M5型急性髓系白血病相关的特异miRNA及其应用.pdf

本发明提供了M5型急性髓系白血病相关的特异miRNA及其应用。本发明利用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，筛选得到与M5型急性髓系白血病相关的特异miRNA，其RNA序列分别如SEQ?ID?NO.1-3所示。本发明还提供了检测该特异miRNA的引物及其在制备检测M5型急性髓系白血病诊断试剂盒中的应用。本发明的特异miRNA可用于白血病的临床诊断和用于指导，本发明检测miRNA的特异性引物对可用于制备检测M5型急性髓系白血病诊断试剂或试剂盒，并对急性髓系白血病的治疗进行用药指导，具备较好的临床应用价值和广阔的应用前景。

1.一种M5型急性髓系白血病相关的特异miRNA，其特征在于，其为hsa-miR-222-3p，hsa-let-7d-5p，hsa-miR-221-3p；其RNA序列分别如SEQIDNO.1-3所示。 2.权利要求1所述的特异miRNA在制备检测M5型急性髓系白血病诊断试剂盒中的应用。 3.权利要求1所述的特异miRNA在制备M5型急性髓系白血病用药效果评价体系中的应用。 4.用于检测权利要求1所述的特异miRNA的特异性引物对，其特征在于，用于检测hsa-miR-222-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.4-5所示；用于检测hsa-let-7d-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.6-7所示；用于检测hsa-miR-221-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.8-9所示。 5.权利要求4所述的特异性引物对在制备检测M5型急性髓系白血病诊断试剂盒中的应用。 6.权利要求4所述的特异性引物对制备M5型急性髓系白血病用药效果评价体系中的应用。 7.一种检测M5型急性髓系白血病的诊断试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的任一对或多对特异性引物对。 8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，通过实时荧光定量PCR的方法，采用权利要求4所述的任一特异性引物对对待测骨髓样品进行检测；待测骨髓样品在检测前需提取总RNA、RNA加尾、合成cDNA。 9.如权利要求7-8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：50℃，2min；95℃，10min；95℃15s，60-62℃，40s，共40个循环。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及一种与M5型急性髓系白血病(AML) 相关的特异miRNA及其应用。

背景技术

白血病是以髓源或淋巴源血前体细胞的异常增殖为特征的一种异质性疾病，白血 病的预后一般较差,病死率较高,因此引起学术界的重视。白血病是以髓源或淋巴源血前体 细胞的异常增殖为特征的一种异质性疾病，主要包括急性淋巴系白血病(ALL)，急性髓系白 血病(AML)，慢性淋巴系白血病(CLL)和慢性髓系白血病(CML)等几种(Lightfoot,2005)。在 我国，急性白血病(AL)比慢性白血病(CL)多见(约5.5:1)。急性髓系白血病(AML)在青壮年 中多见，急性淋系白血病(ALL)在儿童、青壮年中的发病率都比较高。

白血病的预后一般较差,病死率较高,因此引起学术界的重视。应用现代联合化疗 方法,74％-81％的儿童ALL获治愈,但部分高危组病人的预后较差；成人ALL的治疗效果尚 不尽人意，虽然80％-95％以上的成人ALL在诱导治疗后获得形态学上的完全缓解(CR),但 大多数病人很快复发,最终60岁以下患者中2/3死亡,而60岁以上患者中死亡率高达90％。 因而迫切需要研究有效方法以改进现有治疗结果。部分成人ALL患者带有预示预后的特异 融合基因，有些则没有特异融合基因，预后主要依靠一般状况如发病时白细胞数、治疗反应 等。近30年来，AML的治疗取得了长足的进步，60岁以下患者的完全缓解率(complete remission,CR)与总体生存率稳步提高，但难治、复发AML仍是当前临床治疗的难点。按目前 AML治疗水平,有10％～20％的患者对一线标准诱导方案无效,50％～80％已经获得CR的患 者早晚(多数在1年内)还要复发。同ALL相似，有的AML类型有特异融合基因，有的类型依靠 形态学和免疫表型，预后有异质性。在没有特异融合基因的患者中发现评判和预测预后的 生物学指标是很有意义的。

miRNA是一类内源性、高度保守、非蛋白编码的小分子RNA，长度通常为18-25nt。 miRNA主要通过抑制蛋白编码基因的翻译或降解mRNA来发挥调控作用。研究表明：miRNA可 广泛参与发育周期、细胞增殖和分化、细胞凋亡、新陈代谢、神经调控、肿瘤发生以及病毒和 宿主的相互作用等各种生理和病理的调控过程。miRNA所在基因座的缺失、扩增、突变、表观 遗传修饰沉默等均可引起miRNA的异常表达或调控，从而导致肿瘤的发生。人类大约有50％ 的已注释miRNA位于和癌症相关的脆性位点及基因组区域中,并且miRNA的表达与多种肿瘤 相关,可能在肿瘤中起着原癌和抑癌基因的作用。

