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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610008132.8 (22)申请日 2016.01.07 C12N 15/57(2006.01) C12N 9/74(2006.01) C12Q 1/37(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 贺兰 赵俊龙 喻龙 何军伟 何沛 黄源 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 徐绍新 (54) 发明名称 东方巴贝斯虫凝血酶素基因 1 及其编码的蛋 白 (57) 摘要 本发明公开了一种东方巴贝斯虫凝血酶素基 因1， 该基。
2、因具有如SEQ ID NO ： 1所示的核苷酸序 列。本发明还公开了编码所述东方巴贝斯虫凝血 酶素基因 1 的重组蛋白， 该重组蛋白具有如序列 表 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列。该重组蛋白 可有效检测感染东方巴贝斯虫的水牛的抗原的存 在， 具有良好的反应原性， 是开发检测东方巴贝斯 虫病血清学诊断方法的候选因子， 有助于控制水 牛的巴贝斯虫病在我国的流行和传播。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图2页 CN 105524935 A 2016.04.27 CN 105524935 A 1。
3、.东方巴贝斯虫凝血酶素基因1， 该基因具有如SEQIDNO： 1所示的核苷酸序列。 2.权利要求1所述的东方巴贝斯虫凝血酶素基因1所编码的重组蛋白， 该重组蛋白具有 如序列表SEQIDNO： 2所示的氨基酸序列。 3.权利要求2所述重组蛋白在制备东方巴贝斯虫病检测试剂盒中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524935 A 2 东方巴贝斯虫凝血酶素基因1及其编码的蛋白 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及一个新基因及其重组蛋白， 具体是指东方巴贝 斯虫凝血酶素基因1及其编码的重组蛋白， 本发明还涉及重组蛋白的应用。 背景技术 0002 水牛巴贝斯虫病(Babesi。
4、osis)是由东方巴贝斯虫(Babesiaorientalis)寄生于 水牛的红细胞引起的以高热、 贫血、 黄疸和血红蛋白尿为临床特征的蜱传性血液原虫病。 该 病在我过南方的湖北、 福建、 江西、 安徽、 江苏、 浙江、 湖南、 广西、 云南、 贵州等省份广泛流 行， 对水牛养殖业和农业生产造成严重影响。 东方巴贝斯虫自1984年首次报道以来， 其传播 和流行呈扩散趋势， 分析其原因主要有以下三点： 首先， 动物一旦感染巴贝斯虫， 便终生带 虫， 虫体在动物体内长期存在， 一旦动物抵抗力低下或应激情况下即表现严重的临床症状； 其次， 东方巴贝斯虫的传播媒介镰形扇头蜱是三宿主蜱， 一年发生一代，。
5、 该蜱可经卵传播东 方巴贝斯虫， 据文献报道， 阳性蜱可传播东方巴贝斯虫30代以上； 第三， 由于近年来交通运 输越来越发达， 在一定程度上增加了东方巴贝斯虫病的传播和流行； 第四， 随着近年来肉牛 养殖业的发展， 大量非流行区的牛进入东方巴贝斯虫流行区育肥， 而这些牛几乎100发 病。 0003 综合以上可看出， 一旦某区域成为疫区， 东方巴贝斯虫病便难以根治和清除， 因此 要控制该病的传播和流行， 诊断和疫苗尤为重要。 到目前为止， 东方巴贝斯虫病的检测没有 诊断试剂盒。 因而筛选、 鉴定具有良好免疫原性和反应原性的东方巴贝斯虫抗原便是解决 途径之一。 发明内容 0004 本发明的第一个目。
