纯化免疫球蛋白溶液的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201180013130.3 (22)申请日 2011.03.09 10156103.3 2010.03.10 EP C07K 1/30(2006.01) C07K 16/18(2006.01) (73)专利权人 弗哈夫曼 - 拉罗切有限公司 地址 瑞士巴塞尔 (72)发明人 V宾德尔 C哈克迈尔 F施瓦茨 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247 代理人 胡晨曦 黄革生 CN 1759186 A,2006.04.12, CN 1681837 A,2005.10.12, BK.LYDERSEN et al.Acid Prec。

2、ipitation of Mammalian Cell Fermentation Broth. ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES .1994, 第 745 卷 (54) 发明名称 纯化免疫球蛋白溶液的方法 (57) 摘要 本文报导了直接在发酵之后或者在一个或多 个初步纯化步骤如蛋白质 A 亲和层析之后纯化细 胞培养上清液的方法。 通过将pH值调整到酸性范 围内和随后温育酸化的溶液， 宿主细胞核酸和宿 主细胞蛋白质可以被沉淀， 而目的多肽保留在溶 液中。之后通过简单的物理分离步骤可以除去沉 淀物和污染的宿主细胞组分。 (30)优先权数据 (85。

3、)PCT国际申请进入国家阶段日 2012.09.10 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2011/053547 2011.03.09 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2011/110598 EN 2011.09.15 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李翠莹 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书14页 附图6页 CN 102791726 B 2016.02.03 CN 102791726 B 1/1 页 2 1.产生免疫球蛋白亚类 IgG1 的方法， 其包括以下步骤 ： i)将由酸和水组成的溶液加入到已经被除去CHO细。

4、胞和CHO细胞碎片的细胞培养上清 液中， 用于将 pH 值调整到 pH 4.5-pH 5.5 的值， 其中溶液中不加入二价阳离子， ii) 在 4的温度下温育 pH 被调整的细胞培养上清液， 和 iii) 从被温育的细胞培养上清液中除去沉淀物从而产生免疫球蛋白， 其中所述细胞培养上清液包含不超过 10mg/ml 的浓度的免疫球蛋白， 其中加入的酸的浓度是 5.5mol/l 或者更低， 其中所述的温育进行 2 小时至 48 小时。 2.产生免疫球蛋白亚类 IgG4 的方法， 其包括以下步骤 ： i)将由酸和水组成的溶液加入到已经被除去CHO细胞和CHO细胞碎片的细胞培养上清 液中， 用于将 pH。

5、 值调整到 pH 4.5-pH 5.5 的值， 其中溶液中不加入二价阳离子， ii) 在 4的温度下温育 pH 被调整的细胞培养上清液， 和 iii) 从被温育的细胞培养上清液中除去沉淀物从而产生免疫球蛋白， 其中所述细胞培养上清液包含不超过 10mg/ml 的浓度的免疫球蛋白， 其中加入的酸的浓度是 5.5mol/l 或者更低， 其中所述的温育进行 2 小时至 48 小时。 3.根据权利要求1-2任一项的方法， 其特征在于在温育步骤中至少90的免疫球蛋白 保留在溶液中。 4.根据权利要求 1-2 任一项的方法， 其特征在于通过选自沉积、 倾析、 过滤、 沉降和离 心的方法除去沉淀物。 5.根。

6、据权利要求 1-2 任一项的方法， 其特征在于所述酸选自乙酸、 柠檬酸、 盐酸和磷 酸。 6.根据权利要求 1-2 任一项的方法， 其特征在于所述酸的浓度是从 1.5mol/l 至 5.5mol/l。 7.根据权利要求 1-2 任一项的方法， 其特征在于所述酸是具有 1.5mol/l 至 4mol/l 的 浓度的乙酸。 8.根据权利要求 1-2 任一项的方法， 其特征在于免疫球蛋白的浓度是 1mg/ml 至 5mg/ ml。 9.根据权利要求 1-2 任一项的方法， 其特征在于在 4的温度下在 pH5 或 pH 4 的 pH 值下温育 2 小时。 10.根据权利要求1-2任一项的方法， 其特征。

7、在于在4的温度下在pH 5或pH 4的pH 值下温育 2 小时至 48 小时。 权 利 要 求 书 CN 102791726 B 2 1/14 页 3 纯化免疫球蛋白溶液的方法 0001 本文报导了从溶液， 例如细胞培养上清液或者蛋白质 A 层析洗脱液中除去宿主细 胞 DNA 和宿主细胞蛋白质的方法， 所述方法不需要告知多肽含量。通过将溶液的 pH 值降低 到低于 pH 6 和在该 pH 值下温育所述溶液实现此目的。 0002 发明背景 0003 在多种诊断和治疗领域中使用生物学大分子如重组单克隆抗体和其他的蛋白质。 特别是单克隆抗体现在被广泛使用在多种严重疾病如癌或者类风湿关节炎中。通常， 。

