技术领域
本发明涉及生物制药领域，更具体地说，涉及一种长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法。
背景技术
重组人红细胞生成素(rhEPO)主要用于治疗贫血，是全球最早的重组蛋白药物之一，也是迄今技术成熟、疗效确切和全球销售额最高的基因工程药物。但由于EPO半衰期短，需要频繁给药，给病患者增加了的经济负担，同时也降低了用药的依从性。
开发长效化药物，减少病人用药次数，成为近年来全球制药机构的方向之一，国、内外多家公司也都致力于开发长效EPO。其中，安进公司和罗氏公司相继于2003年、2007年成功开发长效EPO(Aranesp和Mircera)，并在短短几年迅速挤占了第一代rhEPO产品的部分市场，有逐步取代传统EPO的趋势。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，将人EPO基因与裂解活性最低的人IgG2 Fc片段偶联，融合基因插入到载体构建成人EPO-Fc表达载体，通过转染技术筛选出稳定、高效表达重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白的工程细胞株。细胞经大量扩增、分泌表达EPO-Fc，上清经本发明的Mabselect SuRe-Capto adhere两步纯化 后得到高纯度的rhEPO-Fc，样品经临床前药理毒理学研究，rhEPO-Fc的半衰期比EPO延长了近5倍，而且安全、有效。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(1)利用基因工程手段，将裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段基因连接到人促红细胞生成素(hEPO)基因的3＇端，利用脂质体将含有hEPO-Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；该CHO细胞经培养，在培养液中分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白；CHO细胞培养生产工艺是：一次扩增培养，共收获四次含rhEPO-Fc融合蛋白无血清培养液；
(2)将步骤(1)得到的CHO细胞培养液经深层过滤后，采用Mabselect SuRe亲和层析进行纯化，然后用0.5mol/L Na2HPO4调整蛋白溶液的pH到中性，得到粗纯化的rhEPO-Fc融合蛋白液；重复步骤(2)四次；
(3)将四次通过步骤(2)得到的粗纯化的rhEPO-Fc融合蛋白液混合后采用Capto adhere复合型阴离子交换层析进行进一步纯化，得到高纯度的rhEPO-Fc融合蛋白液。
本发明所述的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，其中，所述步骤(1)具体步骤参见中国专利专利号为ZL200610072229.1，专利名称：长效人促红细胞生成素融合蛋白及其制备和纯化方法。
本发明所述的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，其 中，所述步骤(2)Mabselect SuRe亲和层析具体包括如下步骤：
2.1平衡：20mmol/L PB+0.1～1mol/L NaCl，pH6～8，平衡至pH和电导率监控显示和平衡缓冲液的一致，流速2～4cm/min；
2.2上样：上样前紫外吸收值调零，样品为步骤(1)得到的rhEPO-Fc融合蛋白液经深层过滤后，直接上样；
2.3淋洗1：20mmol/L PB+0.1～1mol/L NaCl，pH6～8淋洗至pH和电导率监控显示和淋洗1缓冲液的一致，流速2～4cm/min；
2.4淋洗2：20mmol/L PB，pH6～8淋洗至pH和电导率监控显示和淋洗2缓冲液的一致，流速2～4cm/min；
2.5洗脱：以醋酸缓冲液为洗脱液进行洗脱，流速2～4cm/min；
2.6再生：20mmol/L醋酸缓冲液，pH3.0；
2.7调pH：洗脱下来的样品用0.5mol/LNa2HPO4调pH至中性，用滤器过滤后保存；
2.8根据细胞培养上清的送样次数，重复步骤2.1-2.7过程。
本发明所述的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，其中，所述步骤2.2上样时，Mabselect SuRe的上样量不超过12mg/ml填料。
本发明所述的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，其中，所述步骤2.5洗脱时，洗脱条件为以20mmol/L醋酸缓冲液为洗 脱液，pH为3.6～5.0。
