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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510827273.8 (22)申请日 2015.11.23 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 浙江农林大学 地址 311300 浙江省杭州市临安市锦城镇环 城北路 88 号 (72)发明人 金松恒 郑炳松 纪国存 裘玲玲 (74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理 有限公司 11340 代理人 韩洪 (54) 发明名称 一种山核桃 RCA 基因克隆的检测分析方法 (57) 摘要 本发明公开了一种山核桃 RCA 基因克隆的检 测分析方法， 其特征在于 : 包括以下步骤 。
2、； a) 序 列检索与引物设计、 b)RCA 基因中间片段扩增、 c) RCA 基因 3 端和 5 端序列的扩增、 d)CcRCA 与 CcRCAcDNA 序列特性的分析、 e)RCA 基因组序列 分析、 f) 山核桃 RCA 的系统进化树分析、 g) 不同 生长时期山核桃叶片中 RCA 表达分析， 本发明利 用 RACE 和 RT-PCR 技术， 克隆获得山核桃 2 个 RCA 基因全长， 结合生物信息学分析， 分析了在碱基序 列、 编码氨基酸序列及其他特性差异， 并通过不同 发育时期叶片的 RCA 基因表达情况探求 RCA 基因 的表达模式， 为利用基因工程手段调控 RCA 以增 加光合速。
3、率和提高抗逆性打下基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 序列表3页 附图3页 CN 105543341 A 2016.05.04 CN 105543341 A 1.一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法， 其特征在于， 包括以下步骤： a)序列检索与引物设计： 通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因， 利用 型RCA的 ORF的序列作为查询标记在山核桃基因组中进行同源匹配， 经同源基因序列比对和转录组 序列分析， 结合山核桃基因组片段检索， 设计引物为ActinFor： GCTGAACGGGAAATTGTC 。
4、Actin内参引物、 ActinRev： AGAGATGGCTGGCTGGAAGAGGActin内参引物、 Rca-abF: GACTTCGCCACTACGACCTGRca基因部分片段扩取、 Rca-adR： TTCTCCATACGACCATCACGRca基因 部分片段扩取、 3 RACE-a:GAACCACCCAATACACTGTCAACAACCAAa亚基3端特异扩增、 5 RACE- a ： CCATCCATG TTG TTG TCCAGG TCG TAG TG a 亚基5端特 异扩 增 、 3 R ACE- b ： G A A C C A C C C A A T A C A C A G 。
5、T C A A C A A C C A A b 亚 基 3 端 特 异 扩 增 、 5 R A C E - b ： C C A T C C A T G T T G T T G T C C A A G T T G T A C T G b 亚 基 5 端 特 异 扩 增 、 q P C R - a F : GTGAAGAGGGTCCAACTTGCCGAa亚基定量、 qPCR-aR： GCTCCCATCATCACTCCTCGCAGa亚基定量、 qPCR-bF： GGCAAACAGACCGCCAAGGACAb亚基定量、 qPCR-bR： TGGAAGAGCGAGTCAACCATACCCb亚 基定量、 。
6、Genome-aF:ACCTTCCATTAAAGTGCTGCGTGCa亚基基因组扩增、 Genome-aR： CCAAGGGCAGCCTCGCTCAAGTa亚基基因组扩增、 Genome-b1F:ACGAGGATGCTATTAAGAGCGGAACb 亚基基因组扩增、 Genome-b1R:GAAGTTGGATCAAAGTTCTCTGGCAb亚基基因组扩增； b)RCA基因中间片段扩增： 根据同源序列结合已有山核桃转录组， 利用PrimerPremier 5.0软件设计中间片段引物， 并以 -Actin作为内参基因， 进行PCR扩增得到产物， 经1琼脂 糖凝胶电泳可见550bp目的条带； c)R。
