技术领域
本发明涉及小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
铁元素是植物生长必需的营养元素之一。植物缺铁会引起叶片黄化、早衰、光合作用下降等现象，严重者造成作物产量与品质下降。农业生产缺铁是一个世界性的问题，世界各国都有大量有关植物缺铁的报道。因此，需要发展有效的抗缺铁的办法。
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与植物耐缺铁相关的蛋白，名称为MxVHA-c，来源于苹果属小金海棠（Malus xiaojinensis），是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由（a）衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由166个氨基酸残基组成。
为了使1）中的MxVHA-c便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述2）中的MxVHA-c可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2）中的MxVHA-c的编码基因可通过将序列表中序列2的自5′末端第1-498位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因具体可为如下1）-4）中任一所述的基因：
1）序列表中序列2自5’末端起第1位-498位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
上述序列表中的序列2由498个核苷酸组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第1-498位脱氧核苷酸，编码的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
含有所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体是在pYES2.0载体的多克隆位点间插入所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种获得重组酵母菌的方法。
本发明所提供的获得重组酵母菌的方法，为如下1）或2）所示：
1）将与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因导入出发酵母菌中，得到V型H+-ATPase酶活性增高的重组酵母菌；
2）将与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因导入出发酵母菌中，得到耐Cd2+毒害能力增强和/或耐缺铁能力增强的重组酵母菌。
所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因是通过酵母表达载体导入出发酵母菌中。
所述出发酵母菌为野生型酵母菌株BJ2168（Saccharomyces cerevisiae）。
根据所述方法获得的重组酵母菌也属于本发明的保护范围。
上述任一所述蛋白或其编码基因在培育耐缺铁植物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的又一个目的是提供一种培育耐缺铁能力增强的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育耐缺铁能力增强的转基因植物的方法，是将上述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐缺铁性能增强的转基因植物。
所述出发植物为双子叶植物，具体为拟南芥。
本发明所提供的小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因MxVHA-c对于缺铁胁迫的植株来说有很重要的调节作用，本发明所用的材料小金海棠在是一种耐缺铁的植株，它是一种典型的机理Ⅰ植物，即：植物必须可以通过激活质膜上的H+-ATPase，使土壤酸化，增加铁的可溶性。然后在三价铁还原酶的作用下将三价铁还原成二价铁，在质膜上的二价铁转运蛋白的作用下转运进细胞质中，增加植株的耐缺铁性。
本发明所提供的MxVHA-c基因对于缺铁胁迫的植株具有很重要的调节作用，本发 明为进一步研究小金海棠的耐缺铁性提供了很好的理论依据。
附图说明
图1为MxVHA-c基因的PCR扩增产物结果。
图2为不同铁处理水平下MxVHA-c基因在小金海棠不同器官中的荧光定量PCR结果。
图3为MxVHA-c基因瞬时表达载体pEZS-MxVHA-c的酶切鉴定结果。
图4为MxVHA-c基因的亚细胞定位检测结果。
图5为酵母表达载体pYES2.0-MxVHA-c-GFP的酶切结果。
图6为转基因酵母的PCR鉴定结果。
图7为转基因酵母中V型H+-ATPase酶活的测定。
图8为转基因酵母在40μM Ferrozine处理情况下的生长情况。
图9为转基因酵母在10μM CdCl2处理情况下的生长情况。
图10为转基因株系的PCR鉴定
