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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510222428.5 (22)申请日 2015.05.05 CGMCC3.17368 2013.07.19 C12N 9/42(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/81(2006.01) (71)申请人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 李多川 韩超 陈宸 (54) 发明名称 一种新型耐热双功能糖苷水解酶 MtCel2 及 其编码序列和应用 (57) 摘要 本发明是一种新型热稳定的嗜热毁丝菌 Myceliophthora thermophila双。
2、功能糖苷水解酶 MtCel2 及其编码序列和应用。通过 RT-PCR 方法 从嗜热毁丝菌中获得 DUF4360 超家族糖苷水解酶 基因 MtCel2， 将其克隆并插入到毕赤酵母整合表 达载体 pPIC9K 中， 然后将得到的糖苷水解酶基因 MtCel2表达载体pPIC9K/MtCel2导入到毕赤酵母 GS115 中， 再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基 因MtCel2的酵母工程菌GS-MT-Cel2， 其表达产生 的糖苷水解酶 MtCel2 对纤维素和木聚糖均具有 很高的内切水解酶活性。MtCel2 具有良好的热稳 定性和很强的水解纤维素能力， 可广泛用于纤维 废料及其它工业领域， 具有重大经济。
3、价值和社会 价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 105441413 A 2016.03.30 CN 105441413 A 1.一种新型嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)DUF4360超家族双功能糖苷水 解酶MtCel2及其编码序列和应用， 其特征是该水解酶是一种尚未报道的热稳定内切糖苷水 解酶， 具有良好的纤维素酶和木聚糖酶水解活性。 通过RT-PCR方法从嗜热毁丝菌获得 DUF4360超家族糖苷水解酶基因MtCel2,将该基因克。
4、隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K, 获得表达重组质粒pPIC9K/MtCel2,转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定糖苷水解 酶基因MtCel2的毕赤酵母工程菌株GS-MT-Cel2， 其表达产生的糖苷水解酶MtCel2对纤维素 和木聚糖均具有很高的内切水解酶活性； 其中， 所述嗜热毁丝菌DUF4360超家族糖苷水解酶 MtCel2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105441413 A 2 一种新型耐热双功能糖苷水解酶MtCel2及其编码序列和应用 (一)技术领域 0001 本发明涉及生物工程 ， 具体地说是一种以嗜热毁丝菌Mycelio。
5、phthora thermophila的DUF4360超家族基因MtCel2表达的耐热双功能糖苷水解酶MtCel2及其编码 序列和应用。 (二)背景技术 0002 糖苷水解酶(英语： Glycosidehydrolases， 又称糖苷酶)是一种专门水解配糖键 (glycosidicbond)， 并产生两个较小的糖分子的酵素， 也是自然界中的常见酵素之一。 这 类蛋白质在人类的产业上也有所应用， 例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可 用的小分子。 糖苷水解酶具有多个家族。 0003 嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。 该菌在微晶。
6、纤维素为唯一碳源的培养基中50条件下可以产生热稳定的纤维素酶和糖苷 水解酶。 0004 嗜热毁丝菌产生的耐热糖苷水解酶MtCel2属于DUF4360超家族蛋白， 具有很强的 纤维素酶活性和木聚糖酶活性， 但之前从未发现DUF4360超家族具有水解活性的任何报道。 MtCel2对羧甲基纤维素的水解活力高达31.6U/mg， 对木聚糖的水解活力高达56.2U/mg。 (三)发明内容 0005 本发明从嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila获得DUF4360超家族耐热糖苷 水解酶基因的cDNA序列全长， 命名为MtCel2， 基因cDNA全长612bp， 编码203个氨基酸。 。