6、的是从东方巴贝斯虫中获得凝血酶素基因1。 0005 本发明的第二个目的是将所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1在大肠杆菌表达系统 中高效表达获得重组蛋白。 0006 本发明的第三个目的是提供上述重组蛋白在制备东方巴贝斯虫病的检测试剂盒 中的应用。 0007 (1)本发明所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的获得： 利用聚合酶链式反应(PCR) 的方法， 以东方巴贝斯虫总RNA为模板， 反转录成cDNA， 经PCR得到东方巴贝斯虫凝血酶素基 因1， 其核苷酸序列的开放阅读框(ORF)如序列表SEQIDNO： 1所示。 0008 (2)编码了所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组蛋白， 其氨基酸序列如序列表 S。
7、EQIDNO： 2所示。 0009 (3)所述重组蛋白， 其制备方法为： 将序列表SEQIDNO： 1所示的东方巴贝斯虫凝 血酶素基因1开放阅读框(ORF)与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pE-SUMO-TRAP1， 电 转化至BL21中， 抗生素氨苄青霉素筛选高抗性的转化子， 并用0.8mmol/LIPTG于37诱导 4h。 收集上述IPTG诱导表达的菌液， 对其进行分离纯化的蛋白即为编码了东方巴贝斯虫凝 说明书 1/6 页 3 CN 105524935 A 3 血酶素基因1的重组蛋白。 0010 (4)重组蛋白纯化处理， 按上述方法诱导表达1000ml菌液， 将表达的菌液转移到离 心管于。
8、4条件下8000r/min离心10min集菌。 取30mLHis-bindingbuffer(PH7.8)重悬菌体 沉淀后， 使用压力破碎仪破碎(3次)； 4， 10000r/min离心5min， 弃沉淀， 收集上清， 微滤后， 用镍亲和层析柱(GE)纯化， 纯化步骤同说明书。 0011 (5)Westernblot方法检测重组表达蛋白的反应原性将纯化的重组蛋白进行 SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上， 分别以东方巴贝斯虫水牛阳性血清和健康水牛血清做一 抗、 HRP标记的兔抗牛IgG为二抗进行Westernblot分析。 0012 (6)本发明获得的重组蛋白具有生物活性， 具有良好的反应原性。
9、。 采用该重组蛋白 进行Westernblot， 分别与感染东方巴贝斯虫的水牛阳性血清和未感染的阴性血清反应， 结果表面仅阳性血清有特异性的反应带， 阴性血清无反应， 可有效检测东方巴贝斯虫病的 抗原。 因此， 该重组蛋白可应用于制备东方巴贝斯虫病检测试剂盒等相关应用。 0013 本发明的有益效果： 0014 本发明涉及的编码了东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组蛋白可有效检测感染水 牛血液中的东方巴贝斯虫病抗原的存在， 具有良好的反应原性， 是开发检测东方巴贝斯虫 病血清学诊断方法的候选因子， 有助于控制水牛的巴贝斯虫病在我国的流行和传播。 附图说明 0015 图1为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1扩。
10、增电泳图。 1： 表达引物从pMD-19T-TRAP1质 粒中扩增目的基因； 2： 克隆引物从东方巴贝斯虫总cDNA中扩增目的基因； M： DNA分子量标准 (购自大连宝生物)。 0016 图2为本发明重组质粒酶切产物电泳图。 1： 表达引物扩增产物酶切后的TRAP1目的 片段； 2， 3： pE-SUMO-TRAP1单酶切后产物； M： DNA分子量标准。 0017 图3为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结 果。 1： IPTG诱导的pE-SUMO-TRAP1表达产物； 2： 未诱导的pE-SUMO-TRAP1； M： 蛋白质分子质量 标准。 0018 。
11、图4为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组表达产物提取的SDS-PAGE电泳结果。 1： 表达菌裂解液的上清； 2： 表达菌裂解液的包涵体； M： 蛋白质分子质量标准。 0019 图5为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1纯化后的重组表达产物的SDS-PAGE电泳结果。 1： 纯化后的重组表达产物； M： 蛋白质分子质量标准。 0020 图6为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1重组蛋白的Westernblot鉴定。 1： 重组蛋白与 东方巴贝斯虫阳性血清反应； 2： 重组蛋白与健康水牛血清反应； M： 蛋白质分子质量标准。 具体实施方式 0021 下面结合实施例对本发明进行详细说明。 0022 实施例1： 东方巴贝。
