酶基因+苏氨酸合成酶基因、对L-赖氨酸不敏感天冬氨酸激酶III基因、大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因和透明颤菌血红蛋白基因得到增强，基因的拷贝数量增加，从而使L-苏氨酸的产率得到提高。
通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例描述，而不以任何形式限制本发明的保护范围。
序列表
<110>申请人长春大成实业集团有限公司
<120>应用发酵生产L-苏氨酸的方法
<160>26
<170>Patent In Version 3.0
<210>1
<211>57
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aagcttggat ccaaccctga taaatgcttc aataatattg    40
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ggatcctcac tcattaggca ccccaggc                 28
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
catttttcat atgtatatct ccttagtaca t             31
<210>9
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gagatataca tatgaaaaat gttggtttta t    31
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ggatccttac gccagttgac gaagcatc        28
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
aagctttcac tcattaggca ccccaggc        28
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<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
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acactcgcat atgtatatct ccttagtaca t    31
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<211>31
<212>DNA
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<400>13
gagatataca tatgcgagtg ttgaagttcg g    31
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aagcttttac tgatgattca tcatcaat        28
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<213>人工序列
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tctagatcac tcattaggca ccccaggc        28
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<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
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tttcagacat atgtatatct ccttagtaca t    31
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<212>DNA
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gagatataca tatgtctgaa attgttgtct c    31
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tctagattac tcaaacaaat tactatgc        28
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ggtacctcac tcattaggca ccccaggc        28
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taacgcgcat atgtatatct ccttagtaca t    31
<210>21
<211>31
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gagatataca tatgcgcgtt aacaatggtt t    31
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<213>人工序列
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ggtaccttac agtttcggac cagccgct        28
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gaattctcac tcattaggca ccccaggc        28
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<213>人工序列
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ggtctaacat atgtatatct ccttagtaca t    31
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gagatataca tatgttagac caacaaaccg t    31
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<400>26
gaattcttat tcagcgtctt gagcgtac        28