一种无纯化步骤的异麦芽酮糖生产方法.pdf

本发明是一种无需分离纯化步骤直接浓缩结晶制备异麦芽酮糖的方法，其特点是在异麦芽酮糖制备过程中，省去了工业化生产时利用离子交换树脂分离纯化异麦芽酮糖等繁琐工艺，直接将蔗糖转化液进行真空浓缩和结晶，获得纯品异麦芽酮糖。本发明首先制备含有蔗糖异构酶活性的细胞碎片作为生物催化剂，然后催化蔗糖进行生物转化，形成不含有葡萄糖和果糖等副产品的异麦芽酮糖产物，再将该蔗糖转化液直接进行真空浓缩、结晶、干燥，即制成异麦芽酮糖结晶产品。本发明的方法，既能够能够大幅降低生产成本，又能节省大量生产用水，简化了生产工艺。

1、  一种无纯化步骤的异麦芽酮糖生产方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步、蔗糖异构酶活性细胞碎片制备：将克雷伯氏菌LSI菌由保留斜面接种到100毫升蔗糖培养基中，在30℃、150转/分条件下，于摇床内振荡培养6～8小时，按5％接种量转接于新鲜蔗糖培养基中，于30℃、150转/分振荡培养10～12小时，超声波破碎，制成蔗糖异构酶活性细胞碎片悬浮液；其中，蔗糖培养基配方中含有2％蔗糖，0.1％酵母粉，0.1％蛋白胨，0.05％硫酸镁，0.1％NaH₂PO₄，0.1％KNO₃，pH6.6；
第二步、蔗糖转化：将活性细胞碎片与10～20％蔗糖溶液按1：10的比例在转化罐中混合，在保持正压的条件下，于30℃保温6～15小时，将蔗糖转化为异麦芽酮糖，获得蔗糖转化液；
第三步、浓缩结晶：在65℃条件下，将上述步骤获得的蔗糖转化液进行真空浓缩，待糖浓度达到60～75％时，加入0.1～1％异麦芽酮糖晶种，搅拌条件下缓慢降温，使异麦芽酮糖结晶析出，得到小颗粒结晶异麦芽酮糖；
第四步、干燥：将结晶的异麦芽酮糖淋洗脱色后，干燥到含水量7～8％时，获得异麦芽酮糖结晶产品。

2、  根据权利要求1所述的一种无纯化步骤的异麦芽酮糖生产方法，其特征在于第一步所述的蔗糖异构酶是含有蔗糖异构酶活性的细胞碎片。

3、  根据权利要求1所述的一种无纯化步骤的异麦芽酮糖生产方法，其特征在于第二步所述的蔗糖转化液中不含有葡萄糖和果糖等副产物。

4、  根据权利要求1所述的一种无纯化步骤的异麦芽酮糖生产方法，其特征在于第三步所述浓缩结晶工序中不含有异麦芽酮糖分离纯化步骤。

一种无纯化步骤的异麦芽酮糖生产方法
技术领域
本发明涉及一种以蔗糖为原料制备异麦芽酮糖的生产技术，以及在异麦芽酮糖生产过程中无需分离清除葡萄糖和果糖等副产品的异麦芽酮糖生产工艺。
背景技术
异麦芽酮糖的化学名称叫α-D-吡喃葡萄糖苷-1，6-D-呋喃果糖，最早是在蜂蜜中发现的。由于其含量非常微量，因此一直未引起人们的关注。直到1957年，在甜菜制糖过程中发现并结晶出这种“新”双糖化合物——异麦芽酮糖后，异麦芽酮糖的重要性才逐渐受到人们的重视。随后，某些细菌能将蔗糖转化成异麦芽酮糖的发现，促进了异麦芽酮糖的食用性和生产可能性的大量研究。对于那些不宜摄入食糖而需要慎重选择甜味剂的特殊人群来说，异麦芽酮糖的发现无疑是一种令人振奋的幸福消息。
作为一种功能性天然甜味糖，异麦芽酮糖具有与蔗糖类似的甜味特性，它对味蕾的最初刺激速度比蔗糖快，最强的甜味刺激与蔗糖一样，终了时的甜味刺激则要比蔗糖弱。异麦芽酮糖无任何异味，其甜度是蔗糖的50％，而且不随温度变化而改变。将异麦芽酮糖应用在糖果和巧克力类食品中，没有发现它与蔗糖间存在明显的差异。异麦芽酮糖不但具有非致龋齿性，而且还能够阻止不溶性葡聚糖的生成，以防龋齿形成。由于人体本身无法消化异麦芽酮糖，只有被肠道微生物缓慢分解后才能进入血液而被人体吸收，因此，食用后在血液中释放单糖的速度比蔗糖慢且不刺激胰岛素分泌，因而有益于糖尿病的防治并可防止脂肪的过多积累。大多数细菌和酵母都不能发酵利用异麦芽酮糖，当异麦芽酮糖应用于发酵食品和饮料生产时，其抗微生物特性使产品的甜味易于保持。
