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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510933465.7 (22)申请日 2015.12.15 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 浙江师范大学 地址 321004 浙江省金华市婺城区迎宾大道 688 号 (72)发明人 郑荣泉 毛媛媛 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 金祺 (54) 发明名称 三角帆蚌微卫星标记及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种三角帆蚌微卫星标记， 该 三角帆蚌微卫星标记的核苷酸序列为SEQ ID NO ： 1、 或 SEQ ID NO ： 2。
2、 所述 ； 或为上述核苷酸序列的 互补序列 ； 所述 SEQ ID NO ： 1 对应微卫星位点 Hc1， 所述 SEQ ID NO ： 2 对应微卫星位点 Hc2。三 角帆蚌微卫星标记的特异性引物对为如下任一所 示 ： 微卫星位点 Hc1 特异性引物、 微卫星位点 Hc2 特异性引物。其用途为 ： 可用于检测三角帆蚌种 群遗传多样性、 分析三角帆蚌亲缘关系、 三角帆蚌 辅助育种的工具。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 CN 105420234 A 2016.03.23 CN 105420234 A 1。
3、/1 页 2 1.三角帆蚌微卫星标记， 其特征是 ： 三角帆蚌微卫星标记的核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 1、 或 SEQ ID NO ： 2 所述 ； 或为上述核苷酸序列的互补序列 ； 所述 SEQ ID NO ： 1 对应微卫星位点 Hc1， 所述 SEQ ID NO ： 2 对应微卫星位点 Hc2。 2.根据权利要求 1 所述的三角帆蚌微卫星标记， 其特征是 ： 三角帆蚌微卫星标记的特 异性引物对为如下任一所示 ： 微卫星位点 Hc1 特异性引物 ： F ： CTGCATAAGGGCACATGATTTA R ： TGTTTGCAGCTAAAATGAGG 微卫星位点 Hc2 特异性引。
4、物 ： F ： GGTTTGCCTTCTACGAAAGATG R ： CCCCAAATGTTTTTATGACCAG。 3.根据权利要求 1 或 2 所述的三角帆蚌微卫星标记的用途， 其特征是 ： 可用于检测三 角帆蚌种群遗传多样性、 分析三角帆蚌亲缘关系、 三角帆蚌辅助育种的工具。 4.根据权利要求 3 所述的三角帆蚌微卫星标记的用途， 其特征是 ： 利用引物对检测三 角帆蚌种群遗传多样性的方法包括如下步骤 ： 1)、 提取三角帆蚌外套膜基因组 DNA ； 2)、 微卫星 PCR 扩增 ： 采用微卫星位点 Hc1 特异性引物或者微卫星位点 Hc2 特异性引物， 以三角帆蚌基因组 DNA 为模板。
5、进行 PCR， 从而获得三角帆蚌个体微卫星扩增产物 ； 3)、 利用测序仪检测扩增产物 ； 4)、 遗传多样性分析 ： 根据每个三角帆蚌个体的微卫星扩增产物的分子量大小确定基 因型， 采用 CERVUS 3.0 和 POPGENE 3.2 计算遗传多样性参数。 权 利 要 求 书 CN 105420234 A 2 1/4 页 3 三角帆蚌微卫星标记及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学 DNA 标记技术领域， 具体涉及一种三角帆蚌微卫星分子标 记及其应用。 背景技术 0002 微卫星DNA， 又称为短串联重复序列或简单序列重复。 它是以1-6个碱基的短核苷 酸为基本单位首尾相连组成。
6、串联重复序列， 由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成 了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列， 再经 电泳分析， 即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛， 密度大， 多态 性丰富， 遵循孟德尔分离定律， 共显性遗传、 易于 PCR 扩增， 所需 DNA 数量极少， 对 DNA 质量 要求不高， 结果重复性好等优点， 目前已被广泛应用于遗传多样性、 亲缘关系分析、 连锁图 谱构建、 功能基因定位、 分子标记辅助育种等领域。 0003 三角帆蚌隶属于体动物门 (Mollusca)， 双壳纲 (Bivalvia)， 蚌目 (Unionida)，。
7、 蚌 科 (Unionidae)， 帆蚌属 (Hyriopsis)， 别名三角蚌、 水壳等。三角帆蚌为我国特有种， 分布 于河北、 山东、 安徽、 江苏、 浙江、 江西、 湖北和湖南等省大、 中、 小型湖泊及其周围河流内。 三 角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国最主要的淡水经济贝类之一， 也是我国主要的淡水育 珠蚌， 其每年的淡水珍珠产量占世界的 95以上。但由于过度开发、 环境污染等原因， 三角 帆蚌资源显著减少， 因此， 保护天然种质资源是开展三角帆蚌育种的基础。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种三角帆蚌微卫星标记及其扩增引物， 为三角 帆蚌的种群遗传。