12、斯虫的纯化 0023 将新鲜染虫红细胞(染虫率约510)装入一灭菌的无RNase的离心管中， 低速离 心(3000rpm)5min， 收集血细胞并去除上清与血细胞之间的白色絮状物(白细胞)； 加入血细 胞3倍体积的1xPBS， 摇匀， 3000rpm离心5min， 收集血细胞， 重复此操作1次直至上清无色透 说明书 2/6 页 4 CN 105524935 A 4 明； 加入2倍体积的红细胞裂解液， 摇匀， 室温静置10min， 10000rpm离心7min， 收集沉淀； 加 入3倍体积的1xPBS， 摇匀， 10000rpm离心7min， 收集沉淀， 重复此步骤直至上清无色透明； 沉 淀用灭。
13、菌的无RNase的PBS洗一次， 加入1/10体积的灭菌无RNase的PBS溶， 此即为纯化的无 白细胞的东方巴贝斯虫体。 0024 实施例2： 东方巴贝斯虫总RNA的提取 0025 所有提取RNA用的器皿均用0.1DEPC水处理， 150烘烤4h； 塑料器皿经0.1 DEPC水浸泡过夜， 121高温高压灭菌20min； 金属用具经1mol/L的NaOH浸泡2h， 经0.01的 DEPC水彻底冲洗后， 37烘干； 各试剂用无核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)的0.01 DEPC水配置。 取150 L上述方法纯化的东方巴贝斯虫提取RNA。 总RNA抽提按Trizol试剂的说 明书。
14、进行。 提取的总RNA样品冻存于-80， 备用。 0026 实施例3： 东方巴贝斯虫总cDNA的合成 0027使用TaKaRa公司的ReverseTranscriptase反转录试剂盒， 以提取 的东方巴贝斯虫总RNA为模板进行反转录， 具体操作步骤为： 0028 在Microtube中配制下列混合液 0029 0030 在PCR仪上进行下列条件的变性、 退火反应： 0031 655min 冰上急冷 0032 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。 0033 0034 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应： 0035 3010min 0036 0037 4230-60min 003。
15、8 0039 955min(酶失活)处理后， 冰上放置。 0040 反转录所得的cDNA放-20保存备用。 0041 实施例4： 东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的克隆及序列分析 说明书 3/6 页 5 CN 105524935 A 5 0042 1)引物设计 0043 根据NCBI/GenBank上已登录顶器门寄生虫的凝血酶素基因1的序列信息， 根据序 列的保守性， 用Primer5.0软件在cDNA序列开放阅读框(ORF)的上下游区域， 设计一对引物 (TRAP1-F1， TRAP1-R1)； TRAP1-F1： 5 -ATGATACCGTTTTACGCAATCTG-3 ； TRAP1-R1： 。
16、5 - TCAACTACTACGTGCAATATTTAT-3 。 0044 2)PCR扩增： 以东方巴贝斯虫cDNA为模板进行PCR扩增， 反应体系为25 L， PCR反应 体系如下： 0045 0046 PCR反应条件： 反应条件为955min； 9430sec， 5790sec， 7245sec； 72 10min； 35个循环周期。 0047 3)PCR产物鉴定： 扩增完成后， 取PCR产物5 L用6核酸上样缓冲液点样， 1.0琼 脂糖凝胶， 1TAE缓冲液， 120V， 电泳20分钟观察结果， 得到约1347bp左右的PCR产物(见图 1)。 0048 4)目的基因的克隆、 筛选与测序。