7、CA基因3 端和5 端序列的扩增： 根据中间片段测序结果分别设计 和 RACE引物， 以 3 端反转录cDNA为模板， 3 端特异性引物和UPM(UniversalPrimerMix)进行一次扩增得 到产物， 经1.5琼脂糖凝胶电泳可见850bp目的条带,同理， 5 端特异性引物和UPM进行一 次扩增得到产物， 经1.5琼脂糖凝胶电泳可见900bp目的条带,由于 和 亚基中间片段序 列相似度很高， 所以特异性扩增引物相近， 而RACE扩增产物大小几乎相同说明 和 亚基3端 序列和3端不翻译区及5端序列和5端不翻译区长度相近,所有测序结果经拼接和比对获得 和 亚基cDNA全长； d)CcRCA 。
8、与CcRCA cDNA序列特性的分析： CcRCA 与CcRCA 的cDNA全长相近， 都包含完 整的开放阅读框(ORF)和部分3端不翻译序列， 预测编码472、 435个氨基酸， 理论相对分子质 量51.52kD和47.52kD， BLAST分析显示两者相似85.44， 两条蛋白序列N端前55和57个氨基 酸预测为叶绿体转运肽(cTP)， 那么CcRCA 与CcRCA 成熟蛋白应包含417和378个氨基酸， 相 对应的分子质量为46.11kD和42.11kD， CcRCA 推导的蛋白序列在C端比CcRCA 多出37个氨 基酸， 其中包含两个半胱氨酸残基是RCA氧化还原调节的关键位点， 两段保。
9、守的ATP结合区 域GGKGQGKS和LFIND分别位于氨基酸序列的162到170位和222到227位， 根据对菠菜和烟草 RCA的研究， 在山核桃RCA中169位的赖氨酸与Rubisco活化和ATP酶活密切相关， 227位的天 冬氨酸对亚基结合过程中-磷酸键的精细调节必不可少， 此外， CcRCA 编码的氨基酸比 CcRCA 在C端多37个， 在已对比的序列中也有26个氨基酸种类差异， 尽管未获得全部CcRCA 与CcRCA 的不翻译序列， 但已获得的序列存在明显区别， 利用SignalP4.1Server程序对两 蛋白质进行分析， 没有发现信号肽， 说明两蛋白质均非分泌蛋白； 利用Chlo。
10、roP1.1Server 程序预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP)， 结果表示， 两基因蛋白质序列均含有叶绿体转 运肽， 且cTP前导序列长度分别为55和57， 利用ExPASy的PSORT程序对蛋白亚细胞定位进行 权利要求书 1/2 页 2 CN 105543341 A 2 预测， 结果表明RAC都定位在叶绿体中， 通过TMpred程序预测蛋白质的跨膜结构域， 结果显 示， 两蛋白具有2个跨膜螺旋， 分别在氨基酸第88107和143-162区域， 说明CcRCA编码的蛋 白可能是跨膜蛋白质， 综合分析可知， CcRCA为细胞核基因编码， 在叶绿体囊膜上发挥作用 的酶蛋白； e)RCA基因组。
11、序列分析： 为了确认RCA和RCA是否来自同一条前体mRNA不同位置剪切， 对 山核桃基因组DNA进行分析， 利用基因特异性引物扩取到CcRCA 、 CcRCA 的基因组DNA序列， CcRCA 基因组DNA包括6个内含子和7个外显子， 长度分别为1590bp和1419bp； CcRCA 包含5 个内含子和6个外显子， 长度分别为817bp和1308bp， 利用DNAMAN软件进行多序列比对显示 CcRCA 与CcRCA 相似性较高， 达到73.23， 与之前的mRNA的相似性比较结果一致， RCA基因 组DNA的分析证实已发现的两种RCAmRNA分别由2个独立的基因编码而来， 即1个 型基因。
12、和 1个 型基因； f)山核桃RCA的系统进化树分析： 使用NCBI的blastx程序， 对CcRCA 和CcRCA 基因进行 蛋白同源性比对， 发现山核桃与许多植物的RCA氨基酸序列都有较高的同源性， 采用MEGA 5.05软件的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)， 构建山核桃CcRCA 和CcRCA 与美国山核桃等 22种植物的RCA氨基酸序列的系统进化树， 系统进化树显示， 山核桃CcRCA 与美国山核桃 (Carayaillinoensis)、 美国红枫(Acerrubrum)苹果(Malusdomestica)等的亲缘关系相 近， CcRCA 与葡萄(Vitisvini。
