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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511029598.8 (22)申请日 2015.12.31 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路 155 号中 国疾病预防控制中心传染病所新病原 室 (72)发明人 郝琴 刘炜 张琳 侯学霞 刘慧鑫 万康林 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 用于检测莱姆病螺旋体的 RPA 引物和探针及 检测方。
2、法 (57) 摘要 本发明提供一种用于检测莱姆病螺旋体的 RPA引物和探针， 所述RPA引物基于莱姆病螺旋体 recA基因设计， 引物序列见 Seq ID No:1 和2。 所 述探针根据 RPA 引物设计， 大小为 46-52bp， 探针 的 5 端用 FAM 标记， 3 端进行 C3Spacer 修饰， 且 在探针中间距 5 端 30bp 处进行 dSpacer 或 THF 修饰。本发明还提供含有所述 RPA 引物和探针的 检测试剂盒。本发明进一步提供基于所述 RPA 引 物和探针建立的检测莱姆病螺旋体的 RPA 法。本 发明将 RPA 引物恒温扩增技术与侧流层析试纸联 用， 可从疑似病人。
3、血清中快速准确地检测出莱姆 病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规 PCR 更高， 可对不同致病基因型的莱姆病螺旋体 进行检测， 对莱姆病的早期诊断、 早期治疗等方面 具有重要意义 ； 同时可以免除高昂的仪器投入， 便于基层推广使用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 105524989 A 2016.04.27 CN 105524989 A 1.用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针， 其特征在于， 所述RPA引物基于莱姆病螺 旋体recA基因设计， 引物序列如下： LF-F:5 -A。
4、TTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 LF-R:5 -AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 所述探针根据RPA引物设计， 大小为46-52bp， 探针的5 端用FAM标记， 3 端进行 C3Spacer修饰， 且在探针中间距5 端30bp处进行dSpacer或THF修饰。 2.根据权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 引物和探针序列分别如下： LF-F:5 -ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 LF-R:5 -biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 。
5、LF-P:5 -FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT (C3Spacer)-3 。 3.含有权利要求1或2所述引物和探针的用于RPA法检测莱姆病螺旋体的试剂盒。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括RPA反应管、 反应缓冲 液、 标准阳性模板中的至少一种。 5.用于检测莱姆病螺旋体的RPA法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 使用权利要求1或2所述的引物和探针， 在RPA反应管 中进行RPA扩增反应； 3)分析RPA扩增。
6、产物。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， RPA反应体系以50 l计为： 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， RPA反应条件为： 30-45， 20分钟， 冰上终 止反应。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， RPA反应条件为： 37， 20分钟， 冰上终止反 应。 9.根据权利要求5-8任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤3)中采用Hybridetect2T试 剂盒检测RPA扩增产物。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒中 的缓冲液按1:20的体积比混合， 然后将Hybridetect2T试纸条置于上。
