超分子有序体在检测G四链体结构DNA中的应用.pdf

本发明公开了超分子有序体在检测G-四链体结构DNA中的应用。本发明是通过检测超分子有序体聚集状态的变化来实现G-四链体结构DNA的检测。应用超分子有序体检测G-四链体结构DNA，具有简单、快捷、相对廉价的优点，克服了现有检测技术周期长、价格高昂、技术及设备要求高的缺陷。

1、  超分子有序体在检测G-四链体结构DNA中的应用。

2、  如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用是通过检测超分子有序体聚集状态的变化来实现的。

3、  如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述超分子有序体为菁染料超分子聚集体。

超分子有序体在检测G-四链体结构DNA中的应用
技术领域
本发明涉及超分子有序体在检测G-四链体结构DNA中的应用。
背景技术
单链的端粒DNA很容易通过鸟嘌呤碱基之间的氢键发生四个碱基配对，形成平面的G-四链体结构。人体端粒DNA序列d(TTAGGG)₄可以在钾离子或纳离子的作用下形成不同结构的G-四链体。在体外与体内实验中识别G-四链体结构DNA(主要是与线性的双螺旋结构DNA相区别)，对于确定G-四链体结构DNA在人体内的生理功能和抗肿瘤药物的研发等方面都有非常重要的作用。
目前，在体外和体内实验中识别G-四链体结构DNA已有一些文献报道。体内实验中识别G-四链体结构DNA较为困难，目前仍存在较大的争议。体外实验中识别G-四链体结构DNA，大都采用生物方法，最常见的是利用与G-四链体结构DNA特异性相互作用的蛋白质(主要为各种DNA酶类)。目前发现的在体外实验中能与G-四链体结构DNA特异性相互作用的蛋白质已经超过二十种(Bioessays.2007，29，155-165)。但是以纯度较高的蛋白质作为检测物，难以分离纯化，加上蛋白质活性不易保存，价格也非常昂贵，大大的限制了以上方法的使用范围。有报道采用单一荧光分子来特异性的标记G-四链体结构DNA，但是这种方法检测手段复杂，仪器要求非常高，基本上不能普及使用。如有文献报道了一种荧光染料分子分别与G-四链体结构DNA、双螺旋结构DNA结合时，表现出不同的荧光寿命(AnalyticalChemistry.2004，76，4490-4494)。
超分子有序体是数目不定的大量组分自发缔合产生某个特定的相而形成的多分子实体(Lehn，J.-M.Supramolecular chemistry：concepts andperspectives；Weinheim：VCH，1995.)。在超分子有序体中，分子间以非共价键的方式相互结合，相互作用力相对较弱。
发明内容
本发明的目的是提供超分子有序体在检测G-四链体结构DNA中的应用。
本发明提供了超分子有序体在检测G-四链体结构DNA中的应用。
所述应用是通过检测超分子有序体聚集状态的变化来实现的。
所述超分子有序体具体可为菁染料超分子聚集体。
本发明的实验证明，双链结构DNA和G-四链体结构DNA可使超分子有序体发生聚集状态的改变。由于超分子有序体是大量分子相互作用的结果，在不同聚集状态下有不同的特性，这些特性可以被各种常规检测手段所检测到。如菁染料超分子有序体在双链DNA和G-四链体结构DNA样品的作用下，表现出不同的聚集状态(单体和聚集体的比例不同)。菁染料超分子有序体的聚集状态的改变引起其荧光特性、紫外吸收特性的改变，通过检测荧光光谱、紫外吸收光谱，即可确定待测DNA是G-四链体结构DNA还是双链结构DNA。
本发明提供了超分子有序体在检测G-四链体结构DNA中的应用。应用超分子有序体检测G-四链体结构DNA，具有简单、快捷、相对廉价的优点，克服了现有检测技术周期长、价格高昂、技术及设备要求高的缺陷。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为实施例1中作为对照的检测液丙的紫外可见吸收光谱
图2为实施例1中检测液甲的紫外可见吸收光谱
图3为实施例1中检测液乙的紫外可见吸收光谱
图4为实施例1中作为对照的检测液丙的荧光光谱
图5为实施例1中检测液甲的荧光光谱
图6为实施例1中检测液乙的荧光光谱
图7为实施例2中菁染料聚集体与不同结构DNA作用后的共聚焦激光扫描荧光显微镜(CLSM)图像
具体实施方式
样本1：G-四链体结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)₄，购自英骏生物技术有限公司。将上述序列为d(TTAGGG)₄的寡聚DNA链适量溶解于磷酸缓冲液中，4℃静置24小时即可得到样本1。
样本2：线性双螺旋结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)₄/(AATCCC)₄，该样品由两条序列分别为d(TTAGGG)₄和d(AATCCC)₄的互补DNA链(均购自英骏生物技术有限公司)自行合成。将上述两条DNA链分别适量溶于磷酸缓冲液中，按摩尔比1∶1混合后置于85℃水浴中保温15分钟，缓慢冷却至室温后4℃静置24小时即可得到样本2。
样本3：：G-四链体结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)₄-NH₂，购自英骏生物技术有限公司。将上述序列为d(TTAGGG)₄-NH₂的寡聚DNA链适量溶解于磷酸缓冲液中，4℃静置24小时即可得到样本3。
样本4：线性双螺旋结构的DNA样品，序列为d(TTAGGG)₄-NH₂/(AATCCC)₄，该样品由两条序列分别为d(TTAGGG)₄-NH₂和d(AATCCC)₄的互补DNA链(均购自英骏生物技术有限公司)自行合成。将上述两条DNA链分别适量溶于磷酸缓冲液中，按摩尔比1∶1混合后置于85℃水浴中保温15分钟，缓慢冷却至室温后4℃静置24小时即可得到样本4。
以下实施例中所用的菁染料的具体制备方法如下(参见文献Hamer，F.M.TheChemistry of Heterocyclic Compounds；Interscience：New York，1964；Vol.18.及Ficken，G.E.The Chemistry of Synthetic Dyes；Academic Press：New York，1971；Vol.4.)：