本发明所述的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，其中，所述步骤(3)Capto adhere复合型阴离子交换层析具体包括如下步骤：
3.1平衡：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH6～8，预平衡后，再用20mmol/L PB，pH6～8，平衡至pH和电导率监控显示和平衡缓冲液的一致，流速2～4cm/min；
3.2上样：样品为步骤(2)经Mabselect SuRe洗脱样混合稀释后得到的rhEPO-Fc融合蛋白液，流速2～4cm/min上样；
3.3淋洗：20mmol/L PB，pH6～8，淋洗至pH和电导率监控显示和淋洗缓冲液的一致，流速2～4cm/min；
3.4洗脱：以PB+NaCl为洗脱液，pH6～8，流速2～4cm/min，收集洗脱液，即得纯化的rhEPO-Fc融合蛋白液；
3.5再生：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH6～8，流速2～4cm/min。
本发明所述的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，其中，所述步骤3.2上样时，Capto adhere上样量为8.2～23.35mg/ml填料。
本发明所述的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，其中，所述步骤3.4洗脱中以20mmol/LPB+80～360mmol/L NaCl为洗脱 液进行洗脱。
实施本发明的长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，具有以下有益效果：
(1)通过Mabselect SuRe-Capto adhere两步纯化工艺纯化rhEPO-Fc融合蛋白，得到高纯度的EPO-Fc，样品经临床前药理毒理学研究，EPO-Fc的半衰期比EPO延长了近5倍，而且安全、有效。
(2)本发明还分别对两步层析进行实验设计，通过合理筛选实验条件来安排实验，研究了上样量、洗脱条件对目的蛋白的纯度和得率的影响，并通过对实验数据的分析，找出总体较优的纯化条件。
(3)通过实验数据分析，初步确定MabselectSuRe的上样量不超过12mg/ml填料，洗脱条件为20mmol/L醋酸缓冲液，pH4.0；Captoadhere的上样量为8.2～23.35mg/ml填料，洗脱的NaCl浓度为300mmol/L。对此条件进行验证，同时验证用SuRe-adhere两步纯化工艺纯化rhEPO-Fc项目的可行性。
(4)Mabselect SuRe配基是一个同型的四聚体配基，其只含有ProteinA的B结构域，这消除了不同结构域与Fc段亲和的差异性，使得洗脱条件更加均一和温和。而且其还去掉了对碱敏感的氨基酸，是目前唯一耐碱的ProteinA亲和介质，碱洗可以降低产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更好，有利于延长介质使用寿命，同时也大大降低了CIP/SIP的成本。所以Mabselect SuRe是一种很适合将来放大生产的改进型Protein A填料。
(5)Capto adhere用于生产规模下单克隆抗体的蛋白A后纯化， 复合模式配基提供了不同于传统离子交换剂的选择性。Capto adhere能够在一次纯化作用中除去诸如DNA、寄主细胞蛋白(HCP)、脱落的A蛋白、二聚物和较大聚集体以及病毒等杂质。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是实施例1中第一次Mabselect SuRe层析图谱；
图2是实施例1中第一次Mabselect SuRe的HPLC纯度测定图谱；
图3是实施例1中第二次Mabselect SuRe层析图谱；
图4是实施例1中第二次Mabselect SuRe的HPLC纯度测定图谱；
图5是实施例1中第三次Mabselect SuRe层析图谱；
图6是实施例1中第三次Mabselect SuRe的HPLC纯度测定图谱；
图7是实施例1中第四次Mabselect SuRe层析图谱；
图8是实施例1中第四次Mabselect SuRe的HPLC纯度测定图谱；
图9是实施例1中Capto adhere复合型阴离子交换层析图谱；
图10是实施例1中Capto adhere的HPLC纯度测定图谱。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1一种长效人促红细胞生成素融合蛋白的纯化方法，包 括如下步骤：