图11为转基因拟南芥在缺铁情况下的生长情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与植物耐缺铁相关蛋白MxVHA-c及其编码基因的获得
一、MxVHA-c基因全长的获得
以小金海棠（Malus xiaojinensis）（公众可从中国农业大学获得，记载过该小金海棠的非专利文献是：成明昊，李晓林，张云贵，苹果优良砧木资源-小金海棠，西南农业大学学报，2000年10月，22（5）：383-386）为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以引物F1（序列表中序列3）和引物R1（序列表中序列4）为引物对：
引物F1：AAAGAATTCATGTCTTCTTCAACCTTC，下划线部分表示酶切位点EcoRI，
引物R1：AAAGTCGACCCCTCAGCTCTTGACTGACC，下划线部分表示酶切位点SalI，
进行PCR扩增，反应体系中使用高保真的HiF mix，以确保扩增的特异性。PCR扩增反应体系如下：
PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃变性40S，58℃退火40S,72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中A所示，其中，泳道M为2000bp的DNA分子量标准，泳道1和泳道2为PCR扩增产物。结果表明得到498bp的目的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pEASY-T1 sample-Vector Kit载体试剂盒（购自全式金生物公司）说明书将PCR产物连接到载体pEASY-T1 sample（购自全式金生物公司）上，经SalI和EcoRI酶切验证后进行测序。酶切验证结果如图B所示：泳道M为15000bp的DNA分子量标准，泳道1为酶切验证的产物。测序结果表明，PCR扩增产物序列全长为498bp，其核苷酸序列如序列表中序列2的自5′末端第1-498位核苷酸所示，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中序列1由166个氨基酸残基组成。将该基因命名为MxVHA-c，将该基因编码的蛋白命名为MxVHA-c。
二、小金海棠不同器官中MxVHA-c基因的表达分析
将小金海棠组培苗在生长培养基(MS＋0.5mg/L IBA+0.2mg/L 6-BA)中培养，待其生长到茎木质化后，转移至生根培养基(1/2MS+1.0mg/L IBA)，组培苗生出白色根后，移至1/2全营养液（组成见表2，初始pH值用NaOH调至6.0）中覆膜保湿培养2周，之后转入全营养液（组成见表1，初始pH值用NaOH调至6.0）培养一个月，每周换一次全营养液，培养条件为：光照培养16小时（光量子通量密度250μE·M-2·S-1），温度为25±2℃；黑暗培养8小时，温度为17±2℃。之后进行缺铁诱导，方法为：将植株从全营养液中转至含4μM Fe营养液（组成见表3，初始pH值用NaOH调至6.0），转移前去离子水冲洗。
表1全营养液的配方
表21/2全营养液的配方
表3含4μM Fe营养液的配方
分别提取正常供铁（Hoagland营养液+40μM Fe-EDTA）及低铁处理（Hoagland营养液+4μM Fe-EDTA）0、12h、1d、3d、6d和9d的小金海棠幼根、成熟叶的总RNA，紫外分光光度计分别测定不同器官、不同处理的RNA的含量，取等质量的上述RNA，反转录成单链cDNA。以该单链cDNA为模板，先以18s基因作为内参，使用18s引物：
18SR-F：5′-ACACGGGGAGGTAGTGACAA-3′，
18SR-R：5′-CCTCCAATGGATCCTCGTTA-3′，
进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳结果，调整不同处理模板的用量，使各个处理18s的PCR扩增产物亮度一致。不同处理模板用量确定后，进行MxVHA-c3基因的扩增。MxVHA-c基因扩增的引物为：RT-F1和RT-R1，
RT-F1：GGTAGTTATGGCGGGAGTGTTGGGT，
RT-R1：GGTAATAGGACTTAGCCTTGGGGTT，
首先用普通的Taq酶进行RT-PCR的验证，根据引物合成的退后温度，进行扩增。反应体系如下：
反应条件为：95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；引物确定之后用荧光定量PCR仪测定基因在不同缺铁情况下的表达情况，试验中用18s做内参。荧光定量PCR两步法的步骤为：95℃预变性30s,然后95℃变性5s，55℃退火30s,72℃延伸30s，共40个循环；最后95℃15s，60℃1min，95℃15s。
RT-PCR扩增结果如图2所示，结果表明：MxVHA-c基因在根、成熟叶中都有表达，且在根中的表达量比在叶中的表达量略高。在缺铁12h内根中基因的表达量明显的增强，之后表达量下降并出现一系列的波动性。在叶子中随着处理时间的增加，基因的表达量增强，到第3天时达到最高，之后表达量下降。实验结果还可以表明短时间和长时间缺铁处理根中MxVHA-c基因会上调表达，缺铁处理1-3d之内叶子中的MxVHA-c基因会上调表达。说明如果长时间受缺铁胁迫，植株是通过调节根部的MxVHA-c基因来增加抗缺铁的适应性的。