8、通过 使用细菌、 酵母或者哺乳动物细胞的发酵过程产生这些复杂生物学大分子。传统地， 通过 离心或者过滤从发酵培养液中除去微生物或者哺乳动物细胞， 并且之后通过多种方法如过 滤、 沉淀和层析进一步纯化不含细胞的上清液， 以除去与发酵相关的杂质。 0004 除了培养基组分之外， 来自发酵过程的主要杂质是来自产生生物学大分子的细胞 的残余量的核酸 ( 宿主细胞 DNA(HCDNA) 和 RNA) 和宿主细胞蛋白质 (HCP)。为治疗目的， 在最终的药品中宿主细胞 DNA(HCDNA) 或者宿主细胞蛋白质的可接受浓度非常低， 以减少 副作用并且保证患者的安全。在发酵工程中的近来的改进已经导致在生产的生。

9、物反应器 中较高的细胞密度并且对纯化方法提出了更高的要求， 所述较高的细胞密度增加了 HCP 和 HCDNA 在无细胞的上清液中的水平。 0005 因此非常希望得到从细胞培养上清液中除去大量的HCDNA和HCP的有效的和廉价 的方法。 0006 O Brien,W.D., 等人 (J.Acoust.Soc.Am.52(1972)1251-1255) 报导了脱氧核糖 核酸水溶液的超声研究。Vorlickova,M., 等人 (Nucl.Acids Res.27(1999)581-586) 报导 了 DNA 的鸟嘌呤 - 腺嘌呤重复链的二聚化。Lydersen 等人 (Lydersen,B.K.,。

10、 等人 ,Ann. N.Y.Acad.Sci.745(1994)222-231) 报导了哺乳动物细胞发酵培养液的酸沉淀。在 WO 2008/127305中报导了使用低pH和二价阳离子分离生物大分子的方法。 在EP1 561 756和 EP1 380 589 中报导了纯化蛋白质的方法。 0007 发明概述 0008 本文报导了从细胞培养上清液中纯化多肽的方法。已经发现通过调整 pH 值到酸 性范围内并且随后在特定的时间内温育酸化的溶液， 宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白质沉 淀， 但是目的多肽保留在溶液中。之后通过简单的物理分离步骤可以除去沉淀物和污染的 宿主细胞组分。在处理溶液的过程中， 目的多肽保。

11、留在溶液中而宿主细胞污染物被沉淀。 0009 一方面， 本文报导了产生或者获得免疫球蛋白的方法， 其包括以下步骤 ： 0010 i) 将由酸和水组成的溶液加入到已经被除去细胞和细胞碎片的细胞培养上清液 中， 用于调整 pH 值到 pH4.5-pH5.5 的值， 其中溶液基本不含二价阳离子， 0011 ii) 将 pH 被调整的细胞培养上清液温育， 并且 0012 iii) 从温育的细胞培养上清液中除去沉淀物从而产生或者获得免疫球蛋白， 0013 其中所述细胞培养上清液包含不超过 10mg/ml 的浓度的免疫球蛋白， 0014 其中加入的酸的浓度是 5.5mol/l 或者更低。 0015 在一个。

12、实施方案中， 在温育步骤中至少 90% 的免疫球蛋白保留在溶液中。在另一 说 明 书 CN 102791726 B 3 2/14 页 4 个实施方案中， 在温育步骤中至少 95% 的免疫球蛋白保留在溶液中。在另一个实施方案中， 在温育步骤中超过 98% 的免疫球蛋白保留在溶液中。 0016 在一个实施方案中， 产生多肽的方法包括以下步骤 ： 0017 a) 培养包含编码多肽的核酸的细胞， 0018 b) 从细胞培养上清液中除去细胞和细胞碎片， 0019 c) 调整细胞培养上清液的 pH 值到低于 pH 5.5 的值， 0020 d) 温育 pH 被调整的细胞培养上清液， 并且 0021 e) 。

13、从经温育的细胞培养上清液中除去沉淀物， 从而产生所述多肽。 0022 另一个方面， 本文报导了纯化细胞培养上清液的方法， 其包括以下步骤 ： 0023 a) 将细胞培养上清液的 pH 值调整到低于 pH 5.5 的值， 0024 b) 温育 pH 被调整的细胞培养上清液， 并且 0025 c) 从经温育的细胞培养上清液中除去沉淀物， 从而纯化细胞培养上清液。 0026 另一个方面是产生多肽的方法， 其包括以下步骤 ： 0027 i) 提供包含编码多肽的核酸的哺乳动物细胞， 0028 ii) 在无血清的条件下培养所述细胞， 0029 iii) 回收细胞培养上清液， 从细胞培养上清液任选地除去细胞。