7、述混合液中， 5分钟后 判读结果； 如果试纸条的检测线上出现条带， 而且质控线正常， 则表明该样品中含有莱姆病 权利要求书 1/2 页 2 CN 105524989 A 2 螺旋体， 如果仅是质控线上出现条带， 则表明该样品中不含莱姆病螺旋体。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105524989 A 3 用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针及检测方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学检测领域， 具体地说， 涉及一种用于检测莱姆病螺旋体的 RPA引物和探针及检测方法。 背景技术 0002 莱姆病(Lymedisease)是由伯氏疏螺旋体(Bolreliaburgdorferi)引起的。
8、一种 慢性自然疫源性疾病。 该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在宿主动物与宿主动物及人之间 传播。 莱姆病临床表现初期多有典型皮肤损害-慢性游走性红斑(ECM)， 同时伴有头痛、 发 热、 寒战、 疲乏不适.局部淋巴结肿大等症状， 后期表现为神经系统、 循环系统、 运动系统等 呈间歇性、 交替性出现的各种损害。 具有分布广、 病程长、 病死率较高等特点。 如能早期诊 断、 早期治疗常可痊愈， 否则会出现严重并发症。 因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技 术， 对莱姆病早期诊断、 早期治疗具有重要的意义。 0003 目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。 病原学检测包括 直接镜检法。
9、、 病原分离培养、 多聚酶链反应(PCR)和荧光定量PCR(real-timePCR)； 常用的 特异性抗体检测包括间接免疫荧光抗体法(IFA)、 酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印 迹法(WB)。 0004 直接镜检法需要操作者具备丰富的检验经验， 然而对于混合感染的情况， 则无法 检测到， 而且该法容易漏检， 与其他诊断方法相比， 直接检查的检出率相对较低。 病原分离 培养法的分离率低， 耗时较长， 敏感性差。 IFA只能检测到菌体表面的抗原， 灵敏度和特异性 都比较低， 且IFA受实验因素影响大， 易造成假阳性或假阴性。 ELISA主要对莱姆病特异抗体 IgG进行检测， 传统EL。
10、ISA检测方法， 存在非特异反应， 虽然灵敏度高， 但缺乏特异性， 易误 诊。 WB可以判断和验证IFA和ELISA的真假阳性， 但由于莱姆病螺旋体有不同的致病基因型， 而这几种基因型在世界各地的分布又有所不同， 因此各国应根据实际情况， 制定出针对本 国流行的基因型的WB阳性诊断标准， 而且WB的操作比较复杂， 不利于推广。 PCR技术的不足 之处在于： (1)靶基因易被污染； (2)易出现非特异性扩增； (3)扩增反应易受多种因素的影 响； (4)需要投入比较昂贵的精密仪器(如PCR仪、 凝胶电泳仪及凝胶成像系统)； (5)耗时长， 需要23h的反应时间和12h的电泳时间。 这些均不利于现。
11、场的快速检测， 给技术的基层 推广造成了极大障碍。 0005 重组酶聚合酶扩增法(RecombinasePolymeraseAmplification,RPA)是2014年 兴起的一种新的恒温扩增方法， 其特点是在等温条件下即可高效、 快速、 高特异、 高灵敏地 扩增靶基因序列。 目前RPA技术主要应用于病原微生物的快速检测， 包括病毒、 细菌、 真菌、 支原体、 寄生虫等， 在临床疾病诊断、 食品卫生检验及环境监测方面应用广泛， 然而目前未 见利用RPA技术进行莱姆病螺旋体检测的相关报道。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针以及含有所述 说明书 。
12、1/7 页 4 CN 105524989 A 4 引物和探针的检测试剂盒。 0007 本发明的另一目的是提供一种检测莱姆病螺旋体的RPA法。 0008 为了实现本发明目的， 本发明的一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针， 所 述RPA引物基于莱姆病螺旋体recA基因设计， 引物序列如下： 0009 LF-F:5 -ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 0010 LF-R:5 -AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 0011 所述探针根据RPA引物设计， 大小为46-52bp， 探针的5 端用FAM标记， 3 端进行 C3Sp。