7、MtCel2具有信号肽序列(1-15aaMKALSLLTLLPLAAA)及一个N糖基化位点和5个O糖基化位 点。 将MtCel2编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索， 尚未发现相关报道。 0006 构建重组表达质粒载体pPIC9K/MtCel2， 利用电转仪进行电击转化Pichia pastorisGS115， 在MD和MM培养基上筛选， 经PCR鉴定筛选阳性转化子， G418筛选多拷贝转 化子， 然后进行甲醇诱导表达， 获得毕赤酵母工程菌株GS-MT-Cel2。 该工程菌株接种于含 BMGY培养基中， 在28200rpm/min摇床培养6d后， 糖苷水解酶的表达量为2.82mg/ml， 分。
8、子 量为77.5KDa， 对羧甲基纤维素的水解活力高达31.6U/mg， 对木聚糖的水解活力高达56.2U/ mg， MtCel2在60下是稳定的， 处理60min后仍有85以上的酶活性； 70处理60min后仍保 持52的活性； 80处理60min后保持31的活性； 90处理60min后保持18。 0007 耐热糖苷水解酶MtCel2对长链纤维素具有很强的水解能力， 其对羧甲基纤维素的 水解活力高达31.6U/mg， 对木聚糖的水解活力高达56.2U/mg。 并且MtCel2有很好的热稳定 性， 在70oC的处理1h条件下仍可以保持52的活性， 具有很好的工业应用前景。 (四)附图说明： 0。
9、008 图1耐热糖苷水解酶MtCel2的SDS-PAGE分析 0009 泳道1： 低分子量蛋白标准 说明书 1/8 页 3 CN 105441413 A 3 0010 泳道2： 纯化的耐热糖苷水解酶MtCel2 0011 图2A:耐热糖苷水解酶MtCel2的最适温度 0012 B:耐热糖苷水解酶MtCel2的热稳定性测定 0013 图3耐热糖苷水解酶MtCel2的最适pH 0014 图4A耐热糖苷水解酶MtCel2水解羧甲基纤维素产物的TLC分析 0015 泳道1： 标准寡糖(DP2-DP7) 0016 泳道2： 水解羧甲基产物 0017 B耐热糖苷水解酶MtCel2水解木聚糖产物的TLC分析。
10、 0018 泳道1： 标准寡糖(DP2-DP7) 0019 泳道2： 水解木聚糖产物 (五)具体实施方式 0020 实施例1： 嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila的分离鉴定 0021 (1)标本采集： 从堆肥中采集。 0022 (2)分离培养： 将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50培养3天后， 进行分离纯 化。 操作步骤参考CooneyandEmerson(1964)文献。 0023 (3)鉴定:参考CooneyandEmerson(1964)和LaTouche(1950)文献。 0024 实施例2： 耐热糖苷水解酶基因MtCel2的克隆 0025 (1)嗜热毁。
11、丝菌Myceliophthorathermophila总RNA的提取： 参照Trizol试剂盒说 明。 0026 (2)cDNA第一条链的合成： 按照Takara公司的TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver3.0试 剂盒说明书进行： 取12 g总RNA， 加RNaseFreeddH2O至9.5 L， 将RNA样品在75变性 5min， 立即在冰浴中冷却5min， 然后稍微离心一下， 在冰浴中依次加入以下各种成分： 10mmol/LdNTPMixture2 L， 10RTBuffer(Mg2+)2 L， 25mmol/LMgCl24 L， Oligod (T)-AdaptorPrimer。
12、1 L， RNaseInhibiter0.5 L， AMVReverseTranscriptase1 L (FinalVolume20 L)， 将反应液混合后， 室温下放10min， 然后42温育60min， 再煮沸5min 以灭活反转录酶。 加入180 LDEPC处理的ddH2O， 稀释至200 L， 混匀， 稍微离心， 保存于-20 ， 备用。 0027 (3)PCR反应(25 L)： cDNA2 L， 10Buffer2.5 L， 10mmol/LdNTP2 L， 25mmol/ LMgCl22 L， 上、 下游引物各2 L， TaqDNA聚合酶0.5 L(5U/ L)， ddH2O12。