14、或细胞碎片， 和 0030 iv) 通过以下的步骤纯化细胞培养上清液， 从而产生所述多肽 ： 0031 a) 将由酸和水组成的溶液加入到细胞培养上清液中， 用于调整 pH 值到低于 pH 5.5 的值， 所述溶液基本不含二价阳离子， 0032 b) 温育 pH 被调整的细胞培养上清液， 并且 0033 c) 从经温育的细胞培养上清液中除去沉淀物， 0034 其中所述细胞培养上清液包含不超过 10mg/ml 的浓度的多肽， 0035 其中加入的酸的浓度是 5.5mol/l 或者更低。 0036 在一个实施方案中， 调整pH值到从pH 5.5至pH 3.5的值。 在另一个实施方案中， 调整 pH 。

15、值到从 pH 5.5 至 pH 4.5 的值。 0037 在一个实施方案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液在 1 C 至 30 C 的温度下温 育。 在另一个实施方案中， 将pH被调整的细胞培养上清液在2C至10C的温度下温育。 在另一个实施方案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液在约 4 C 的温度下温育。 0038 在一个实施方案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液温育约 0.5 小时或者更长。在 另一个实施方案中， 将pH被调整的细胞培养上清液温育约0.5小时至约72小时。 在另一个 实施方案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液温育约 2 小时至约 48 小时。在另一个实施方 。

16、案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液温育约 20 小时至约 32 小时。在另一个实施方案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液温育约 24 小时。 0039 在一个实施方案中， 通过过滤、 沉降或者离心除去细胞和细胞碎片和 / 或除去沉 淀物。 0040 在另一个实施方案中， 细胞培养上清液是哺乳动物细胞培养上清液。 0041 在一个实施方案中， 多肽是免疫球蛋白。在另一个实施方案中， 免疫球蛋白是 G 类 免疫球蛋白。在另一个实施方案中， 免疫球蛋白是 G 类的亚类 IgG1 或者亚类 IgG4 的免疫 球蛋白或者它们的变体。 说 明 书 CN 102791726 B 4 3/14 页 。

17、5 0042 在一个实施方案中， 免疫球蛋白是亚类 IgG1， 并且在 pH 4.5 至 pH 3.5 的 pH 值下 温育约 2 小时至约 48 小时。 0043 在一个实施方案中， 免疫球蛋白是亚类 IgG4， 并且在 pH 5.5 至 pH 4.5 的 pH 值下 温育约 2 小时至约 30 小时。 0044 发明详述 0045 本文报导了纯化多肽的方法， 其包括以下步骤 ： 0046 a) 调整含多肽的细胞培养上清液的 pH 值到 pH3.5 至 pH5.5 的值， 0047 b) 将 pH 被调整的细胞培养上清液温育， 和 0048 c) 从温育的细胞培养上清液中除去沉淀物， 从而纯。

18、化所述多肽。 0049 可以用其中细胞和细胞碎片已经被除去的粗制的细胞发酵上清液直接进行本文 报导的方法， 也可以在一个或者多个初步纯化步骤如蛋白质 A 亲和层析之后进行本文报导 的方法。 0050 术语 “细胞培养上清液” 表示通过培养分泌目的多肽的细胞获得的溶液。 除分泌的 多肽以外， 上清液也包含使用的细胞培养基组分和在培养中细胞分泌的除了目的多肽以外 的代谢组分以及在培养中从死细胞释放的培养细胞的其他组分或者在从细胞回收多肽的 过程中来自解体细胞的培养细胞的其他组分。细胞培养上清液不含细胞碎片和 / 或完整细 胞。该术语也包括已通过单一层析纯化步骤如蛋白质 A 亲和层析处理的细胞培养上。

19、清液。 0051 术语 “多肽” 表示多聚体， 其由通过天然或者合成产生的肽键连接的氨基酸组成。 少于约 20 个氨基酸残基的多肽可以被称作 “肽” ， 而由两个或者以上多肽组成的分子或者 包含超过 100 个氨基酸残基的一条多肽的分子可以被称作 “蛋白质” 。多肽也可以包含 非 - 氨基酸组分， 如糖基、 金属离子或者羧酸酯类。通过细胞可以加入非氨基酸组分， 在所 述细胞内表达多肽， 并且随着细胞类型的不同表达可以不同。本文通过多肽的氨基酸主链 结构或者编码相同多肽的核酸方面定义多肽。附加物如糖基通常没有被具体描述， 但是仍 然可以存在。在一个本文报导的方法的实施方案中是选自免疫球蛋白、 免。