异麦芽酮糖是以蔗糖为原料，经蔗糖异构酶(α-葡糖基转移酶，EC.5.4.99.11)催化反应，将蔗糖异构化为异麦芽酮糖，由蔗糖异构酶催化的蔗糖异构化反应如图1所示。在此异构化过程中，蔗糖分子中的α-1，2-糖苷键在蔗糖异构酶活性中心内首先被水解断开并转位，随后葡萄糖单体再与果糖单体形成α-1，6-或α-1，1-糖苷键，并从酶分子中脱落而产生两种蔗糖异构体，同时，断开的α-1，2-糖苷键也可以与水分子反应形成葡萄糖和果糖。因此，在蔗糖异构化过程中，除了生成α-1，6-连接的异麦芽酮糖外，也形成α-1，1-连接的胞壁糖，同时还会形成一部分非连接的葡萄糖和果糖。目前，用于异麦芽酮糖生产的蔗糖异构酶来源于各种微生物，如沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Psedumonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)和精朊杆菌属等(Protaminobacter)。美国专利4670387使用Erwinia rhapontici、Protaminobacter rubrum和Serratia plymuthica的固定化细胞生产异麦芽酮糖时，大约可以转化70～95％的蔗糖。美国专利5229276用固定化Agrobacteriumradiobacter菌生产异麦芽酮糖时，异麦芽酮糖的比例仅有10％。虽然已经发现或使用的微生物细菌能够催化蔗糖异构化产生异麦芽酮糖，但产量都很不稳定，转化率一般为8～86％，而且，产物中除了异麦芽酮糖外，还伴随有三种副产品即胞壁糖、葡萄糖和果糖的形成。不同来源的蔗糖异构酶催化生成的异麦芽酮糖等各种产物的比率不同，其中胞壁糖与异麦芽酮糖一样，是一种非致龃齿糖，产品中的胞壁糖不影响异麦芽酮糖的特殊品质，生产过程中无需考虑分离剔除。但是，这些蔗糖异构酶的转化产物中还含有2～7％的葡萄糖和果糖等副产物，严重影响异麦芽酮糖产品的质量，在后提取过程中必须要分离除去。生产过程中必须采用离子交换树脂等复杂的分离纯化过程除去这些杂质，导致生产成本大幅提高，是一个值得考虑的工业化问题。我们通过蔗糖异构酶催化反应过程的比较分析，发现蔗糖异构酶的存在形式影响蔗糖异构化产物的比率。
发明内容
本发明的目的是提供一种用简单步骤和设备生产高纯度异麦芽酮糖的有效技术，同时提供一套无需分离纯化过程直接生产异麦芽酮糖的简化生产工艺。与其他已公开的专利相比，蔗糖转化率达到99.8％，异麦芽酮糖含量高达88％，葡萄糖和果糖含量低于0.1％。按照本发明，可以以较低成本实现异麦芽酮糖的工业化生产。
本发明的具体操作步骤如下：
第一步、蔗糖异构酶活性细胞碎片制备：将克雷伯氏菌LSI菌由保存斜面接种到100毫升蔗糖培养基中，在30℃、150转/分条件下，于摇床内振荡培养6～8小时后，按5％接种量转接于新鲜蔗糖培养基中，于30℃振荡(150转/分)培养10～12小时，于6000转/分、25℃条件下离心10分钟，用蒸馏水洗涤菌体细胞3次，重新悬浮于原体积的25mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液中，并分成两部分。一部分作为完整细胞用于酶活力测定，另一部分超声波破碎，制成蔗糖异构酶活性细胞碎片。其中，蔗糖培养基配方中含有2％蔗糖，0.1％酵母粉，0.1％蛋白胨，0.05％硫酸镁，0.1％NaH₂PO₄，0.1％KNO₃，pH6.6。