13、fera)、 大豆(Glycinemax)和棉花(Gossypiumhirsutum)最 为接近， 相同度分别为88、 89和88， 其中对其保守结构域分析发现， 其保守区具有2个 ATP结合位点P-环序列和ATPasesensor2motif特殊位点， 都属于ABC_ATPase Superfamilies超家族基因， 但均与云杉(Piceasitchensis)、 衣藻等的亲缘关系较远； g)不同生长时期山核桃叶片中RCA表达分析:每隔一周于午后取同株不同枝头最外侧 幼叶或叶片进行编号后， 迅速液氮冷冻处理， 置于-70冰箱保存， 采用改良的CTAB法与试 剂盒(TaRaKaMiniBES。
14、TUniversalRNAExtractionKit)联合使用提取不同生长时期叶片 的总RNA,以提取所得总RNA为模板， OligodT为引物， 按照ReverseTranscriptaseM-MLV (RNaseH-)试剂盒(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链， 稀释5倍后用以RT-qPCR检测基因 的相对表达量,自然条件下生长的山核桃叶在不同时期RCA的表达量， 随着生长日期变化， CcRCA 和CcRCA 基因表达趋势相近。 2.如权利要求1所述一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法， 其特征在于： 所述步骤 d、 步骤e、 步骤f、 步骤g中的CcRCA 指的是本实验采用3 。
15、/5 RACE和RT-PCR技术成功扩增出 山核桃2个RCA基因的3 端， 序列拼接分别获得全长cDNA序列； 所述步骤d、 步骤e、 步骤f、 步 骤g中的CcRCA 指的是本实验采用3 /5 RACE和RT-PCR技术成功扩增出山核桃2个RCA基因 的5 端， 序列拼接分别获得全长cDNA序列。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105543341 A 3 一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法 【技术领域】 0001 本发明涉及生物工程的技术领域， 特别是一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方 法的技术领域。 【背景技术】 0002 山核桃属胡桃科山核桃属植物， 约有20个种， 其中4个种。
16、原产中国， 原产欧洲东南 部及亚洲西部汉代传入中国， 经数百年的繁育国内品种已经和国外的完全不同了。 世界上 基本亚热带地区都有胡桃科植物分布， 品种数百种。 国内各地都有分布， 东北以秋子居多 (野生)华北， 西北也有分布。 0003 山核桃在进行光合作用时， 关键步骤固定CO2过程需要Rubisco酶的催化。 Rubisco 酶的活性由植物体内复杂的机制进行调控， 其中大量研究已证实Rubiscoactivase(RCA) 能够活化并维持Rubisco酶的催化活性。 同时RCA也被认为是植物在各种不同环境胁迫下对 光合作用的关键调控因素， Mate等发现植物表达低水平的RCA会导致氮素积累。
17、和总生物量 的减少， 同时RCA表达很少或不表达的个体则无法在大气二氧化碳浓度下存活。 因此， 相关 研究通过RCA调控提高CO2吸收率最终提高作物产量具有重要意义。 【发明内容】 0004 本发明的目的就是解决现有技术中的问题， 提出一种山核桃RCA基因克隆的检测 分析方法， 本发明利用RACE和RT-PCR技术， 克隆获得山核桃2个RCA基因全长， 结合生物信息 学分析， 分析了在碱基序列、 编码氨基酸序列及其他特性差异， 并通过不同发育时期叶片的 RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式， 为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率 和提高抗逆性打下基础。 0005 为实现上述目的， 。
18、本发明一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 0006 a)序列检索与引物设计： 通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因， 利用 型 RCA的ORF的序列作为查询标记在山核桃基因组中进行同源匹配， 经同源基因序列比对和转 录组序列分析， 结合山核桃基因组片段检索， 设计引物为ActinFor： GCTGAACGGGAAATTGTC Actin内参引物、 ActinRev： AGAGATGGCTGGCTGGAAGAGGActin内参引物、 Rca-abF: GACTTCGCCACTACGACCTGRca基因部分片段扩取、 Rca-adR： TTCTCCATAC。