13、acer修饰， 且在探针中间距5 端30bp处进行dSpacer或THF修饰。 0012 引物和探针序列分别如下： 0013 LF-F:5 -ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 0014 LF-R:5 -biotin-AACAGGATCAAGAGCATGTTCAGCATCAATA-3 0015 LF-P:5 -FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT (C3Spacer)-3 0016 本发明还提供含有所述引物LF-F、 LF-R和探针LF-P的用于RPA法检测莱姆病螺旋 体的。
14、试剂盒。 0017 优选地， 所述试剂盒还包括RPA反应管、 反应缓冲液、 标准阳性模板等中的至少一 种(RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司， 商品编号TANFO02KIT； 其中， BsuDNA 聚合酶和重组酶uvaX以干粉状态存在于RPA反应管中， 使用时， 用1反应缓冲液溶解， 整个 RPA反应在RPA反应管中进行)。 0018 本发明还提供所述RPA引物和探针及其检测试剂盒在鉴定莱姆病螺旋体中的应 用。 0019 本发明进一步提供一种用于检测莱姆病螺旋体的RPA法， 包括以下步骤： 0020 1)提取样品中的DNA； 0021 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 使。
15、用所述引物LF-F、 LF-R和探针LF-P， 在RPA反应 管中进行RPA扩增反应； 0022 3)分析RPA扩增产物。 0023 其中， RPA反应体系以50 l计为： 0024 0025 RPA反应条件为： 30-45(优选37)， 20分钟， 冰上终止反应。 0026 步骤3)中采用Hybridetect2T试剂盒(含侧流层析试纸条， 购自德国Milenia 说明书 2/7 页 5 CN 105524989 A 5 Biotec公司， 商品编号MILENIA01)检测RPA扩增产物。 检测方法如下： 将扩增产物与 Hybridetect2T试剂盒中的缓冲液按1:20的体积比混合， 然后。
16、将Hybridetect2T试纸条置 于上述混合液中， 5分钟后判读结果； 如果试纸条的检测线上出现条带， 而且质控线正常， 则 表明该样品中含有莱姆病螺旋体， 如果仅是质控线上出现条带， 则表明该样品中不含莱姆 病螺旋体。 0027 本发明将RPA引物恒温扩增技术与侧流层析试纸联用， 可从疑似病人血清中快速 准确地检测出莱姆病螺旋体。 该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高， 可对不同致病基 因型的莱姆病螺旋体进行检测， 对莱姆病的早期诊断、 早期治疗等方面具有重要意义； 同时 可以免除高昂的仪器投入， 便于基层推广使用。 附图说明 0028 图1为本发明实施例2中利用RPA引物恒温扩增不。
17、同基因型的莱姆病螺旋体、 非莱 姆病螺旋体的Hybridetect2T试纸条检测结果； 其中， A图为扩增36株莱姆病螺旋体的结 果， 对应于表1中各菌株， N为阴性对照； B图为扩增非莱姆病螺旋体的结果， B31为阳性对照， 1为埃立克体， 2为横赛巴尔通体， 3为无形体， 4为贝氏柯克斯氏体， 5为钩端螺旋体， 6为大肠 埃希菌， 7为阴性对照。 0029 图2为本发明实施例3中RPA引物恒温扩增反应体系的灵敏度检测结果； 其中， N为 阴性对照， 模板浓度梯度依次为10pg,1pg,100fg,50fg,10fg。 。 0030 图3为本发明实施例3中普通PCR扩增反应体系的灵敏度检测结。
18、果； 其中， M为100bp Ladder， 1-5分别代表模板浓度为60ng/ l、 10ng/ l、 1ng/ l、 100pg/ l、 10pg/ l， 6为阴性对 照。 具体实施方式 0031 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0032 以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司， 商品编号 TANFO02KIT； 其中， BsuDNA聚合酶和重组酶uvaX以干粉状态存在于RPA反应管中， 使用时， 用1反应缓冲液溶解， 整个RPA反应在。
19、RPA反应管中进行。 0033 实施例1用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针的合成 0034 将莱姆病螺旋体菌株B31用于检测莱姆病螺旋体的RPA引物和探针的筛选。 以recA 基因为靶基因， 根据TwistDX操作手册要求， 利用Primer5设计5对可用于BasicRPA试剂盒 的引物。 利用BasicRPA试剂盒对这5对引物进行筛选， 得到可稳定扩增目的产物， 且灵敏度 和特异性最好的一对引物。 筛选得到的最佳引物序列见SeqIDNo:1和2。 然后在此引物的 基础上根据TwistDX公司RPAnfo试剂盒操作手册要求对上述引物进行改造， 在反向引物 5 端加入一个生物素标记位点， 另。