三、MxVHA-c基因的亚细胞定位
1、MxVHA-c基因与GFP融合的瞬时表达载体的构建
以上述缺铁处理12h的小金海棠根部的cDNA为模板，使用引物F1（序列表中序列3）和R1（序列表中序列4）进行PCR扩增获得MxVHA-c基因全长序列（去除了终止密码子的MxVHA-c开放阅读框），并将其克隆进pEASY-T1 sample载体中，经SalI和EcoRI酶切后再克隆进pEZS-NL载体（购自全式金生物技术有限公司）中构建瞬时表达载体pEZS-MxVHA-c。pEZS-MxVHA-c转化大肠杆菌DH5ɑ菌株，挑取阳性斑进行菌落PCR、酶切鉴定和测序验证，酶切鉴定结果如图3所示，其中，泳道M为15000bp的DNA分子量标准，泳道1为瞬时表达载体pEZS-MxVHA-c的酶切鉴定效果图。对鉴定结果为阳性的菌斑摇菌，提取质粒进行测序验证。测序结果表明，在pEZS-NL载体的SalI和EcoRI酶切位点间插入了序列表中序列2自5′末端第1-498位所示的核苷酸序列，说明瞬时表达载体pEZS-MxVHA-c构建正确。
2、采用基因枪法进行表达载体向洋葱表皮细胞的转化
（1）待转化洋葱表皮的制备
在无菌条件下，撕下洋葱的内表皮，平铺于含有MS培养基的培养皿中，然后将培养皿用锡箔纸包好备用。
（2）金粉悬浮液的制备
称取60mg金粉，放入1.5ml灭菌的离心管中，加入1ml无水乙醇，震荡1min，10000rpm离心10s，弃上清，再加入1ml无水乙醇，震荡1min，10000rpm离心10s；弃上清，将金粉悬于1ml无菌水中，获得金粉悬浮液，-20℃保存备用。
（3）金粉-质粒DNA复合体的制备
吸取8.5μl上述步骤2制备的金粉悬浮液、3.5μl 0.1M亚硝胺、8.5μl 2.5M CaCl2·2H2O和5μl上述步骤（1）获得的瞬时表达载体pEZS-MxVHA-c，将混合物在震荡器上振荡3min；10000rpm离心20s；弃上清，用无水乙醇漂洗3次；加入30μl无水乙醇悬浮，获得金粉-质粒DNA复合体备用。
（4）轰击受体材料
选用一定压力的压力膜，与轰击膜一起在70%的无水乙醇中浸泡1-2小时，取出晒干；金属档板用70%的无水乙醇浸泡后在酒精灯上灭菌；取10μl上述步骤3制备好的金粉-质粒DNA复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，涂布的面积与载体固体圈上的孔径范围一致；将膜晒干后，安装到发射装置上；将压力膜安装到气体加速器的下端；洋葱表皮细胞置于培养皿的中部，放入真空室内，取下培养皿盖；抽真空指针到26；放气于气体加速器上，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开，气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属档板挡住，而下面的金属颗粒却透过金属档板的网孔，射向靶细胞。
（5）荧光观察
将培养皿用Parafilm封好，28℃培养24h，在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达，采用同样的方法处理对照质粒pEZS-NL。具体结果如图4所示。其中，A1为经过修饰的对照质粒pEZS-NL明视场照片，A2为经过修饰的对照质粒pEZS-NL暗视场照片，B1为质粒pEZS-MxVHA-c明视场照片，B2为质粒pEZS-MxVHA-c暗视场照片。结果表明，MxVHA-c主要定位于液泡膜上。
实验例2、转基因酵母的获得及其耐重金属毒害作用的分析
一、克隆得到的MxVHA-c基因转化酵母
分别用EcoRI和XbaI酶切pEZS-MxVHA-c、pEZS-NL和酵母表达载体pYES2.0的质粒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），分别胶回收，分别得到1218bp的MxVHA-c-GFP和720bp的GFP，连接到经酶切后的pYES2.0上，得到重组表达载体pYES2.0-MxVHA-c-GFP和pYES2.0-GFP，后者可作为阳性对照。
将重组表达载体pYES2.0-MxVHA-c-GFP和pYES2.0-GFP转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，用EcoRI和XbaI酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，得到498bp左右的MxVHA-c基因片段。结果如图5所示，其中泳道M为DL15000bp的DNA分子量标准，泳道1为pYES2.0-MxVHA-c-GFP的酶切结果，结果表明pYES2.0-MxVHA-c-GFP和pYES2.0-GFP为含有MxVHA-c-GFP和GFP基因的表达载体。