20、疫球蛋白片段和 免疫球蛋白缀合物的多肽。 0052 术语 “免疫球蛋白” 表示由两个或者以上多肽组成的蛋白质， 所述多肽基本上由免 疫球蛋白基因编码。 公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白 可变区基因。免疫球蛋白通常包含两个被称作轻链的多肽 ( 轻链 ) 和两个被称作重链的多 肽 ( 重链 )。每种重链和轻链多肽含有可变结构域 ( 可变区 )( 通常是多肽链的氨基末端部 分 )， 其包含能与抗原相互作用的结合区域。每种重链和轻链多肽包含恒定区 ( 通常是羧 基末端部分 )。免疫球蛋白的轻链或者重链的可变结构域包含不同的区段， 即四个框架区 (FR) 和三个高变区 (CD。

21、R)。免疫球蛋白的恒定区不直接涉及与免疫球蛋白的抗原的结合， 但是显示出多种效应子功能。根据重链恒定区的氨基酸序列， 将免疫球蛋白分成类 :IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM。将这些类中的一些进一步分成亚类 ( 亚型 )， 即将 IgG 分成 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgG4， 或者将 IgA 分成 IgA1 和 IgA2。根据免疫球蛋白所属的类将免疫球蛋 白的重链恒定区分别称作 (IgA)、 (IgD)、 (IgE)、 (IgG) 和 (IgM)。 0053 术语 “免疫球蛋白缀合物” 表示一种多肽， 其包含的免疫球蛋白重链或者轻链的至 少一种结构域通过肽键结合到。

22、另一种多肽。所述另一种多肽是非免疫球蛋白肽， 如激素或 者生长受体或者细胞毒性肽或者补体因子等。 说 明 书 CN 102791726 B 5 4/14 页 6 0054 在一个实施方案中， 免疫球蛋白是 G 类免疫球蛋白。在另一个实施方案中， 免疫球 蛋白是 G 类的亚类 IgG1 或者亚类 IgG4 或者其变体。术语 “变体” 表示由于在亲本多肽氨 基酸序列中添加、 缺失和 / 或取代一个或者多个氨基酸残基产生的与亲本多肽的氨基酸序 列不同的多肽。在一个实施方案中变体具有氨基酸序列， 其具有与亲本多肽的氨基酸序列 至少90%的氨基酸序列同一性， 在另一个实施方案中具有至少95%的氨基酸序列。

23、同一性， 并 且在另一个实施方案中具有至少 99% 的氨基酸序列同一性。 0055 本文使用的术语 “调整 pH 值” 表示将酸加入到溶液尤其是细胞培养上清液中， 以 便将溶液的pH值降低到低于pH7.0的值。 通过加入酸性溶液， 即酸， 可以实现所述调整。 在 一个实施方案中， 调整是通过加入选自盐酸、 磷酸、 乙酸和柠檬酸的酸性溶液。 0056 本文使用的术语 “温育” 表示在设定的 pH 值下维持各溶液。温育可以保持特定的 时间。在一个实验方案中温育是约 0.5 小时或者以上。在另一个实施方案中， 温育是约 0.5 小时至约 72 小时。在另一个实施方案中， 温育是约 2 小时至约 48。

24、 小时。在另一个实施方 案中， 温育是约 20 小时至约 32 小时。在另一个实施方案中， 温育是约 24 小时。在一个实 验方案中， 在从 pH3.5 至 pH5.5 的 pH 值， 尤其在 pH4.5 至 pH5.5 的 pH 值下温育上述实施方 案中限定的特定时间。 0057 本文使用的术语 “约” 表示直接连续值不是准确的值而是表示一个范围。在一个 实施方案中， 所述范围是所述值加或减 20%， 在另一个实施方案中， 所述范围是所述值加或 减 10%， 在另一个实施方案中， 所述范围是所述值加或减 5%。例如， 术语 “约 24 小时” 表示 从 19.2 小时至 28.8 小时。 0。

25、058 术语 “基本不含” 表示这种化合物没有被加入到溶液中。但是该特定的化合物可 以以少量存在， 因为它在溶液中包含的其他化合物中存在。当这种化合物在溶液中以 1mM 或者更低的浓度， 尤其是以 1M 或者更低的浓度存在时， 通常认为所述溶液基本不含该化 合物。 0059 本领域已知产生多肽的方法并且其包括蛋白质在原核和真核细胞中的表达以及 随后的分离多肽和通常纯化至可药用的纯度。 例如， 为在细胞中表达免疫球蛋白， 通过标准 方法将编码各个轻链和重链的核酸插入到表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞如 CHO 细胞、 NS0 细胞、 SP2/0 细胞、 HEK293 细胞、 COS 细胞、。