已有诸多研究结果证实：miRNA的表达及功能异常调控可导致白血病的发生。在此 过程中，miRNA既可充当原癌基因又可充当抑癌基因，有些miRNA甚至在白血病细胞的染色 体上出现缺失。它们的表达变化必然会引起其调控的相应靶基因表达的变化，结果导致白 血病细胞的表型、增殖及分化功能等方面的相应变化。有些miRNA在白血病细胞中特异性表 达，且不同的分化发育阶段可受特定miRNA调节。miRNA在不同的白血病细胞中具有特定的 表达水平和模式,miRNA表达谱不但可以反映白血病的类型，而且能够反映其分化状态。对 这部分miRNA的深入研究，可望为靶向治疗白血病提供新的思路。

AML的临床诊断方法主要包括形态学检测、细胞遗传学检测、免疫表型分析检测、 特异融合基因检测、特定基因突变检测，以及表观遗传学分析等。报道指AML患者的miRNA表 达谱特征与发病阶段、表型特征，以及AML特异融合基因的发生等均具有较高的相关性。因 此，miRNAs作为分子标记物用于AML临床分子诊断是一个必然的趋势。现阶段尚未见成熟的 miRNAs分子标志物应用于临床诊断AML的技术与产品，究其根本原因可能在于已有的绝大 多数研究是笼统地对所有FAB类型的AML进行分析，由于AML各个疾病分型在形态学及细胞 遗传学等方面不尽相同，使得这些miRNAs在临床应用上受到很大限制。miRNAs分子标记物 更适用于特定FAB类型AML的临床分子诊断。

M5型AML(M5急性单核细胞白血病)现阶段在临床上主要还是通过血象/骨髓象、细 胞化学染色等形态学方面的检测，检测方法较其他类型AML单一，很大程度上影响诊断的准 确率，为该类型AML患者的临床治疗与用药指导带来很大不确定性，延误病情。如果在已有 的诊断M5型AML形态学分析诊断技术的基础上，辅以特异性miRNAs分子标记物的分子检测 手段，无疑将对该类型AML疾病的诊断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与M5型急性髓系白血病(AML)相关的特异miRNA及其 应用。

本发明利用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，筛选得到3 个与M5型急性髓系白血病相关的特异miRNA，其名称为hsa-miR-222-3p，hsa-let-7d-5p， hsa-miR-221-3p。其RNA序列分别如SEQIDNO.1-3所示。

miRNA名称 序列 hsa-miR-222-3p AGCUACAUCUGGCUACUGGGU(SEQ ID NO.1) hsa-let-7d-5p AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU(SEQ ID NO.2) hsa-miR-221-3p AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(SEQ ID NO.3)

本发明提供了上述特异miRNA在制备检测M5型急性髓系白血病诊断试剂盒中的应 用。

本发明提供了特异miRNA在制备M5型急性髓系白血病用药效果评价体系中的应 用。

进一步地，本发明提供了用于检测上述特异miRNA的特异性引物对，用于检测hsa- miR-222-3p的特异性引物对的序列如SEQIDNO.4-5所示；

用于检测hsa-let-7d-5p的特异性引物对的RNA序列如SEQIDNO.6-7所示；

用于检测hsa-miR-221-3p的特异性引物对的序列如SEQIDNO.8-9所示。

hsa-miR-222-3p 反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.4) 正向引物 AGCTACATCTGGCTACTGGGT(SEQ ID NO.5) hsa-let-7d-5p 2 --> 反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.6) 正向引物 AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT(SEQ ID NO.7) hsa-miR-221-3p 反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.8) 正向引物 AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC(SEQ ID NO.9)

本发明提供了上述组合中任一特异性引物对在制备检测M5急性髓系白血病诊断 试剂盒中的应用。

本发明提供了上述组合中任一特异性引物对制备急性髓系白血病用药效果评价 体系中的应用。

本发明提供一种可用于检测M5型急性髓系白血病诊断试剂盒miRNA分子标志物， 以及含有上述任一或多对特异性引物对。

本发明的试剂盒是通过实时荧光定量PCR的方法，采用上述任一特异性引物对对 待测血液样品进行检测；待测血液样品在检测前需提取总RNA、RNA加尾、合成cDNA。

具体地，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：第一步50℃，2min；第二步95℃， 10min；第三步95℃15s，62℃，40s，第三步需40个循环。