20、外， 根据RPA引物序列设计一条大小为46-52bp的探针， 探 针的5 端用FAM标记， 3 端进行C3Spacer(C3间臂)修饰， 且在探针中间距5 端30bp处进行 dSpacer(双脱氧间臂)修饰。 根据要求设计3-5条探针， 用RPAnfo试剂盒进行筛选。 最后筛 选得到高灵敏度且可特异性扩增靶基因的， 用于检测莱姆病螺旋体的引物和探针， 它们的 序列分别如下： 说明书 3/7 页 6 CN 105524989 A 6 0035 LF-F:5 -ATTGTATTAGATGAAGCTCTTGGCATTGGTGGA-3 0036 LF-R:5 -biotin-AACAGGATCAAGA。
21、GCATGTTCAGCATCAATA-3 0037 LF-P:5 -FAM-ACTTTGATCCTTCAAGCGATTGCTGAAGT-(dSpacer)-CAAAAAGAAGGAGGCAT (C3Spacer)-3 0038 引物合成由上海生物工程有限公司完成。 0039 实施例2利用RPA引物和探针检测莱姆病螺旋体的特异性分析 0040 1.1试剂和设备 0041 小型恒温摇床， TwistnfoRPA试剂盒购自英国TwistDX公司(商品编号： TANFO02KIT)。 0042 1.2样本来源 0043 本实施例中采用的36种莱姆病螺旋体菌株， 由中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所。
22、提供(表1)； 7种非莱姆病螺旋体菌株： 埃立克体、 横赛巴尔通体、 无形体、 贝氏柯克斯 氏体和钩端螺旋体， 由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所无形体病室和钩端螺旋体 室提供； 大肠埃希菌BL21购自康为世纪生物科技有限公司。 0044 表1用于RPA检测的莱姆病螺旋体的背景资料 说明书 4/7 页 7 CN 105524989 A 7 0045 0046 0047 1.3DNA提取 0048 热裂解法提取莱姆病螺旋体菌株DNA： 将适量菌株接种BSKII培养基， 33培养7 天， 将培养好的菌株12000rpm离心30分钟收集菌体， 去上清； 然后用PBS重悬洗涤， 说明书 5/7 页。
23、 8 CN 105524989 A 8 12000rpml离心30分钟， PBS洗涤三遍， 去上清； 然后加适量ddH2O重悬， 100金属浴煮10分 钟后， 3500rpm离心5分钟， 留取上清， 4保存备用。 对照菌株DNA采用QIAGEN公司的DNA提取 试剂盒提取。 0049 1.4在RPA反应管中进行RPA反应 0050 反应体系(50 l)如下： 0051 0052 RPA反应条件为： 37， 20分钟， 冰上终止反应。 0053 1.5结果 0054 将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒(购自德国MileniaBiotecGmbH公司， 内含 侧流层析试纸条， 商品编号：。
24、 MILENIA01)中的缓冲液按1:20的体积比混合， 然后将 Hybridetect2T试纸条置于上述混合液中， 5分钟后判读结果。 结果如图1A和图1B所示， 图 1A为36株莱姆病螺旋体扩增结果： N， 为阴性对照； 其他表示字母为每个条带对应相应的菌 株名称； 图1B， B31作为莱姆病螺旋体阳性对照， 1-7为埃立克体、 横赛巴尔通体、 无形体、 贝 氏柯克斯氏体、 钩端螺旋体、 大肠埃希菌BL21， 阴性对照均不产生条带。 该结果表明本发明 引物和探针的特异性较好。 0055 实施例3利用RPA引物和探针检测莱姆病螺旋体的灵敏度分析 0056 以莱姆病螺旋体B31为模板， 利用实。
25、施例1的RPA引物LF-F和LF-R进行扩增。 其中 B31基因组DNA用ddH2O梯度稀释为10pg/ L、 1pg/ L、 100fg/ L、 50fg/ L、 10fg/ L。 在RPA反 应管中进行RPA反应。 0057 反应体系(50 l)： 0058 0059 RPA反应条件为： 37， 20分钟， 冰上终止反应。 说明书 6/7 页 9 CN 105524989 A 9 0060 将扩增产物与Hybridetect2T试剂盒(含侧流层析试纸条， 购自德国Milenia Biotec公司， 商品编号： MILENIA01)中的缓冲液按1:20的体积比混合， 然后将Hybridete。
26、ct 2T试纸条置于上述混合液中， 5分钟后判读结果。 图2为RPA法灵敏度检测结果。 由图2可见， RPA法的检测下限可达到50fg。 图3为利用普通PCR反应对不同浓度的recA基因进行扩增(引 物见SeqIDNo:1和2)， 经琼脂糖凝胶电泳后的结果。 可见普通PCR检测下限为100pg， 远低 于本发明的RPA检测方法。 0061 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 7/7 页 10 CN 105524989 A 10 0001 序列表 1/1 页 11 CN 105524989 A 11 图1 说明书附图 1/2 页 12 CN 105524989 A 12 图2 图3 说明书附图 2/2 页 13 CN 105524989 A 13 。