26、 PER.C6(R) 细胞、 酵母或大肠杆菌 细胞中进行表达， 并且从细胞 ( 上清液或裂解后的细胞 ) 回收免疫球蛋白。 0060 在本申请中使用的术语 “细胞” 表示任何类型的能被改造以生产多肽的细胞系统。 在一种实施方案中， 细胞是哺乳动物细胞。在另一种实施方案中， 细胞选自 HEK 细胞和 CHO 细胞。 0061 已经发现， 如果将细胞培养上清液的 pH 值调整到低于 pH 5.5 的值并且随后将溶 液在该 pH 值下温育特定的时间， 那么培养细胞的核酸和细胞蛋白质沉淀， 而分泌的多肽保 留在溶液中。之后通过简单的物理分离步骤即可以除去污染的宿主细胞组分。 0062 本文报导的方法可。

27、以用于细胞培养上清液的任何类型， 即， 用于真核细胞培养上 清液和原核细胞培养上清液。 在一个实施方案中， 细胞培养上清液是真核细胞培养上清液。 在另一个实施方案中， 细胞培养上清液是哺乳动物细胞培养上清液。 在另一个实施方案中， 细胞培养上清液是 CHO、 HEK 或 Sp2/0 细胞培养上清液。 0063 如今， 几乎所有细胞培养方法都在没有添加的动物血清的情况下进行。 因此， 在一 说 明 书 CN 102791726 B 6 5/14 页 7 个实施方案中， 在没有血清的条件下从细胞培养物获得细胞培养上清液。 额外地， 由于没有 被添加的动物血清排除了来自动物血清中存在的未知化合物的潜。

28、在干扰， 并且也降低了在 细胞培养上清液中的多肽浓度。这是有利的， 因为通常在利用沉淀纯化的方法中可能发生 目的多肽的共沉淀， 由此降低了纯化方法的产率。在培养细胞或者细胞碎片的存在下可以 观察到相同的效应。因此， 在一个实施方案中， 在调整 pH 值之前从细胞培养上清液除去细 胞和细胞碎片。 0064 在本文报导的方法中待纯化的多肽浓度不超过10mg/ml。 在一个实施方案中， 细胞 培养上清液中的多肽浓度是从 0.1mg/ml 至约 10mg/ml。在另一个实施方案中， 细胞培养上 清液中的多肽浓度是从1mg/ml至约8mg/ml。 在另一个实施方案中， 细胞培养上清液中的多 肽浓度是从 。

29、1mg/ml 至约 5mg/ml。 0065 为调整细胞培养上清液的 pH 值， 必须将酸加入到细胞培养上清液中。这种酸可以 是任何酸， 只要这种酸不与多肽不可逆地相互作用。在一种实施方案中， 所述酸选自盐酸、 磷酸、 硫酸、 甲酸、 乙酸、 丙酸、 丙二酸、 丁二酸、 肥酸、 乳酸和柠檬酸。必须指出， 当被加入到 细胞培养上清液时， 酸是水溶液。该溶液由作为游离酸的各种酸和水组成并且基本不含其 他的物质， 尤其是二价阳离子。术语 “游离酸” 表示所述酸以一种形式存在， 其中存在酸性 的氢原子并且所述氢原子例如不与不同的阳离子交换。 这包括了用于制备溶液的酸的形式 也是游离酸 ； 同样地排除了。

30、以盐形式使用的酸。 在一个实施方案中， 酸选自盐酸、 磷酸、 乙酸 和柠檬酸。在一个实施方案中， 在各自溶液中的酸浓度是 5.5mol/l 或者更低。在另一个实 施方案中酸浓度是从 1mol/l 至 5.5mol/l。在另一个实施方案中酸浓度是从 1.5mol/l 至 4mol/l。或者在一个实施方案中， 在各自溶液中的酸浓度是以重量计 30% 或者更低。在一 个实施方案中， 酸浓度是从以重量计的1%至以重量计的30%。 在另一个实施方案中， 浓度是 从以重量计的 5% 至以重量计的 25%。在另一个实施方案中， 酸浓度是从以重量计的 10% 至 以重量计的 20%。 0066 通常， 如果本。

31、文给出了值的范围， 那么该范围明确包括列出的边界点。 0067 在调整了 pH 值之后， 将被调整了 pH 值的细胞培养上清液温育特定的时间。在一 个实施方案中， 特定的时间至少是 0.5 小时或者以上。在另一个实施方案中， 特定的时间是 从约 0.5 小时至约 72 小时。在另一个实施方案中， 特定的时间是从约 2 小时至约 48 小时。 在另一个实施方案中， 特定的时间是从约 20 小时至约 32 小时。在另一个实施方案中， 特定 的时间是约 24 小时。在一个实施方案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液在 1 C 至 30 C 的温度下温育。在另一个实施方案中， 将 pH 被调整的细胞。