13、 L。 反应条件为 945min预变性； 9440s， 5240s， 721min， 共32个循环， 72延伸10min， 4保存。 0028 上游引物： 5 -ATGAAGGCCCTCTCG-3 0029 下游引物： 5 -TTACTCGCACTTGCG-3 0030 (4)基因克隆： 取0.5 lPCR产物与pMD18-T载体进行连接， 操作步骤按照TAKARA公 司产品说明书进行。 然后连接产物转化大肠杆菌DH5 菌株， 在表面涂有氨卞青霉素(100 g/ mL)的LB平板上生长过夜。 挑取白色菌落， 在LB液体培养基中培养过夜。 0031 (5)质粒DNA的提取： 碱法提取质粒DNA。。
14、 0032 (6)序列测定： DNA双脱氧法测定核苷酸序列， 在上海生物工程有限公司进行。 序列 引物为M13启动子引物。 嗜热毁丝菌MtCel2基因cDNA全长612bp， 包含起始密码子和终止密 说明书 2/8 页 4 CN 105441413 A 4 码子， 无内含子， 编码203个氨基酸。 将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索， 尚未发现报 道。 该序列如下： 0033 (A)SEQIDNO1的信息 0034 (a)序列特征： *长度： 612碱基对； *类型： 核酸； *链型： 双链； *拓扑结构： 线性 0035 (b)分子类型： DNA 0036 (c)假设： 否 0037 (d。
15、)反义： 否 0038 (e)最初来源： 嗜热毁丝霉Myceliophthorathermophila 0039 (f)序列描述： 0040 0041 (B)SEQIDNO2的信息 0042 (a)序列特征： *长度： 203氨基酸； *类型： 氨基酸； *链型： 单链； *拓扑结构： 线性 0043 (b)分子类型： 蛋白质 0044 (c)序列描述： 0045 0046 实施方式3： 表达载体的构建 0047 (1)根据分离出的MtCel2基因的核苷酸序列设计表达引物， 在引物的5 端分别引 入EcorI和NotI酶切位点,下游引物引入6个组氨酸序列， 作为纯化标签： 0048 上游引物：。
16、 5 -CCGGAATTCGCGCCCACGAACACT-3 (EcorI) 0049 下游引物： 5 -TTGCGGCCGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGCACTTGCGCCAAG-3 (NotI) (组氨酸序列) 0050 (2)嗜热毁丝菌总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。 0051 (3)反转录合成cDNA第一条链： 取2 g总RNA， 加入5反应缓冲液4 L， 10mMdNTP2 L， 核糖核酸酶抑制剂(40200u/ L)0.5 L， 引物oligodT(1 g/ L)1 L， 反转录酶(10u/ L) 2 L， 42反应60min， 然后8510min终止。
17、反应， 稀释至200 L。 说明书 3/8 页 5 CN 105441413 A 5 0052 (4)PCR反应(25 L)： cDNA2 L， 10Buffer2.5 L， 10mmol/LdNTP2 L， 25mmol/ LMgCl22 L， 上、 下游引物各2 L， TaqDNA聚合酶0.5 L(5U/ L)， ddH2O12 L。 反应条件为94 5min预变性； 9440s， 5040s， 721min， 共32个循环， 72延伸10min， 4保存。 0053 (5)基因克隆： 取2 LPCR产物与pMD18T载体进行连接， 获得重组质粒pMD18T/ MtCel2操作步骤按TAK。
18、ARA公司产品说明书进行。 然后连接产物转化大肠杆菌DH5 ， 在涂有 AMP的LB平板上生长过夜。 挑取白色菌落， 在LB液体培养基中培养过夜。 0054 (6)质粒DNA提取： 碱法提取质粒DNA。 0055 (7)用EcorI和NotI对重组质粒pMD18T/MtCel2产物进行双酶切， 同时用EcorI 和NotI双酶切酵母表达质粒pPIC9K， DNA胶回收试剂盒回收纯化MtCel2基因及载体pPIC9K 片断。 然后进行体外连接， 获得重组质粒pMD18T/MtCel2， 重组质粒转化大肠杆菌JM109， 在 含Amp的LB转化平板上挑选单菌落， 提取质粒DNA， 进行PCR和酶切。