在本发明的一个实施例中，实时荧光定量PCR的反应体系为：

本发明针对M5型AML细胞系的高通量分析与筛选技术，结合临床病例的实验验证， 提供了特异性针对M5型AML的miRNA分子标志物，本发明的特异miRNA可用于白血病的临床 诊断和用于指导，本发明检测miRNA的特异性引物对可用于制备检测M5型急性髓系白血病 诊断试剂或试剂盒，并对急性髓系白血病的治疗进行用药指导，具备较好的临床应用价值 和广阔的应用前景。

附图说明

图1为qPCR技术分析高通量技术筛选的16个miRNAs在M5型THP1与非M5型K562细胞 系中表达水平比较。通过比较选取了8个差异倍数>2.0倍且与非M5型K562细胞系存在显著 差异(p-value<0.05)的miRNA用于临床M5型AML样本的进一步实验验证。

图2为hsa-miR-222-3p在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果；利用qPCR 技术分析hsa-miR-222-3p在每个临床样本与正常对照中的表达水平。T-test用于分析差异 显著性分析(***,p-value<0.001；**,p-value<0.01,*,p-value<0.05)。s1代表样本1，以此 类推。

图3为hsa-let-7d-5p在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果，图注同图 2。

图4为hsa-miR-221-3p在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果，图注同图 2。

图5为hsa-miR-155-5p在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果，图注同图 2。

图6为hsa-miR-181a-5p在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果，图注同 图2。

图7为hsa-miR-320a在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果，图注同图2。

图8为hsa-miR-23a-3p在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果，图注同图 2。

图9为hsa-miR-103b在12个临床M5型AML病例样本中的实验验证结果，图注同图2。

图10A-图10C分别为qPCR方法检测hsa-miR-222-3p，hsa-let-7d-5p及hsa-miR- 221-3p在对照与M5型AML临床病例样本中表达水平的灵敏度分析。miRNA产物是否易于利用 qPCR方法扩增是评估灵敏度的重要方法。其中图10A，hsa-miR-222-3p与U6在正常对照与M5 型AML临床病例样本中的qPCR扩增曲线图谱；图10B为hsa-let-7d-5p与U6在正常对照与M5 型AML临床病例样本中的qPCR扩增曲线图谱；图10C为hsa-miR-221-3p与U6在正常对照与M5 型AML临床病例样本中的qPCR扩增曲线图谱。图中S:临床样本；C:对照样本。

图11A-图11F为利用qPCR溶解曲线分析hsa-miR-222-3p，hsa-let-7d-5p及hsa- miR-221-3p在M5型AML临床病例样本中的特异性。从溶解曲线可以反映在现有优化的检测 条件下，扩增产物单一，特异性好。其中，图11A、图11B分别表示hsa-miR-222-3p在对照样本 与M5型AML临床病例样本中的溶解曲线图谱；图11C、图11D分别代表hsa-let-7d-5p在对照 样本与M5型AML临床病例样本中的溶解曲线图谱；图11E、图11F分别代表hsa-miR-221-3p在 对照样本与M5型AML临床病例样本中的溶解曲线图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1M5型急性髓系白血病细胞系高表达miRNA的筛选

通过分析、比较M5型白血病细胞系(THP-1，THP-1来源于急性单核细胞性白血病患 者)和非M5型髓系白血病细胞系(K562，K562来源于慢性髓系白血病患者)的高通量miRNA- seq数据(NCBI登录号：GSE48059)筛选得到16个在M5型AML细胞系中高表达的miRNA。

设计上述16个miRNA特异的引物对，通过ABI7500荧光定量PCR仪，以M5型THP-1细 胞系和非M5型K562细胞系RNA加尾反转录产物为模板，验证各个miRNA的表达量。下表为16 个miRNA及其特异性扩增引物。