32、培养上清液在 2 C 至 10 C 的 温度下温育。在另一个实施方案中， 将 pH 被调整的细胞培养上清液在约 4 C 的温度下温 育。 0068 用本文报导的方法可以从细胞培养上清液沉淀 ( 即， 除去 ) 宿主细胞核酸和宿主 细胞蛋白质而不降低产生的多肽的浓度。 约两小时的温育时间可以足够除去大量的宿主细 胞核酸。因此， 在一个实施方案中， 温育是保持约 2 小时。为沉淀宿主细胞蛋白质， 根据调 整的 pH 值和多肽， 约 2 小时至约 48 小时的温育时间可以是足够的。因此， 在一个实施方案 中， 在约 pH 5 的 pH 值下在约 4 C 的温度下温育约 2 小时。在另一个实施方案中，。

33、 在约 5 的 pH 值下在约 4 C 的温度下温育约 2 小时至约 48 小时。 0069 在一个实施方案中， 所述多肽是免疫球蛋白。 说 明 书 CN 102791726 B 7 6/14 页 8 0070 在一个实施方案中， 所述免疫球蛋白是亚类 IgG1 的免疫球蛋白。在另一个实施方 案中， 在约 pH4.5 至 pH3.5 的 pH 值下温育 2 小时至 48 小时， 并且免疫球蛋白是亚类 IgG1 的免疫球蛋白。在特定的实施方案中温育 2 小时至 30 小时。 0071 在一个实施方案中， 所述免疫球蛋白是亚类 IgG4 的免疫球蛋白。在另一个实施方 案中， 在约 pH5.5 至 。

34、pH4.5 的 pH 值下温育 2 小时至 48 小时， 并且免疫球蛋白是亚类 IgG4 的免疫球蛋白。在特定的实施方案中在约 pH5 的 pH 值下温育。 0072 温育之后必须除去沉淀。 为除去沉淀， 可以使用本领域技术人员已知的任何方法。 示例性的方法是过滤、 沉积和倾析、 离心和沉降。 在一个实施方案中通过选自沉积、 过滤、 沉 降和离心的方法除去沉淀。 0073 除去沉淀之后， 例如用本领域技术人员已知的层析方法可以进行多肽的进一步纯 化。因此在一个实施方案中， 本文报导的方法包括用一个或者多个层析步骤纯化多肽的步 骤。 0074 为纯化免疫球蛋白， 可以利用不同柱层析步骤的组合。在。

35、一个实施方案中， 在蛋 白质 A 亲和层析之后是一种或者两种额外的层析分离步骤， 例如离子交换层析步骤。很好 地建立并且广泛使用了用于蛋白质回收和纯化的不同的方法， 如用微生物蛋白的亲和层析 ( 例如蛋白质 A 或蛋白质 G 亲和层析 )、 离子交换层析 ( 如阳离子交换 ( 羧甲基树脂 )、 阴离 子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)、 亲硫吸附(例如用-巯基乙醇和其他的SH 配体 )、 疏水相互作用或芳香吸附层析 ( 如苯基琼脂糖、 Aza-arenophilic 树脂、 或间 - 氨基 苯基硼酸 )、 金属螯合亲和层析 ( 例如用镍 (II) 和铜 (II)- 亲和材料 )、 尺寸排。

36、阻层析和电 泳方法 ( 如凝胶电泳、 毛细管电泳 )。 0075 提供了下面的实施例和附图来帮助理解本发明， 在所附权利要求中给出了本发明 的真实范围。应当理解， 可以对给出的方法进行修改， 只要不背离本发明的精神。 附图说明 0076 图 1 用本文报导的方法获得的抗 -EGFR 抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含 量。 0077 图2用本文报导的方法获得的抗-EGFR抗体发酵培养上清液中的宿主细胞蛋白质 含量。 0078 图 3 用本文报导的方法获得的抗 -EGFR 抗体发酵培养上清液中的抗体含量。 0079 图 4 用本文报导的方法获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清液中的宿主。

37、细胞 DNA 含 量。 0080 图5用本文报导的方法获得的抗-PLGF抗体发酵培养上清液中的宿主细胞蛋白质 含量。 0081 图 6 用本文报导的方法获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清液中的抗体含量。 0082 图 7 用本文报导的方法获得的抗 -P- 选择素抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含量。 0083 图8用本文报导的方法获得的抗-P-选择素抗体发酵培养上清液中的宿主细胞蛋 白质含量。 0084 图 9 用本文报导的方法获得的抗 -P- 选择素抗体发酵培养上清液中的抗体含量。 说 明 书 CN 102791726 B 8 7/14 页 9 0085 图 10 用本文报导的方。