19、GACCATCACGRca基因 部分片段扩取、 3 RACE-a:GAACCACCCAATACACTGTCAACAACCAAa亚基3端特异扩增、 5 RACE- a ： CCATCCATG TTG TTG TCCAGG TCG TAG TG a 亚基5端特 异扩 增 、 3 R ACE- b ： G A A C C A C C C A A T A C A C A G T C A A C A A C C A A b 亚 基 3 端 特 异 扩 增 、 5 R A C E - b ： C C A T C C A T G T T G T T G T C C A A G T T G T A C T G。
20、 b 亚 基 5 端 特 异 扩 增 、 q P C R - a F : GTGAAGAGGGTCCAACTTGCCGAa亚基定量、 qPCR-aR： GCTCCCATCATCACTCCTCGCAGa亚基定量、 qPCR-bF： GGCAAACAGACCGCCAAGGACAb亚基定量、 qPCR-bR： TGGAAGAGCGAGTCAACCATACCCb亚 基定量、 Genome-aF:ACCTTCCATTAAAGTGCTGCGTGCa亚基基因组扩增、 Genome-aR： 说明书 1/5 页 4 CN 105543341 A 4 CCAAGGGCAGCCTCGCTCAAGTa亚基基因组扩增、。
21、 Genome-b1F:ACGAGGATGCTATTAAGAGCGGAACb 亚基基因组扩增、 Genome-b1R:GAAGTTGGATCAAAGTTCTCTGGCAb亚基基因组扩增； 0007 b)RCA基因中间片段扩增： 根据同源序列结合已有山核桃转录组， 利用Primer Premier5.0软件设计中间片段引物， 并以 -Actin作为内参基因， 进行PCR扩增得到产物， 经1琼脂糖凝胶电泳可见550bp目的条带； 0008 c)RCA基因3 端和5 端序列的扩增： 根据中间片段测序结果分别设计 和 RACE引 物， 以3 端反转录cDNA为模板， 3 端特异性引物和UPM(Univ。
22、ersalPrimerMix)进行一次扩 增得到产物， 经1.5琼脂糖凝胶电泳可见850bp目的条带,同理， 5 端特异性引物和UPM进 行一次扩增得到产物， 经1.5琼脂糖凝胶电泳可见900bp目的条带,由于 和 亚基中间片 段序列相似度很高， 所以特异性扩增引物相近， 而RACE扩增产物大小几乎相同说明 和 亚 基3端序列和3端不翻译区及5端序列和5端不翻译区长度相近,所有测序结果经拼接和比对 获得 和 亚基cDNA全长； 0009 d)CcRCA 与CcRCA cDNA序列特性的分析： CcRCA 与CcRCA 的cDNA全长相近， 都包 含完整的开放阅读框(ORF)和部分3端不翻译序列。
23、， 预测编码472、 435个氨基酸， 理论相对分 子质量51.52kD和47.52kD， BLAST分析显示两者相似85.44， 两条蛋白序列N端前55和57个 氨基酸预测为叶绿体转运肽(cTP)， 那么CcRCA 与CcRCA 成熟蛋白应包含417和378个氨基 酸， 相对应的分子质量为46.11kD和42.11kD， CcRCA 推导的蛋白序列在C端比CcRCA 多出37 个氨基酸， 其中包含两个半胱氨酸残基是RCA氧化还原调节的关键位点， 两段保守的ATP结 合区域GGKGQGKS和LFIND分别位于氨基酸序列的162到170位和222到227位， 根据对菠菜和 烟草RCA的研究， 在。
24、山核桃RCA中169位的赖氨酸与Rubisco活化和ATP酶活密切相关， 227位 的天冬氨酸对亚基结合过程中-磷酸键的精细调节必不可少， 此外， CcRCA 编码的氨基酸 比CcRCA 在C端多37个， 在已对比的序列中也有26个氨基酸种类差异， 尽管未获得全部 CcRCA 与CcRCA 的不翻译序列， 但已获得的序列存在明显区别， 利用SignalP4.1Server程 序对两蛋白质进行分析， 没有发现信号肽， 说明两蛋白质均非分泌蛋白； 利用ChloroP 1.1Server程序预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP)， 结果表示， 两基因蛋白质序列均含 有叶绿体转运肽， 且cTP前导序列。