8、学、 家系鉴定及分子标记辅助育种提供有效的工具。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种三角帆蚌微卫星标记， 该三角帆蚌微卫 星标记的核苷酸序列为SEQ ID NO ： 1、 或SEQ ID NO ： 2所述 ； 或为上述核苷酸序列的互补序 列 ； 0006 所述 SEQ ID NO ： 1 对应微卫星位点 Hc1， 所述 SEQ ID NO ： 2 对应微卫星位点 Hc2。 0007 作为本发明的三角帆蚌微卫星标记的改进 ： 三角帆蚌微卫星标记的特异性引物对 为如下任一所示 ： 0008 微卫星位点 Hc1 特异性引物 ： F ： CTGCATAAGGGCACATGATTTA 00。
9、09 R ： TGTTTGCAGCTAAAATGAGG 0010 微卫星位点 Hc2 特异性引物 ： F ： GGTTTGCCTTCTACGAAAGATG 0011 R ： CCCCAAATGTTTTTATGACCAG。 0012 本发明还同时提供了上述三角帆蚌微卫星标记的用途 ： 可用于检测三角帆蚌种群 遗传多样性、 分析三角帆蚌亲缘关系、 三角帆蚌辅助育种的工具 ( 即， 对三角帆蚌进行遗传 分析、 种质资源调查或辅助育种 )。 0013 作为本发明的三角帆蚌微卫星标记的用途的改进 ： 利用引物对检测三角帆蚌种群 说 明 书 CN 105420234 A 3 2/4 页 4 遗传多样性的方。
10、法包括如下步骤 ： 0014 1)、 提取三角帆蚌外套膜基因组 DNA( 可采用酚 - 氯仿法 ) ； 0015 2)、 微卫星 PCR 扩增 ： 0016 采用微卫星位点 Hc1 特异性引物或者微卫星位点 Hc2 特异性引物， 以三角帆蚌基 因组 DNA 为模板进行 PCR， 从而获得三角帆蚌个体微卫星扩增产物 ； 0017 3)、 利用测序仪检测扩增产物(具体为 ： 将扩增产物用BiopticQsep 100测序仪进 行电泳和 STR 分析 ) ； 0018 4)、 遗传多样性分析 ： 根据每个三角帆蚌个体的微卫星扩增产物的分子量大小确 定基因型， 采用 CERVUS 3.0 和 POPG。
11、ENE 3.2 计算遗传多样性参数。 0019 在本发明中， 微卫星 DNA 分子标记引物的获得方法如下 ： 0020 1)、 三角帆蚌转录组测序提取三角帆蚌外套膜的总 RNA， 经 mRNA 富集、 片段化 mRNA、 合成 cDNA、 末端修复以及加 “A” 连接工序， 建立测序文库， 采用 Illumina HiSeqTM2500 测序， 获得三角帆蚌原始序列 ； 0021 2)、 三角帆蚌 Unigene 的获得及微卫星位点的检测 ： 将转录组测序获得的原始序 列去除接头和Q值10的低质量片段序列后获得高质量序列， 高质量序列进行从头组装得 到三角帆蚌的Unigene， 然后在Unig。
12、ene序列中用软件MISA进行微卫星位点查找， 得到多个 微卫星位点 ； 0022 3)、 对筛选得到的微卫星位点用 BatchPrimer3 软件依据本发明的特定要求进行 批量引物设计， 从设计成功的引物中选取后进行多态性验证。 0023 引物对设计参数为 ： 引物长度 18-22bp， PCR 产物片段长度范围 100-300bp， 最适退 火温度 55-65， GC 含量 40 -60之间。 0024 综上所述， 本发明提供2个微卫星标记， 本发明还提供分别用于扩增上述2个微卫 星标记的引物对 ； Hc1-F和Hc1-R的引物对用于扩增核苷酸序列如SEQ ID ： 1所示的微卫星 标记 。
13、(Hc1)， Hc2-F 和 Hc2-R 的引物对用于扩增核苷酸序列如 SEQ ID ： 2 所示的微卫星标记 (Hc2)。本发明从三角帆蚌基因组 DNA 中筛选 2 个微卫星标记， 根据微卫星重复序列两端的 侧翼区设计特异性引物并进行扩增， 获得的扩增产物具有高度的多态性， 可用于三角帆蚌 的群体遗传学、 亲缘关系分析、 分子标记辅助育种等领域。 具体实施方式 0025 实施例 1、 0026 1、 含有微卫星重复单元的序列的查找 0027 从构建的三角帆蚌转录组文库的序列中用 MISA 软件进行微卫星重复单元序列的 查找 ； 参数设置为查找含有一碱基重复 10 次以上， 二碱基重复次数 6。
14、 次以上， 三、 四、 五、 六 碱基重复次数 5 次以上的序列。共筛选出 16179 个含有微卫星重复单元的序列， 并从中设 计引物进行多态性的检测。 0028 2、 微卫星引物的设计 0029 从含有微卫星重复单元的基因序列中， 选取符合引物设计的序列使用 Batch Primer 3 进行批量引物设计。主要参数设置为 ： 引物长度 18-22bp， PCR 产物片段长度范围 100-300bp， 最适退火温度 55-65， GC 含量 40 -60之间， 尽量避免二级结构的出现。 说 明 书 CN 105420234 A 4 3/4 页 5 0030 3、 对设计的引物的扩增产物进行多态。
15、性检测 ： 0031 1)、 基因组 DNA 的提取 ： 0032 采用酚 - 氯仿法提取 30 个三角帆蚌外套膜组织的基因组 DNA ； 0033 2)、 微卫星 PCR 扩增 ： 0034 用上述设计的引物扩增三角帆蚌基因组 DNA ； 反应体系 25L ： 模板 DNA 1L(10ng/L)， 正反向引物各 1L， Mix Taq 酶 12.5L， 无菌水 9.5L。 0035 PCR 反应在 S1000TMThermal Cycler 仪中进行， 扩增程序如下 ： 94预变形 4min ； 94变性 30s， 退火温度 (Hc1 引物 ： 58， Hc2 引物 ： 60.3 ) 下复性。