38、法根据 pH 值和温育时间获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清 液中的抗体含量。 0086 图 11 用本文报导的方法根据 pH 值和温育时间获得的抗 -P- 选择素抗体发酵培养 上清液中的抗体含量。 0087 图 12 用本文报导的方法根据 pH 值和温育时间获得的抗 -HER3 抗体发酵培养上清 液中的抗体含量。 0088 实施例 1 0089 材料和方法 0090 抗体 0091 用 WO 2008/017963 中报导的抗 -EGFR 抗体例证本文报导的方法。 0092 另一种示例性的免疫球蛋白是 WO 2006/099698 中报道的抗 -PLGF 抗体。 0093 另一种示例性的。

39、免疫球蛋白是 WO 2005/100402 中报道的抗 -P- 选择素抗体。 0094 另一种示例性的免疫球蛋白是 PCT/EP2010/070062 中报道的抗 -HER3 抗体。 0095 DNA 0096 通过 Q-PCR( 定量聚合酶链反应 ) 测量残余的 DNA 浓度。因此， 在高温下温育样品 使样品中的 DNA 变性。根据制造商说明书， 通过硅基质从溶液中捕获 DNA 并且用缓冲液洗 脱 DNA。使用包括 QIAamp 病毒 RNA 试剂盒的 QIAcube 自动机械 ( 二者都来自 Qiagen， 希尔 登， 德国 ) 用于提取。因此， 将样品、 裂解缓冲液和载体 RNA 混合并。

40、且温育 10 分钟。将乙醇 加入到每支管中并且用样品 - 乙醇溶液装载 QIAamp 病毒 RNA 试剂盒的柱并且离心。之后 将不同的洗涤溶液施加到柱上， 并且再次离心柱。将洗脱缓冲液施加到柱之后， 离心两次。 0097 使用 LightCycler 2.0( 罗氏诊断公司， 曼海姆， 德国 ) 用于 DNA 的定量。在表 1 中概述了 PCR 参数。 0098 表 1:PCR 参数 0099 0100 0101 在操作过程中用与 DNA 单链结合的染料标记 DNA 链。在扩增过程中荧光的增加与 DNA 的量成比例。 0102 HCP 0103 用血清白蛋白和链霉抗生物素的混合物包被微量滴定板。

41、孔的壁。 用来源于山羊的 说 明 书 CN 102791726 B 9 8/14 页 10 抗 HCP 的多克隆抗体结合微量滴定板孔的壁。洗涤步骤之后， 将微量滴定板的不同孔和不 同浓度的 HCP 校准序列以及样品溶液一起温育。温育后， 通过用缓冲液洗涤除去未结合的 样品物质。 为检测， 将孔与抗体过氧化物酶缀合物一起温育以检测结合的宿主细胞蛋白质。 通过与 ABTS 温育并且在 405nm 检测来测定固定的过氧化物酶活性。 0104 SEC 0105 在 ASI-100HPLC 系统 (Dionex,Idstein, 德国 ) 上用 Tosoh Haas TSK3000SWXL 柱 进行层析。

42、。通过 UV 二极管阵列检测器 (Dionex) 在 280nm 监测洗脱峰。将浓缩的样品溶解 至 1mg/ml 之后， 用 200mM 磷酸二氢钾和 250mM 氯化钾组成的 pH 7.0 的缓冲液洗涤柱体， 直 到达到了稳定的基线。在等浓度的条件下使用 0.5ml/ 分钟的流速进行分析运行， 在室温下 运行 30 分钟以上。用 Chromeleon(Dionex,Idstein, 德国 ) 手动积分层析谱。 0106 IEC 0107 用离子交换层析分析了蛋白质的电荷异质性。在 Dionex Chromeleon HPLC 系统 上使用了阳离子交换 Dionex ProPac 层析柱。 0。

43、108 蛋白质的测定 0109 使用层析方法定量样品中存在的抗体的量。使用与抗体的 Fc 区结合的 Poros A 柱。抗体与柱结合并且其随后通过低 pH 条件洗脱。通过测定 280nm 和参照波长 320nm 处 的光密度 (OD)， 使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数， 确定蛋白质浓度。 0110 实施例 2 0111 方案 0112 从各个分泌抗体的细胞系的培养基中直接获得样品。在除去细胞和细胞碎片后， 将培养上清液分成每份 200ml 的几个等分试样并且通过加入 10% 或 20%( 体积 / 体积 ) 的 乙酸将 pH 值分别调整到 pH4.0、 pH5.0 和 pH6.0。如果需。