25、长度分别为55和57， 利用ExPASy的PSORT程序对蛋白亚细 胞定位进行预测， 结果表明RAC都定位在叶绿体中， 通过TMpred程序预测蛋白质的跨膜结构 域， 结果显示， 两蛋白具有2个跨膜螺旋， 分别在氨基酸第88107和143-162区域， 说明 CcRCA编码的蛋白可能是跨膜蛋白质， 综合分析可知， CcRCA为细胞核基因编码， 在叶绿体囊 膜上发挥作用的酶蛋白； 0010 e)RCA基因组序列分析： 为了确认RCA和RCA是否来自同一条前体mRNA不同位置剪 切， 对山核桃基因组DNA进行分析， 利用基因特异性引物扩取到CcRCA 、 CcRCA 的基因组DNA 序列， CcR。
26、CA 基因组DNA包括6个内含子和7个外显子， 长度分别为1590bp和1419bp； CcRCA 包含5个内含子和6个外显子， 长度分别为817bp和1308bp， 利用DNAMAN软件进行多序列比对 显示CcRCA 与CcRCA 相似性较高， 达到73.23， 与之前的mRNA的相似性比较结果一致， RCA 基因组DNA的分析证实已发现的两种RCAmRNA分别由2个独立的基因编码而来， 即1个 型基 因和1个 型基因； 0011 f)山核桃RCA的系统进化树分析： 使用NCBI的blastx程序， 对CcRCA 和CcRCA 基因 进行蛋白同源性比对， 发现山核桃与许多植物的RCA氨基酸序。
27、列都有较高的同源性， 采用 说明书 2/5 页 5 CN 105543341 A 5 MEGA5.05软件的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)， 构建山核桃CcRCA 和CcRCA 与美国山核 桃等22种植物的RCA氨基酸序列的系统进化树， 系统进化树显示， 山核桃CcRCA 与美国山核 桃(Carayaillinoensis)、 美国红枫(Acerrubrum)苹果(Malusdomestica)等的亲缘关系 相近， CcRCA 与葡萄(Vitisvinifera)、 大豆(Glycinemax)和棉花(Gossypiumhirsutum) 最为接近， 相同度分别为88、 89。
28、和88， 其中对其保守结构域分析发现， 其保守区具有2 个ATP结合位点P-环序列和ATPasesensor2motif特殊位点， 都属于ABC_ATPase Superfamilies超家族基因， 但均与云杉(Piceasitchensis)、 衣藻等的亲缘关系较远； 0012 g)不同生长时期山核桃叶片中RCA表达分析:每隔一周于午后取同株不同枝头最 外侧幼叶或叶片进行编号后， 迅速液氮冷冻处理， 置于-70冰箱保存， 采用改良的CTAB法 与试剂盒(TaRaKaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit)联合使用提取不同生长时期 叶片的总RNA,以提取所得总RNA。
29、为模板， OligodT为引物， 按照ReverseTranscriptaseM- MLV(RNaseH-)试剂盒(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链， 稀释5倍后用以RT-qPCR检测 基因的相对表达量,自然条件下生长的山核桃叶在不同时期RCA的表达量， 随着生长日期变 化， CcRCA 和CcRCA 基因表达趋势相近。 0013 作为优选， 所述步骤d、 步骤e、 步骤f、 步骤g中的CcRCA 指的是本实验采用3 /5 RACE和RT-PCR技术成功扩增出山核桃2个RCA基因的3 端， 序列拼接分别获得全长cDNA序 列； 所述步骤d、 步骤e、 步骤f、 步骤g中的CcRCA 。
30、指的是本实验采用3 /5 RACE和RT-PCR技术 成功扩增出山核桃2个RCA基因的5 端， 序列拼接分别获得全长cDNA序列。 0014 本发明的有益效果： 本发明利用RACE和RT-PCR技术， 克隆获得山核桃2个RCA基因 全长， 结合生物信息学分析， 分析了在碱基序列、 编码氨基酸序列及其他特性差异， 并通过 不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式， 为利用基因工程手段调控 RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基础。 0015 本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。 【附图说明】 0016 图1是本发明的RCA基因中间片段琼脂糖凝胶电泳图； 001。