表1

对比M5型急性髓系白血病细胞系(THP-1)和非M5型慢性髓系白血病细胞系 (K562)，利用RT-PCR技术检测高通量技术筛选出的miRNA,检测结果如下(见图1)：8个miRNA 在THP-1中的表达量高于k562细胞的表达量。筛选过程如下：通过RT-PCR技术分别检测上述 每个miRNA在THP-1和k562细胞中的表达量，用THP-1的表达量除以K562细胞的表达量作为 相对表达量，相对表达量＞2.0且与K562细胞相比具有显著差异的miRNA，作为候选的与M5 型急性髓系白血病相关的特异miRNA标志物，分别是：hsa-let-7d-5p，hsa-miR-103b，hsa- miR-155-5p，hsa-miR-181a-5p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa- miR-320a。筛选过程如下表2所示：

表2

实施例2RT-PCR检测M5急性髓系白血病方法的建立

1、样品采集：12名M5型AML患者骨髓样本及1名正常骨髓样本。

2、样品处理：按照Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。

3、样品检测：取2μg总RNA。

(1)RNA加尾在0.2mLPCR管中混匀表2中成分，然后37℃水浴1.5小时。

表3RNA加尾反应体系.

试剂 体积 RNA(DNA free) 2μg 10×Poly(A)Polymerase Reaction Buffer 1μL ATP(10mM) 1μL E.coli Poly(A)Polymerase(5U/μl) 0.2uL 加去核算水补足至 20μL

(2)加反转录引物:加入0.5μl(1μg/μl)反转录引物，65度水浴放置10min后放置冰 上至少5min，并一直置于冰上至RT反应；

(3)cDNA的合成(逆转录)

将上述0.2ml反应体系置于冰上，加入1μLQmir-RT。65℃加热10分钟，迅速置于冰 上冷却5分钟以上。在冰上向上述反应体系中依次加入表3中成分：

表4逆转录反应体系.

将上述反应管放到PCR仪中，42℃，60min；72℃，10min；4℃保存。

(4)实时定量PCR

在ABI7500实时定量PCR仪上进行的反应体系和反应程序见表5和6。

表5实时定量PCR反应体系.

表6实时定量PCR反应程序.

4、检测结果：通过RT-PCR分别检测每个miRNA在12名患者与正常对照样本中的表 达量，每个患者表达量除以正常对照的表达量作为相对表达量，作图，横坐标为患者标本编 号，纵坐标为相对表达量，如图2-9所示。筛选标准如下：在上述获得的8个miRNA中，筛选在 12个样本中至少有10个样本的差异倍数大于2倍，且在12名患者样本中至少有10个样本表 达量较正常对照存在显著差异(p-value<0.05)的miRNA作为M5型AML的分子标志物。最终筛 选出在M5型AML病例样本中特异表达性的一组miRNAs为：hsa-miR-222-3p，hsa-let-7d-5p， hsa-miR-221-3p。筛选过程如下表7所示：

表7

最终筛选鉴定的3个M5型AML分子标记物的相对表达量及差异显著性分析分别如 下表8-表10：

表8hsa-miR-222-3p的相对表达量及差异显著性分析结果

表9hsa-let-7d-5p的相对表达量及差异显著性分析结果

相对表达量 差异显著性分析(p-value<0.05代表显著) 样品1 117.0970975 0.002059615 样品2 8.885403492 0.032503615 8 --> 样品3 16.85018129 0.029137346 样品4 42.98526144 0.021973583 样品5 7.82430403 0.006193855 样品6 3.407790996 0.071911541 样品7 8.476912215 0.07678627 样品8 2.381207202 0.012790343 样品9 35.06484481 0.005492862 样品10 438.1488087 0.023743709 样品11 6.936805526 0.007818592 样品12 9719.649776 0.000406652

表10hsa-miR-221-3p的相对表达量及差异显著性分析结果

miRNA在M5型AML临床样本中表达水品显著高于正常样本2倍以上，且差异显著p- value<0.05。

5、灵敏度验证

通过优化扩增引物、反转录及扩增条件等，本专利提供的方法可以灵敏地检测临 床M5型AML骨髓样本中hsa-miR-222-3p，hsa-let-7d-5p及hsa-miR-221-3p的表达水平。通 过qPCR扩增曲线，可以明显看出这三个miRNA在临床病例样本中均较正常对照样本易于扩 增，灵敏度较高，也显示其在临床病例样本中的特异高表达(见图10)。

6、特异度验证

在保证三个miRNA检测灵敏度的同时，本专利优化的miRNA检测方法也确保了其产 物扩增的特异性，产物单一，因此，可以用来准确评估三个miRNA在M5型AML临床病例中的表 达水平。分析qPCR过程中仪器自动生成的溶解曲线是评估扩增产物是否单一的标准方法， 本申请中也是利用了溶解曲线图谱来评估扩增产物的特异性(见图11)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。