首先配酵母生长型培养基（YPD）和缺陷型培养基（SD-Ura-该培养基包括Difco酵母氮碱基6.7g/l、L-Isoleucine 300mg/l、L-Valine 1500mg/l、L-Adenine hemisufate salt200mg/l、L-Arginine HCl 200mg/l、L-Histidine HCl monohydrate 200mg/l、L-Leucine1000mg/l、L-Lysine HCl 300mg/l、L-Methionine 200mg/l、L-Phenylalanine 500mg/l、 L-Threonine 2000mg/l、L-Tryptophan 200mg/l、L-Tyro sine 300mg/l以及质量百分比浓度为40%葡萄糖），然后利用酵母转化试剂盒（北京泛基诺科技有限公司）将含有MxVHA-c-GFP和GFP重组表达载体pYES2.0-MxVHA-c-GFP和pYES2.0-GFP导入野生型酵母菌株BJ2168（公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：Hong Ding,Lihong Duan,Huilan Wu，et al.Regulation of AhFRO1,an Fe(III)-chelate reductase of peanut,during iron deficiency stress and intercropping with maize.Physiologia Plantarum136：274–283.2009）中获得重组菌BJ2168/pYES2.0-MxVHA-c-GFP和BJ2168/pYES2.0-GFP，涂布于缺陷型培养基（SD-Ura-）上，挑取阳性克隆，用引物F1和R1进行菌落PCR鉴定。结果如图6所示：其中，M为DL15000bp Plus的DNA分子量标准，泳道1、2为阴性对照重组菌BJ2168/pYES2.0-GFP，泳道3为重组菌BJ2168/pYES2.0-MxVHA-c-GFP。结果表明，酵母表达载体pYES2.0-MxVHA-c-GFP和pYES2.0-GFP已成功转入酵母菌株BJ2168中。
二、酵母中V型H+-ATPase酶活性的测定
首先利用真菌/酵母细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）提取酵母细胞的液泡膜，提取的膜蛋白利用氢离子膜通道（V型ATP酶）绿色荧光检测试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）来检测酵母的V型H+-ATPase酶活性，如图7所示，转基因的酵母（pYES2.0-MxVHA-c-GFP）的RFU比转空载体对照（pYES2.0-GFP）的低，说明有更多的H+由细胞质内泵到液泡膜内，从而证明了转基因的酵母的V型H+-ATPase酶活性要比转空载的酵母细胞的要高。
三、转基因酵母在缺铁环境中的生存情况
转基因的酵母（pYES2.0-MxVHA-c-GFP）与转空载体对照（pYES2.0-GFP）在含有40μm Ferrozine（-Fe）的YPD培养基中过夜培养，当每管的OD值达到1时开始计时，分别测定-Fe处理0h、12h、24h、48h的OD值。从而对过表达基因的酵母的耐缺铁性分析。结果如图8所示，从图中可见，转基因的酵母（pYES2.0-MxVHA-c-GFP）比转空载体对照（pYES2.0-GFP）的酵母生长的要快，能够在缺铁的培养基中生长，在缺铁处理1d内可以看出过表达基因的酵母的OD值明显高于对照的，说明酵母能忍受缺铁的胁迫。
四、转基因酵母更耐Cd2+毒害
取10ul经过鉴定的菌液加3mlSD-Ura-液体培养基，28℃，200rpm培养过夜。第二天从其中取20ul放到4mlSD-Ura-液体培养基，同时加入Cdcl2使其终浓度为10μM，同时在紫外分光光度仪中测定各管的OD600，各管浓度一致之后28℃，200rpm培养，分别在0h、24h、48h、72h和96h测定各管菌液的浓度（不同时间点测三次）。如图9所示，转空载的酵母（pYES2.0-GFP）的生长量一直呈现下降的趋势，说明10uM Cdcl2 严重影响了酵母细胞的生长。而转MxVHA-c基因的酵母（pYES2.0-MxVHA-c-GFP）能够缓解Cdcl2的毒害作用。
实施例3、转基因植物的获得和鉴定
一、重组表达载体的构建
1、用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切瞬时表达载体pEZS-MxVHA-c，回收酶切产物（约1218bp）。
2、根据35S启动子的序列设计两端分别带有EcoRI和KpnI的引物F3和R3。以酶切瞬时表达载体pEZS-MxVHA-c为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，回收约1000bp PCR扩增产物。
F3：5’-CCGGAATTCCAATCCCACCAAAACCTGA-3’；
R3：5’-TTCGAGCTCCGTGTCCTCTCCAAATGAAA-3’。
3、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切pCAMBIA2300质粒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），回收载体骨架（约8742bp）。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