得到的细胞碎片14000转/分离心10分钟，水洗3次，并重新悬浮于原体积的上述缓冲溶液中，可用于酶催化反应分析。
根据蔗糖异构酶的基因序列合成引物，以克雷伯氏菌LSI菌的基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增蔗糖异构酶基因，并在GST表达系统(GST GeneFusion System，Pharmacia)中表达蔗糖异构酶，用专用亲和层析柱分离纯化蔗糖异构酶和GST融合蔗糖异构酶。
第二步、蔗糖转化：将活性细胞碎片与10～20％蔗糖溶液以1∶10的比例在转化罐中混合，在保持正压的条件下，于30℃保温6～15小时，将蔗糖转化为异麦芽酮糖，获得蔗糖转化液；
第三步、浓缩结晶：在65℃条件下，将上述步骤获得的蔗糖转化液进行真空浓缩，待糖浓度达到60～75％时，加入0.1～1％异麦芽酮糖晶种，搅拌条件下缓慢降温，使异麦芽酮糖结晶析出，得到小颗粒结晶异麦芽酮糖；
第四步、干燥：将结晶的异麦芽酮糖淋洗脱色后，干燥到含水量7～8％时，获得异麦芽酮糖结晶产品。
蔗糖异构酶存在状态的空间效应影响酶转化产物的种类和比例。将第一步中得到的完整细胞、细胞碎片悬浮液、纯化的蔗糖异构酶和GST融合蔗糖异构酶分别与浓度为10～20％的蔗糖溶液以1∶10的比例混合，根据第二步的条件，使蔗糖转化率达到99.8％以上，得到异麦芽酮糖转化液。
如图2所示，与细胞壁酶的产物相比较，在纯酶的转化产物中，葡萄糖/果糖比例明显增加，已接近其它同类酶的比例(12.5～13％)，而胞壁糖则微有增加。当在蔗糖异构酶的N-末端联接上一个GST融合蛋白时，可能是由于GST蛋白的空间障碍作用，蔗糖转化产物中的葡萄糖/果糖比例有所降低(7％)。由此可以看出，蔗糖异构酶以细胞壁酶状态催化蔗糖转化时，产物纯度最高。
固定化细胞生产异麦芽酮糖：
向灭过菌的2.5％海藻酸钠溶液中加入15％的克雷伯氏菌LSI细胞悬浮液，混合均匀后，在无菌条件下滴加到0.65％灭菌的CaCl₂溶液中，进行固定成型，并在此溶液中放置4小时，以强化海藻酸钙固定化细胞。将固定化细胞转入含0.1％CaCl₂的蔗糖培养基(2％蔗糖，0.1％酵母粉，0.1％蛋白胨，0.05％硫酸镁，0.1％NaH₂PO₄，0.1％KNO₃，pH6.6)中，30℃振荡(150转/分)培养16小时，使固定化细胞活化。然后将活化后的固定化细胞装填于柱式反应器中，按0.5～5毫升/分的流速连续流加10～20％的蔗糖溶液，在30℃条件下进行酶转化反应，通过控制流速以调整蔗糖溶液在反应器中的停留时间，使蔗糖完全转化，收集流出液，测定异麦芽酮糖的浓度。
本发明中蔗糖异构酶活力检测方法如下：
将第一步中得到的活性细胞碎片悬浮液(0.1毫升)与0.4毫升溶解于25mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液(pH6.6)的2％(w/v)蔗糖溶液混合均匀，于30℃水浴中反应10分钟后，立即加入1.5毫升3，5-二硝基水杨酸试剂终止酶反应，并于沸水浴中加热5分钟以显色，在520纳米波长处检测吸光度，通过异麦芽酮糖标准曲线确定还原糖含量。一个蔗糖异构酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟催化蔗糖异构化形成1μmol异麦芽酮糖所需要的酶量。