17、 0049 取pMD19-T载体1 L(50ng/uL)与胶回收的目的片段3 L混合后， 加入6 L溶液I， 混 匀后置16连接过夜。 取10 L连接产物， 无菌条件下加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中， 用 移液器温和反复吹打混匀， 冰浴放置30min。 42水浴， 热激90s， 之后立即冰浴3min使之冷 却， 注意不要晃动。 转移菌液至装有500 L预热至37的LB培养液中， 150rpm37温和振荡 45min， 使细菌恢复抗药性。 向含氨苄青霉素(AMP)(100 g/mL)的LB琼脂平板上加入40 LX- gal(20mg/mL)、 4 LIPTG(200mg/mL)， 均匀涂布，。
18、 37放置半小时后， 取150 L菌液涂布于平 板上。 倒置平皿于37恒温培养箱培养1216h， 置于4使蓝色充分显现， 挑白色菌落接种 于含150 g/mLAMP的LB培养液中， 剧烈振摇(230rpm)1216h后鉴定。 将PCR扩增为阳性的 克隆， 取菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序分析， 得到1347bp的cDNA序列， 该 基因有完整的开放阅读框(ORF)， 其开放阅读框的序列如序列表SEQIDNO： 1所示的序列。 0050 序列号： SEQIDNO： 1 0051 序列长度： 1347bp 0052 序列类型： cDNA 0053 来源： 东方巴贝斯虫 0054 序列特。
19、征： 有正确的开放阅读框(ORF)： 1347bp； 决定位置： 起始、 终止密码子存在 位置： ATG， 1位； TGA， 1347位。 0055 5)上述步骤4所得序列ORF全长1347bp， 编码蛋白质具有如序列表SEQIDNO： 2所 示的氨基酸序列。 该蛋白质含有448个氨基酸， 分子量为50KD。 利用美国国家生物技术信息 说明书 4/6 页 6 CN 105524935 A 6 中心( NCBI， NationalCenterforBiotechnologyInformation， http:/ www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAl。
20、ignmentSearchTool)软件对所测 氨基酸序列进行分析。 用DNAstar软件包里的Megalign软件， 通过ClustalW方法比较的不同 物种之间核苷酸序列相似度。 结果表明获得了东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的全长ORF编码 区序列。 0056 实施例5： 重组原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的诱导表达 0057 1)设计方巴贝斯虫凝血酶素基因1的表达引物： 0058 根据东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的ORF序列设计表达引物(TRAP1-F2， TRAP1- R2)， 上游引物加入BsaI酶切位点， 下游引物加入终止密码子(TGA， 注： 互补密码子TCA)和 XbaI酶切位点，。
21、 具体如下： 0059 TRAP1-F2:5 GCGGTCTCGAGGTATGATACCGTTTTTACGAAATCTG3 0060 BsaI 0061 TRAP1-R2:5 CGTCTAGATCAACTACTACGAGCAATATTTTTTTTAGC3 0062 XbaI 0063 2)重组表达质粒的构建 0064 用表达引物(TRAP1-F2， TRAP1-R2)对重组质粒pMD-19T-TRAP1进行PCR扩增， 获得 目的片段用限制性内切酶BsaI和Xba 进行分步双酶切， 同时表达载体pE-SUMO用BsaI酶切， 回收酶切产物， T4连接酶16连接过夜， 转化大肠杆菌TOP10， 。
22、构建真核重组表达质粒pE- SUMO-TRAP1， 经北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序鉴定， 确定该基因已正确插入到表达 载体pE-SUMO中(见图2)。 0065 3)pE-SUMO-TRAP1表达载体构建及阳性克隆子鉴定 0066 将pE-SUMO-TRAP1质粒(1 L)无菌条件下加入大肠杆菌BL21感受态细胞(100 L)， 用移液器温和反复吹打混匀， 冰浴放置30min。 42水浴， 热激90s， 之后立即冰浴3min使之 冷却， 注意不要晃动。 转移菌液至装有500 L预热至37的LB培养液中， 150rpm37温和振 荡45min， 使细菌恢复抗药性， 取150 L菌液涂布于含有。