以上合成路线所用原料，均可购自Sigma公司。
下面以菁染料超分子聚集体为例，阐明应用超分子有序体检测G-四链体结构DNA的具体技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、应用菁染料超分子有序体检测G-四链体结构DNA
1、制备反应液
1)溶液甲
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇(优级纯)溶液；加入60μL 200μM的样本1的磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液甲。溶液甲中，样本1DNA与菁染料的摩尔比为1.5∶1。
2)溶液乙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇(优级纯)溶液；加入60μL 200μM的样本2的磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液乙。溶液乙中，样本2DNA与菁染料的摩尔比为1.5∶1。
3)溶液丙
在2ml容量瓶中加入40μL 200.0μM的菁染料的甲醇(优级纯)溶液，用磷酸缓冲液(pH 6.0)定容，混匀，得到溶液丙，作为对照。
2、检测
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的浓度均为4μM。避光反应12小时，得到检测液甲、检测液乙和检测液丙。
1)紫外可见吸收光谱分析
将检测液进行紫外可见吸收光谱分析，测液丙的紫外可见吸收光谱见图1，检测液甲的紫外可见吸收光谱见图2，检测液乙的紫外可见吸收光谱见图3。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上只有菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)，强度为0.917；检测液甲(含有G-四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的特征峰(659.5nm)消失(小于0.01)；检测液乙(含有双链结构DNA)的吸收谱上菁染料聚集体的吸收峰(659.5nm)强度为0.755。
检测液丙(没有DNA)的吸收谱上没有出现菁染料单体的特征峰(584nm)；检测液甲(含有四链体结构DNA)的吸收谱上菁染料单体的特征峰(584nm)强度为0.1482；检测液乙(含有双链结构DNA)的吸收谱上菁染料单体的特征峰(584nm)强度为0.1165。
2)荧光光谱分析
将检测液进行荧光光谱分析，测液丙的荧光光谱见图4，检测液甲的荧光光谱见图5，检测液乙的荧光光谱见图6。
由图可见，结果如下：
检测液丙(没有DNA)的发射荧光光谱上只有菁染料聚集体的荧光发射峰(662nm)，强度为0.647，而没有菁染料单体的荧光发射峰(600nm)；检测液甲(含有G-四链体结构DNA)的荧光光谱上出现很强的菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为22.83；检测液乙(含有双链结构DNA)的荧光光谱上出现较弱的菁染料单体荧光发射峰(600nm)，强度为8.576。
3、结果分析
进行紫外可见吸收光谱分析时，当溶液中没有DNA样品时，菁染料呈聚集体状态，只有聚集体的吸收峰(659.5nm)，不会出现单体的峰(584nm)。当加入G-四链体结构DNA时，菁染料与G-四链体结构的DNA发生强烈的相互作用，菁染料超分子有序体的聚集状态发生了明显变化，由聚集体状态转为单体状态，聚集体的峰消失。当加入双链结构DNA时，菁染料超分子有序体的聚集状态变化不明显，只有少部分菁染料由聚集体状态转为单体状态，聚集体的吸收峰强度稍有下降，同时出现单体吸收峰。
进行荧光光谱分析时，当溶液中没有DNA样品时，菁染料呈聚集体状态，只有聚集体的荧光发射峰(662nm)，不会出现单体的峰(600nm)。当加入G-四链体结构DNA时，菁染料与G-四链体结构的DNA发生强烈的相互作用，菁染料超分子有序体的聚集状态发生了明显变化，由聚集体状态转为单体状态。当加入双链结构DNA时，菁染料超分子有序体的聚集状态变化不明显，只有少部分菁染料由聚集体状态转为单体状态，因此只出现较弱的单体荧光发射峰。
实施例2、应用菁染料超分子有序体检测G-四链体结构DNA
1)将样本3和样本4分别与巯基十一酸处理过的Au片反应，使DNA分别组装到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2)将处理好的Au片放入浓度为10μM的菁染料磷酸缓冲溶液(pH 6.0)中常温下避光染色1小时；
3)取出Au片后用磷酸缓冲液反复冲洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料聚集体；
4)用氮气吹干后将Au片放到共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下，用559nm的激光激发菁染料分子的荧光，并分波长的接收菁染料分子的发射荧光图像。
见图7，从CLSM荧光图像上可以很清楚的看到菁染料超分子有序体标记出了Au片表面组装有DNA样品的部分，并且能够识别出组装在Au片表面的不同结构的DNA样品。