31、7 图2是本发明的RCA基因3， 末端和5， 末端扩增结果琼脂糖凝胶电泳图； 0018 图3是本发明的CcRCA 与CcRCA 氨基酸序列对比图； 0019 图4是本发明的RCA 基因组DNA结构示意图； 0020 图5是本发明的RCA 基因组DNA结构示意图； 0021 图6是本发明的基于NJ法的不同植物 类型RCA氨基酸序列的系统进化树示意图； 0022 图7是本发明的基于NJ法的不同植物 类型RCA氨基酸序列的系统进化树示意图。 【具体实施方式】 0023 参阅图1-7， 本发明一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 0024 a)序列检索与引物设计： 。
32、通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因， 利用 型 RCA的ORF的序列作为查询标记在山核桃基因组中进行同源匹配， 经同源基因序列比对和转 录组序列分析， 结合山核桃基因组片段检索， 设计引物为ActinFor： GCTGAACGGGAAATTGTC 说明书 3/5 页 6 CN 105543341 A 6 Actin内参引物、 ActinRev： AGAGATGGCTGGCTGGAAGAGGActin内参引物、 Rca-abF: GACTTCGCCACTACGACCTGRca基因部分片段扩取、 Rca-adR： TTCTCCATACGACCATCACGRca基因 部分片段扩取、 3 RA。
33、CE-a:GAACCACCCAATACACTGTCAACAACCAAa亚基3端特异扩增、 5 RACE- a ： CCATCCATG TTG TTG TCCAGG TCG TAG TG a 亚基5端特 异扩 增 、 3 R ACE- b ： G A A C C A C C C A A T A C A C A G T C A A C A A C C A A b 亚 基 3 端 特 异 扩 增 、 5 R A C E - b ： C C A T C C A T G T T G T T G T C C A A G T T G T A C T G b 亚 基 5 端 特 异 扩 增 、 q P C R。
34、 - a F : GTGAAGAGGGTCCAACTTGCCGAa亚基定量、 qPCR-aR： GCTCCCATCATCACTCCTCGCAGa亚基定量、 qPCR-bF： GGCAAACAGACCGCCAAGGACAb亚基定量、 qPCR-bR： TGGAAGAGCGAGTCAACCATACCCb亚 基定量、 Genome-aF:ACCTTCCATTAAAGTGCTGCGTGCa亚基基因组扩增、 Genome-aR： CCAAGGGCAGCCTCGCTCAAGTa亚基基因组扩增、 Genome-b1F:ACGAGGATGCTATTAAGAGCGGAACb 亚基基因组扩增、 Genome-b1。
35、R:GAAGTTGGATCAAAGTTCTCTGGCAb亚基基因组扩增； 0025 b)RCA基因中间片段扩增： 根据同源序列结合已有山核桃转录组， 利用Primer Premier5.0软件设计中间片段引物， 并以 -Actin作为内参基因， 进行PCR扩增得到产物， 经1琼脂糖凝胶电泳可见550bp目的条带； 0026 c)RCA基因3 端和5 端序列的扩增： 根据中间片段测序结果分别设计 和 RACE引 物， 以3 端反转录cDNA为模板， 3 端特异性引物和UPM(UniversalPrimerMix)进行一次扩 增得到产物， 经1.5琼脂糖凝胶电泳可见850bp目的条带,同理， 5 。
36、端特异性引物和UPM进 行一次扩增得到产物， 经1.5琼脂糖凝胶电泳可见900bp目的条带,由于 和 亚基中间片 段序列相似度很高， 所以特异性扩增引物相近， 而RACE扩增产物大小几乎相同说明 和 亚 基3端序列和3端不翻译区及5端序列和5端不翻译区长度相近,所有测序结果经拼接和比对 获得 和 亚基cDNA全长； 0027 d)CcRCA 与CcRCA cDNA序列特性的分析： CcRCA 与CcRCA 的cDNA全长相近， 都包 含完整的开放阅读框(ORF)和部分3端不翻译序列， 预测编码472、 435个氨基酸， 理论相对分 子质量51.52kD和47.52kD， BLAST分析显示两者。
37、相似85.44， 两条蛋白序列N端前55和57个 氨基酸预测为叶绿体转运肽(cTP)， 那么CcRCA 与CcRCA 成熟蛋白应包含417和378个氨基 酸， 相对应的分子质量为46.11kD和42.11kD， CcRCA 推导的蛋白序列在C端比CcRCA 多出37 个氨基酸， 其中包含两个半胱氨酸残基是RCA氧化还原调节的关键位点， 两段保守的ATP结 合区域GGKGQGKS和LFIND分别位于氨基酸序列的162到170位和222到227位， 根据对菠菜和 烟草RCA的研究， 在山核桃RCA中169位的赖氨酸与Rubisco活化和ATP酶活密切相关， 227位 的天冬氨酸对亚基结合过程中-磷。