23、氨苄青霉素(AMP)(100 g/mL)的LB琼 脂平板上。 倒置平皿于37恒温培养箱培养1216h， 挑单个菌落接种于含150 g/mLAMP的 LB培养液中， 剧烈振摇(230rpm)1216h后鉴定。 同时转化未加入任何外源基因的pE-SUMO 空载体。 0067 取1ul菌液做PCR， 反应体系为25ul， 如下： 0068 说明书 5/6 页 7 CN 105524935 A 7 0069 PCR反应条件： 反应条件为955min； 9430sec， 5790sec， 7245sec； 72 10min； 35个循环周期。 0070 扩增为阳性的克隆子， 取菌液送北京奥科鼎盛生物科技。
24、有限公司， 进行测序分析， 得到1347bp的cDNA序列， 该基因有完整的开放阅读框(ORF)， 其开放阅读框的序列如序列表 SEQIDNO： 1所示的序列。 0071 4)pE-SUMO-TRAP1重组蛋白的原核表达 0072 按1： 100将上述阳性pE-SUMO-TRAP1/BL21(DE3)菌液加入含有AMP的LB培养基， 37 ， 200rpm培养至OD600为0.6左右， 加入0.8mmol/LIPTG于37诱导4h(图3)。 收集大量诱导 表达的菌液， 在4以4000g离心15min， 弃上清， 加入30mlHis-bindingbuffer(pH7.8)重 悬菌体沉淀后， 压。
25、力破碎3次； 然后4， 10000r/min离心5min， 弃沉淀， 收集上清， 微滤后即 为重组表达的粗蛋白(图4)。 0073 5)重组蛋白的纯化 0074 用镍亲和层析柱(GE)纯化， 纯化步骤同说明书， 具体如下： 0075 用5-10倍体积的HIS-bindingBuffer平衡NI亲和层析柱。 0076 上样 0077 将破碎离心后的上清成份微滤后上样， 一般重复上样3次， 每上一次保留50ul溶液 (便于检测滤过液中是否还有目的蛋白存在)， 每一次上样间隙的蛋白溶液都需要微滤处 理。 0078 洗涤 0079 用5-10倍柱体积的HIS-bindingBuffer洗涤亲和层析柱，。
26、 并收集流出液。 0080 洗脱 0081 用不同浓度的咪唑梯度洗脱目的蛋白， 咪唑(初始浓度为400Mm)用HIS-binding Buffe配制， 从低浓度往高浓度洗脱， 其中咪唑浓度为320mM时的蛋白为单一的目的条带(图 5)， 收集此时的洗脱蛋白透析并浓缩。 0082 洗脱结束后， 用100咪唑溶液洗脱多遍， 并用HIS-bindingBuffer冲洗NI亲和 层析柱。 加入20乙醇， 4保存NI亲和层析柱至下次使用。 0083 实施例6： 重组蛋白反应原性的鉴定 0084 将纯化后的重组蛋白先进行SDS-PAGE电泳， 然后在50V电压下转移到NC膜上， 3h后 将NC膜用TBST。
27、-5脱脂奶粉封闭1h， TBST洗3次， 每次5min； 分别将NC膜放入1:100稀释的东 方巴贝斯虫水牛阳性血清和健康水牛血清中， 室温孵育1h， TBST洗3次， 每次5min； 加入二抗 (1:5000稀释的兔抗牛IgG)， 室温孵育1h， TBST洗3次， 每次5min后， 加入BCL显色。 Western blot结果表明， 纯化后的重组蛋白TRAP1在66kDa(TRAP1大小50kDa， pE-SUMO载体的标签 16kDa)与东方巴贝斯虫阳性的水牛血清有特异性反应， 但与健康水牛血清无反应(见图6)。 说明书 6/6 页 8 CN 105524935 A 8 0001 0002 序列表 1/3 页 9 CN 105524935 A 9 0003 序列表 2/3 页 10 CN 105524935 A 10 序列表 3/3 页 11 CN 105524935 A 11 图1 图2 图3 图4 图5 说明书附图 1/2 页 12 CN 105524935 A 12 图6 说明书附图 2/2 页 13 CN 105524935 A 13 。