6、用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切步骤5的重组质粒，回收载体骨架（约10063bp）。
7、将步骤1的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组表达载体pCAMBIA2300-35sMxVHA-c。
二、对照质粒的构建
1、将pEASY-T1 sample用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切，并回收小片段（约109bp）。
2、用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切pEZS-NL载体，回收载体骨架（约5680bp）。
3、将步骤1的小片段和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒。
4、用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切步骤3的重组质粒，回收小片段（约829bp）。
5、同步骤一的2。
6、同步骤一的3。
7、同步骤一的4。
8、同步骤一的5。
9、同步骤一的6。
10、将步骤4的小片段和步骤9的载体骨架连接，得到重组表达载体pCAMBIA2300-eGFP。
三、转基因植物的获得
1、利用冻融法将重组表达载体pCAMBIA2300-35sMxVHA-c导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
2、转化前植株的处理
野生型拟南芥（col-0）植株长至茎高3cm时，去除其顶生花序（以刺激叶生花序的生长），5-7d后（此时叶生花序已长出，其下部的花已经有花粉的出现）进行转化。转化前一天要浇透水，剪掉角果和已开的花。
3、将重组农杆菌接种于5ml YEB液体培养基（含50μg/ml卡那霉素和10μg/ml利福平）中，28℃培养24-36h，以1∶50的体积比转接到200mlYEB培养基中，培养至OD600值为1.2-1.6，4500rpm离心10min收集菌体，用适量渗透培养基（1/2MS+5%的蔗糖+0.02% SilwetL-77）悬浮菌体至OD600值为0.6-0.8，即为菌悬液。
4、转基因拟南芥的获得和筛选
将步骤3的菌悬液倒在小烧杯中，将步骤2的拟南芥的花浸入悬浮液中3-5min，保证莲座叶以上部分浸于悬浮液中（浸泡5min，可见植株上有一层薄膜），将浸泡好的拟南芥植株取出，避光横放16-24h，然后将其放正，绑住松散花芽并培育，得T0代拟南芥植株。将T0代拟南芥植株培育至结实，收获成熟种子即为T1代拟南芥种子。将T1代拟南芥种子播种于1/2MS培养基（含50μg/ml卡纳霉素），4℃春化2-3天，22℃培养，获得25株T1代拟南芥植株。
提取T1代拟南芥植株，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，部分PCR扩增产物的电泳图见图10。其中，M为2000bp Plus的DNA分子量标准，S1-S7为T1代转MxVHA-c PCR结果，WT为野生型拟南芥的PCR结果，把亮带切胶回收，连接到pEASY-T1载体上测序，结果表明S1-S7为T1代转MxVHA-c拟南芥阳性植株,MxVHA-c基因成功转入拟南芥中。采用同样的方法鉴定出共获得20株阳性T1代转MxVHA-c拟南芥。
将T1代转基因拟南芥单株收种，得到T2拟南芥种子，将T2代拟南芥种子培育为植株并进行相同的PCR和测序鉴定，经卡方检验符合3∶1的分离比。
根据T1代植株的测序结果和第2代植株的测序结果，获得10个纯合转基因拟南芥株系（依次命名为1s到10s）。
将纯合转基因拟南芥株系的T2代植株单株收种，获得T3代转基因拟南芥种子。
5、将重组表达载体pCAMBIA2300-eGFP代替重组表达载体pCAMBIA2300-35sMxVHA-c进行步骤1至4的操作，得到T0代转空载体拟南芥、T1代转空载体拟南芥、T2代转空载体拟南芥和T3代转空载体拟南芥。
四、T3代转基因拟南芥在低铁培养基（4uM Fe-EDTA）上生长情况观察
随机选取2个纯合转基因株系（纯合株系S1和纯合株系S2），将2个纯合转基因株系（每个株系10株）的T3代种子、转空载体拟南芥（10株）的T3代种子和野生型拟南芥的种子进行如下鉴定：
将种子在1/2MS培养基上生长一周（种子已萌发）。然后将植株进行如下处理：转基因拟南芥、转空载拟南芥和野生型拟南芥分别移栽到低铁培养基(含有4μM Fe-EDTA的1/2MS培养基)培养。
处理7天后，观察幼苗的生长情况，见图11。在缺铁环境下，转基因拟南芥的生长情况优于转空载体拟南芥和野生型拟南芥，转空载拟南芥和野生型拟南芥的表型基本一致。转基因拟南芥植株能够正常的生长，叶片嫩绿，而转空载体拟南芥和野生型拟南芥的叶片明显出现了黄化现象。结果表明，MxVHA-c基因能够更好的提高植株的耐缺铁胁迫能力。