44、要， 将参照的等分溶液的 pH 值调 整到接近 pH7。将这些等分溶液贮存在 4 C 并且在 2、 24 和 48 小时之后从每种等分溶液 中取样。 0113 在贮存过程中在不同的 pH 值下观察到沉淀形成的不同水平。通过沉积除去沉淀。 或者， 通过过滤或者离心可以分离沉淀。 0114 除去沉淀之后， 将澄清的液相用于宿主细胞DNA含量、 宿主细胞蛋白质(HCP)含量 和蛋白质量的分析。 0115 表 2: 用本文报导的方法获得的抗 -EGFR 抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含量。 0116 0117 表 3: 用本文报导的方法获得的抗 -EGFR 抗体发酵培养上清液中的宿主细胞蛋白。

45、 质含量。 说 明 书 CN 102791726 B 10 9/14 页 11 0118 0119 表 4: 用本文报导的方法获得的抗 -EGFR 抗体发酵培养上清液中的抗体含量。 0120 0121 表 5: 用本文报导的方法获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含量 ( 第 1 个数据集 )。 0122 0123 表 5a: 用本文报导的方法获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含量 ( 第 2 个数据集 )。 0124 0125 表5b:用本文报导的方法获得的抗-PLGF抗体发酵培养上清液的沉淀中的宿主细 胞 DNA 含量 ( 第 2 个数。

46、据集 )。 说 明 书 CN 102791726 B 11 10/14 页 12 0126 0127 表 6: 用本文报导的方法获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清液中的宿主细胞蛋白 质含量 ( 第 1 个数据集 )。 0128 0129 表6a:用本文报导的方法获得的抗-PLGF抗体发酵培养上清液中的宿主细胞蛋白 质含量 ( 第 2 个数据集 )。 0130 0131 表6b:用本文报导的方法获得的抗-PLGF抗体发酵培养上清液的沉淀中的宿主细 胞蛋白质含量 ( 第 2 个数据集 )。 0132 0133 表 7: 用本文报导的方法获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清液中的抗体含量 ( 。

47、第 1 个数据集 )。 说 明 书 CN 102791726 B 12 11/14 页 13 0134 0135 表 7a: 用本文报导的方法获得的抗 -PLGF 抗体发酵培养上清液中的抗体含量 ( 第 2 个数据集 )。 0136 0137 表 8: 用本文报导的方法获得的抗 -P- 选择素抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含量 ( 第 1 个数据集 )。 0138 0139 表8a:用本文报导的方法获得的抗-P-选择素抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含量 ( 第 2 个数据集 )。 0140 0141 表8b:用本文报导的方法获得的抗-P-选择素抗体发酵培养上清液的沉淀中的宿。

48、 主细胞 DNA 含量 ( 第 2 个数据集 )。 说 明 书 CN 102791726 B 13 12/14 页 14 0142 0143 表 9: 用本文报导的方法获得的抗 -P- 选择素抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 蛋白质含量 ( 第 1 个数据集 )。 0144 0145 表9a:用本文报导的方法获得的抗-P-选择素抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 蛋白质含量 ( 第 2 个数据集 )。 0146 0147 0148 表9b:用本文报导的方法获得的抗-P-选择素抗体发酵培养上清液的沉淀中的宿 主细胞蛋白质含量 ( 第 2 个数据集 )。 0149 说 明 书 CN 102791726 。

49、B 14 13/14 页 15 0150 表10:用本文报导的方法获得的抗-P-选择素抗体发酵培养上清液中的抗体含量 ( 第 1 个数据集 )。 0151 0152 表 10a: 用本文报导的方法获得的抗 -P- 选择素抗体发酵培养上清液中的抗体含 量 ( 第 2 个数据集 )。 0153 0154 表 11: 用本文报导的方法获得的抗 -HER3 抗体发酵培养上清液中的宿主细胞 DNA 含量。 0155 0156 表 11a: 用本文报导的方法获得的抗 -HER3 抗体发酵培养上清液的沉淀中的宿主 细胞 DNA 含量。 0157 0158 表12:用本文报导的方法获得的抗-HER3抗体发酵培养上清液中的宿主细胞蛋白 说 明 书 CN 102791726 B 15 14/14 页 16 质含量。 0159 0160 表 12a: 用本文报导的方法获得的抗 -HER3 抗体发酵培养上清液的沉淀中的宿主 细胞蛋白质含量。 0161 0162 表 13: 用本文报导的方法获得的抗 -HER3 抗体发酵培养上清液中的抗体含量。 0163 说 。