本发明中异麦芽酮糖的检测可以采用薄层层析(TLC)或高效液相色谱(HPLC)方法。
薄层层析(TLC)法检测异麦芽酮糖及糖组分测定方法如下：
将蔗糖转化上清液在硅胶薄层层析板上点样后，于展开槽中展开后显色，溶剂系统为：乙酸乙酯-乙酸-水的体积比4∶3∶0.8，显色剂为本胺(4％)-二本胺(4％)-磷酸(85％)的体积比5∶5∶1，显色温度为80℃，显色时间为5分钟，异麦芽酮糖形成典型的黄绿色斑点。
为了定量分析转化液中各种糖组分的比例，在TLC层析后，分别切下硅胶板中含有异麦芽酮糖、胞壁糖和葡萄糖/果糖的组分，并用蒸馏水溶解，采用3，5-二硝基水杨酸法测定糖浓度，计算异麦芽酮糖、胞壁糖和葡萄糖的比率。
高效液相色谱(HPLC)检测异麦芽酮糖及产物比例方法如下：
采用Waters 2690系统HPLC分离异麦芽酮糖产物，层析柱为Waters糖分析专用柱(4.6×250毫米)，检测器为Waters 2410折光指数检测器，样品用70％的乙氰水溶液洗脱，洗脱液流速为1毫升/分，由含有蔗糖异构酶活性的细胞碎片催化蔗糖转化形成产物的HPLC层析谱如图3所示，根据峰面积可以计算糖含量及产物比例。
附图说明
图1、蔗糖异构酶催化蔗糖异构化反应的示意图。
图2、不同存在形式蔗糖异构酶催化蔗糖异构化产物的薄层层析图谱。
图3、蔗糖异构酶催化蔗糖转化产物的HPLC分析图谱。
具体实施方式
实施例1、转化罐分批转化生产异麦芽酮糖
将克雷伯氏菌LSI菌从保留斜面上，接种至装有蔗糖培养基(2％蔗糖，0.1％酵母粉，0.1％蛋白胨，0.05％硫酸镁，0.1％NaH₂PO₄，0.1％KNO₃，pH6.6)的三角瓶中活化培养8小时(30℃、150转/分)，按5％接种量转入装有新鲜蔗糖培养基的发酵罐中，通风培养12小时后，在发酵罐中于无菌条件下超声波破碎细胞，制成活性细胞碎片悬浮液。在10吨转化罐中，分别配制5％、10％、15％和20％蔗糖溶液，95℃灭菌20分钟后，冷却至30℃。按1∶10比例将上述活性细胞碎片悬浮液转入10吨转化罐中，30℃保温，通无菌风以维持转化罐中的正压状态。当蔗糖浓度为5％和10％时，蔗糖100％转化时间不超过6小时，15％和20％蔗糖浓度时，达到蔗糖全部转化时所需时间不超过9小时。
实施例2、固定化细胞生产异麦芽酮糖
每5毫升克雷伯氏菌LSI细菌培养液与100毫升2％海藻酸钠溶液充分混合后，用注射器滴加到0.65％(w/v)CaCl₂溶液中，并在溶液中于4℃条件下放置4小时，以强化固定化颗粒。然后将固定化细胞转入含0.1％CaCl₂的蔗糖培养基(2％蔗糖，0.1％酵母粉，0.1％蛋白胨，0.05％硫酸镁，0.1％NaH₂PO₄，0.1％KNO₃，pH6.6)中，30℃振荡(150转/分)培养过夜，以活化固定化细胞。将固定化细胞装入500毫升填充式反应器中，在30℃条件下，按不同流速流加20％的蔗糖溶液，并检测流出液中异麦芽酮糖的浓度。当蔗糖流加速度为4毫升/分时，蔗糖转化率为99.9％，流出液中异麦芽酮糖与胞壁糖和葡萄糖/果糖的浓度分别为88.0％、11.9％、0.1％。继续提高蔗糖流加速度时，蔗糖转化率逐渐降低，但产物中各种糖组分的比率没有明显改变。当流加速度为8毫升/分时，蔗糖转化率已降低到75.3％。