19、鉴定， 测序确认重组质粒 的读码框正确。 0056 实施例4.表达糖苷水解酶基因MtCel2的酵母工程菌株的构建及筛选 0057 (1)重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pMD18T/MtCel2用限制性内切酶Sac I线性化。 0058 (2)转化： 电击转化酵母菌株PichiapastorisGS115酵母感受态细胞， 转化方法 参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。 0059 (3)筛选： 用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上， 30培养24d,挑取 在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。 挑取阳性转化子分别点种于250 g/mL、 300 g/mL、 4。
20、00 g/mL、 500 g/mL、 600 g/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。 0060 实施方式5： 毕赤酵母PichiapastorisGS115的诱导表达和活性检测 0061 (1)将阳性转化子接种于含25mLBMGY培养基中， 30250rpm/min摇床培养24h (OD600达26)， 离心收集菌体， 将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中， 至OD600值为1.0， 30 250rpm/min继续培养， 每24h补充甲醇至终浓度为0.5， 每24h取样， 室温10， 000g离心 5min， 取上清进行SDS-PAGE分析。 0062 (2)酶活性检测： 酶活性测。
21、定采用DNS法， 反应体系及反应条件为100 L的酶液， 加 入200 L的0.5微晶纤维素或0.5木聚糖， 100 L的醋酸缓冲液(0.4mol/L、 pH5.0)60 反应30min， 加入400 LDNS试剂， 煮沸10min， 在540nm波长下测定光吸收值。 对照组用失活 的酶液做对照。 以失活酶液的活性定义为100， 测定耐热糖苷水解酶MtCel2的相对酶活 性。 重复三次， 取平均值。 蛋白含量测定采用Bradford法。 0063 (3)重组耐热糖苷水解酶MtCel2的最适反应温度、 pH及热稳定性： 诱导表达的重组 耐热糖苷水解酶经过GE公司的HisTrapFFcrude金属。
22、配体亲和层析柱纯化带有组氨酸标 记的重组蛋白质， 获得电泳均一的纯化蛋白， 用纯化的重组耐热糖苷水解酶测定其性质。 在 不同温度和pH条件下分别测定重组耐热糖苷水解酶的对纤维素的酶活力， 将最高的酶活力 定义为100， 分别计算不同温度条件下糖苷水解酶的相对酶活性； 将重组耐热糖苷水解酶 在不同的温度下保温30min， 检测剩余酶活力。 重复三次， 取平均值。 0064 实施方式6： DUF4360超家族耐热糖苷水解酶MtCel2水解纤维素产物的TLC分析 0065 产物鉴定采用TLC法(硅胶板薄层层析)， 根据MtCel2水解纤维素长链羧甲基纤维 素或者木聚糖产生的寡糖产物， 在德国Merc。
23、k公司的TLC硅胶板上进行层析， 不同寡糖产物 说明书 4/8 页 6 CN 105441413 A 6 层析时在硅胶板上的位置不同， 对照标准糖样品进行区分， 从而分析MtCel2对纤维素或木 聚糖水解的产物。 0066 实施方式7： 嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila的保藏和MtCel2基因的注 册 0067 嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(CGMCC)； 地址： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所； 保藏 日期： 2013年7月19日； 菌株编号为： CGMCC3.1。
24、7368； MtCel2基因在NCBI网站上进行注册， 序 列号为KM099283。 0068 说明书 5/8 页 7 CN 105441413 A 7 0069 说明书 6/8 页 8 CN 105441413 A 8 说明书 7/8 页 9 CN 105441413 A 9 0070 说明书 8/8 页 10 CN 105441413 A 10 0001 0002 序列表 1/2 页 11 CN 105441413 A 11 序列表 2/2 页 12 CN 105441413 A 12 图1 说明书附图 1/3 页 13 CN 105441413 A 13 图2 说明书附图 2/3 页 14 CN 105441413 A 14 图3 图4 说明书附图 3/3 页 15 CN 105441413 A 15 。