38、酸键的精细调节必不可少， 此外， CcRCA 编码的氨基酸 比CcRCA 在C端多37个， 在已对比的序列中也有26个氨基酸种类差异， 尽管未获得全部 CcRCA 与CcRCA 的不翻译序列， 但已获得的序列存在明显区别， 利用SignalP4.1Server程 序对两蛋白质进行分析， 没有发现信号肽， 说明两蛋白质均非分泌蛋白； 利用ChloroP 1.1Server程序预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP)， 结果表示， 两基因蛋白质序列均含 有叶绿体转运肽， 且cTP前导序列长度分别为55和57， 利用ExPASy的PSORT程序对蛋白亚细 胞定位进行预测， 结果表明RAC都定位在叶绿体。
39、中， 通过TMpred程序预测蛋白质的跨膜结构 域， 结果显示， 两蛋白具有2个跨膜螺旋， 分别在氨基酸第88107和143-162区域， 说明 CcRCA编码的蛋白可能是跨膜蛋白质， 综合分析可知， CcRCA为细胞核基因编码， 在叶绿体囊 膜上发挥作用的酶蛋白； 说明书 4/5 页 7 CN 105543341 A 7 0028 e)RCA基因组序列分析： 为了确认RCA和RCA是否来自同一条前体mRNA不同位置剪 切， 对山核桃基因组DNA进行分析， 利用基因特异性引物扩取到CcRCA 、 CcRCA 的基因组DNA 序列， CcRCA 基因组DNA包括6个内含子和7个外显子， 长度分别。
40、为1590bp和1419bp； CcRCA 包含5个内含子和6个外显子， 长度分别为817bp和1308bp， 利用DNAMAN软件进行多序列比对 显示CcRCA 与CcRCA 相似性较高， 达到73.23， 与之前的mRNA的相似性比较结果一致， RCA 基因组DNA的分析证实已发现的两种RCAmRNA分别由2个独立的基因编码而来， 即1个 型基 因和1个 型基因； 0029 f)山核桃RCA的系统进化树分析： 使用NCBI的blastx程序， 对CcRCA 和CcRCA 基因 进行蛋白同源性比对， 发现山核桃与许多植物的RCA氨基酸序列都有较高的同源性， 采用 MEGA5.05软件的邻接法。
41、(Neighbor-Joining,NJ)， 构建山核桃CcRCA 和CcRCA 与美国山核 桃等22种植物的RCA氨基酸序列的系统进化树， 系统进化树显示， 山核桃CcRCA 与美国山核 桃(Carayaillinoensis)、 美国红枫(Acerrubrum)苹果(Malusdomestica)等的亲缘关系 相近， CcRCA 与葡萄(Vitisvinifera)、 大豆(Glycinemax)和棉花(Gossypiumhirsutum) 最为接近， 相同度分别为88、 89和88， 其中对其保守结构域分析发现， 其保守区具有2 个ATP结合位点P-环序列和ATPasesensor2mo。
42、tif特殊位点， 都属于ABC_ATPase Superfamilies超家族基因， 但均与云杉(Piceasitchensis)、 衣藻等的亲缘关系较远； 0030 g)不同生长时期山核桃叶片中RCA表达分析:每隔一周于午后取同株不同枝头最 外侧幼叶或叶片进行编号后， 迅速液氮冷冻处理， 置于-70冰箱保存， 采用改良的CTAB法 与试剂盒(TaRaKaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit)联合使用提取不同生长时期 叶片的总RNA,以提取所得总RNA为模板， OligodT为引物， 按照ReverseTranscriptaseM- MLV(RNaseH-)试剂盒。
43、(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链， 稀释5倍后用以RT-qPCR检测 基因的相对表达量,自然条件下生长的山核桃叶在不同时期RCA的表达量， 随着生长日期变 化， CcRCA 和CcRCA 基因表达趋势相近； 所述步骤d、 步骤e、 步骤f、 步骤g中的CcRCA 指的是 本实验采用3 /5 RACE和RT-PCR技术成功扩增出山核桃2个RCA基因的3 端， 序列拼接分别 获得全长cDNA序列； 0031 所述步骤d、 步骤e、 步骤f、 步骤g中的CcRCA 指的是本实验采用3 /5 RACE和RT- PCR技术成功扩增出山核桃2个RCA基因的5 端， 序列拼接分别获得全长cDNA。