16、 1min， 72延伸 1min， 30 个循环 ； 最终 72延伸 10min。 0036 3)、 测序仪检测扩增产物 ： 0037 将扩增产物在BiopticQsep 100测序仪上进行电泳和STR分析以确定三角帆蚌微 卫星标记在不同个体上的等位基因大小。 0038 4)、 遗传多样性分析 ： 0039 根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型， 采用 CERVUS 3.0 和 POPGENE 3.2 计算遗传多样性参数， 从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的微卫星 标记。 0040 经过多样性检测， 本发明筛选了 2 个具有遗传多态性的微卫星标记， 其核苷酸序 列如 SEQ I。
17、D NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2 所示， 其所对应的扩增引物的信息如表 1 所示。 0041 表 1、 三角帆蚌微卫星标记及其对应的引物 0042 0043 如表 2 所示， 在 30 个三角帆蚌样本中对上述 2 个微卫星标记进行遗传多样性分析 的结果表明 ： 两个微卫星标记的等位基因数分别为 20 和 8 个， 平均等位基因数目为 14 个， 观测杂合度分别为1.000和0.3333， 期望杂合度分别为0.9390和0.7864， PIC(Polymorphic information content， 多态性信息含量)是衡量基因变异程度高低的指标， 当PIC值0.5 时， 该。
18、基因座位为高度多态性 ； 0.25 PIC 0.5 时， 为中度多态性 ； PIC 小于 0.25 时为低 度多态性， 两个微卫星标记的 PIC 值分别为 0.9184 和 0.7431， 说明这两个微卫星标记具有 高度多态性。从而证明本发明筛选的微卫星标记的引物具有遗传多态性。 0044 表 2、 2 个微卫星标记的遗传特征 (Ta ： 退火温度 ； NA ： 等位基因数目 ； HO ： 观测杂 合度 ； HE ： 期望杂合度 ； PIC ： polymorphic information content， 多态信息含量 ； P-HWE ： Hardy-Weinberg equilibriu。
19、m， 哈迪温伯格平衡检验 ) 0045 说 明 书 CN 105420234 A 5 4/4 页 6 位点片段长度Ta( )NAHOHEPICP-HWE Hc1121-17558201.00000.93900.91840.000136* Hc2191-21860.380.33330.78640.74310.000000* 0046 注 ： 表中的 * 表示显著偏离哈迪 - 温伯格平衡。 0047 因此， 本发明的微卫星标记及其扩增引物还可用于三角帆蚌遗传多样性、 亲缘关 系分析及分子标记辅助育种等领域研究。 0048 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然， 本。
20、发 明不限于以上实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 105420234 A 6 1/2 页 7 浙江师范大学 三角帆蚌微卫星标记及其应用 6 1 201 cDNA 人工序列 三角帆蚌Hyriopsis cumingii微卫星分子标记 Hc1 1 ataacttgat agacaagatg ccagaagtag ccatatacta acgttgattt ataatatgag 60 tttctgcata agggcacatg atttatagca ccgcattgtt accaatga。
21、tt tttcgtgata 120 tactaatatc atatatatgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtacct cattttagct 180 gcaaacataa gatacatttg a 201 2 240 cDNA 人工序列 三角帆蚌Hyriopsis cumingii微卫星分子标记 Hc2 2 ttccaatcct gctgccaatg agactatagg cagaagtctg aaagaccttt tggtgcatag 60 taggtttgcc ttctacgaaa gatgttgccc cttcaaatgc aatgtttaat agatgtat。
22、ga 120 ttttatgcaa actggataat ttgtaatttg aaacattaca aggctttcag aaataacaac 180 aacaacaaca acaacaacaa taataataat aattaaatag tgatgaattc aaatattctg 240 3 22 cDNA 人工序列 特异引物序列 Hc1-F 3 ctgcataagg gcacatgatt ta 22 4 20 cDNA 人工序列 序 列 表 CN 105420234 A 7 2/2 页 8 特异引物序列 Hc1-R 4 tgtttgcagc taaaatgagg 20 5 22 cDNA 人工序列 特异引物序列 Hc2-F 5 ggtttgcctt ctacgaaaga tg 22 6 22 cDNA 人工序列 特异引物序列 Hc2-R 6 ccccaaatgt ttttatgacc ag 22 序 列 表 CN 105420234 A 8 。