44、序列。 0032 本发明利用RACE和RT-PCR技术， 克隆获得山核桃2个RCA基因全长， 结合生物信息 学分析， 分析了在碱基序列、 编码氨基酸序列及其他特性差异， 并通过不同发育时期叶片的 RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式， 为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率 和提高抗逆性打下基础。 0033 上述实施例是对本发明的说明， 不是对本发明的限定， 任何对本发明简单变换后 的方案均属于本发明的保护范围。 说明书 5/5 页 8 CN 105543341 A 8 金松恒， 郑炳松， 纪国存， 裘玲玲 浙江农林大学 一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法 1 PrimerPre。
45、mier5.0 1 1230 DNA 人工合成 1 ActinForGCTGAACGGGAAATTGTC 18 ActinRevAGAGATGGCTGGCTGGAAGAGG 22 Rca-abFGACTTCGCCACTACGACCTG 20 Rca-adRTTCTCCATACGACCATCACG 20 3 RACE-aGAACCACCCAATACACTGTCAACAACCAA 29 5 RACE-aCCATCCATGTTGTTGTCCAGGTCGTAGTG 29 3 RACE-bGAACCACCCAATACACAGTCAACAACCAA 29 5 RACE-bCCATCCATGTTGTTGTC。
46、CAAGTTGTACTG 29 qPCR-aFGTGAAGAGGGTCCAACTTGCCGA 23 qPCR-aRGCTCCCATCATCACTCCTCGCAG 23 qPCR-bFGGCAAACAGACCGCCAAGGACA 22 序列表 1/3 页 9 CN 105543341 A 9 qPCR-bRTGGAAGAGCGAGTCAACCATACCC 24 Genome-aFACCTTCCATTAAAGTGCTGCGTGC 24 Genome-aRCCAAGGGCAGCCTCGCTCAAGT 22 Genome-b1FACGAGGATGCTATTAAGAGCGGAAC 25 Genome-b。
47、1RGAAGTTGGATCAAAGTTCTCTGGCA 25 CcRcA MAAAVSTIGAVNQAPLSLNSSGVGASVPSSAFLGSSLKKLTPRFT.KVS48 CcRcA MAAAVSTIGTVNRvPLSLNSTGAGASVPSSAFLGSSLKKVTSPFNNSKVS50 CcRcA TGSFKVVAEIEEDKQTDKDKWKGLAFDTSDDQQDITRGKGMVDSLFQAPT98 CcRcA TGSFKVVAEVEEGKQTAKDKWKGLAFDESDDQQDITRGKGMVDSLFQAPT100 CcRcA GAGTHYAVMSSYDYISTGLRHYDLDNN。
48、MDGFYIAPAFMDKLVVHITKNFM148 CcRcA GSGTHYAVMSSYDYISTGLRQYNLDNNMDGFYIAPAFMDKLVVHISKNFM150 CcRcA SLPNIKIPLILGIWGGKGQGKSFQCELVFAKMGISPIMMSAGELESGNAG198 CcRcA SLPNIKIPLILGIWGGKGQGKSFQCELVFAKMGISPIMMSAGELESGNAG200 CcRcA EPAKLIRQRYREAADIIRKGKMCCLFINDLDAGAGRMGGTTQYTVNNQMV248 CcRcA EPAKLIRQRYREAADIIRKGKMCCLFINDLDAGAGRMGGTTQYTVNNQMV250 CcRcA NATLMNIADNPTNVQLPGMYNKEENPRVPVIVTGNDSSTLYAPLIRDGRM298 CcRcA NATLMNIADNPTNVQLPGMYNKEENPRVPIIVTGNDFSTLYAPLIRDGRM300 CcRcA EKFYWAPTREDRIGVCQGIFRTDKVAADDIVKLVDTFPGQSIDFFGALRA348 CcRcA EKFYWAPTREDRIGVCKGIFRTDKVADDDIVKLVDTFPGQSIDFFGALRA350 CcRcA RVYDDEVRKWVSGVGVDGIGKRLVNS。