(1)利用基因工程手段，将裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段基因连接到人促红细胞生成素(hEPO)基因的3’端，利用脂质体将含有hEPO-Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；该CHO细胞经培养，在培养液中分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白；CHO细胞培养生产工艺是：一次扩增培养，共收获四次含rhEPO-Fc融合蛋白无血清培养液；所述步骤(1)具体步骤参见中国专利专利号为ZL200610072229.1，专利名称：长效人促红细胞生成素融合蛋白及其制备和纯化方法。
(2)将步骤(1)得到的CHO细胞培养液经深层过滤后，采用Mabselect SuRe亲和层析进行纯化，然后用0.5mol/L Na2HPO4调整蛋白溶液的pH到中性，得到粗纯化的rhEPO-Fc融合蛋白液；
所述步骤(2)Mabselect SuRe亲和层析具体包括如下步骤：
2.1平衡：20mmol/L PB+150mol/L NaCl，pH7.3，平衡至基线，流速2.5cm/min；
2.2上样：上样前紫外吸收值调零，样品为步骤(1)得到的rhEPO-Fc融合蛋白液经深层过滤后，直接上样；Mabselect SuRe的上样量不超过12mg/ml填料。
2.3淋洗1：20mmol/L PB+150mol/L NaCl，pH7.3淋洗至基线，流速2.5cm/min；
2.4淋洗2：20mmol/L PB，pH7.3淋洗至基线，流速2.5cm/min；
2.5洗脱：以醋酸缓冲液为洗脱液进行洗脱，流速2cm/min；洗脱条件为以20mmol/L醋酸缓冲液为洗脱液，pH为4.0；
2.6再生：20mmol/L醋酸缓冲液，pH3.0；
2.7调pH：洗脱下来的样品用0.5mol/LNa2HPO4调pH至7.0，用滤器过滤后保存；
2.8根据细胞培养上清的送样次数，重复步骤2.1-2.7过程，共重复四次。
(3)将四次通过步骤(2)得到的粗纯化的rhEPO-Fc融合蛋白液混合后采用Capto adhere复合型阴离子交换层析进行进一步纯化，得到高纯度的rhEPO-Fc融合蛋白液。
所述步骤(3)Capto adhere复合型阴离子交换层析，具体包括如下步骤：
3.1平衡：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH7.0，预平衡至基线,再用20mmol/L PB，pH7.0，平衡至基线，流速2.5cm/min；
3.2上样：样品为步骤(2)经Mabselect SuRe洗脱样混合稀释后得到的rhEPO-Fc融合蛋白液，上样；上样量为8.2-23.35mg/ml填料。
3.3淋洗：20mmol/L PB，pH7.0，淋洗至基线，流速2.5cm/min；
3.4洗脱：以20mmol/LPB+300mmol/L NaCl,pH7.0为洗脱液进 行洗脱，流速2.5cm/min，收集洗脱液，即得纯化的rhEPO-Fc融合蛋白液；
3.5再生：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH7.0，流速2.5cm/min。
其中，Mabselect SuRe亲和层析的过程及实验数据如下：
1.1四次亲和层析均用同一Mabselect SuRe层析柱。平衡、上样、淋洗步骤的流速均为2.5cm/min，洗脱流速为2cm/min。纯化过程参数如表1所示：
表1：四次Mabselect SuRe纯化过程
1.2四次Mabselect SuRe层析图谱和HPLC纯度测定图谱如1-8图所示。
Capto adhere复合型阴离子交换层析的过程及实验数据如下：
缓冲液：Buffer A：20mmol/L PB，pH7.0
Buffer B：20mmol/LPB+500mmol/L NaCl，pH7.0
2.1预平衡：层析柱用Buffer B预平衡228ml，流速2.5cm/min。
2.2平衡：层析柱用Buffer A平衡447ml，流速2.5cm/min。
2.3上样：样品是Mabselect SuRe四亚批混合均匀，为了使得上样液的电导和pH与平衡液的相接近，故用超纯水将混合样品稀释后上样。
2.4淋洗：用Buffer A淋洗432ml，流速2.5cm/min。
2.5洗脱：2.5cm/min，A泵是Buffer A，B泵是Buffer B。60％B洗脱得到的吸收峰170ml。
2.6 100％B再生：2.5cm/min，收集吸收峰42ml。
2.7层析图谱和HPLC纯度测定图谱如图9-10所示。
实施例1的实验结果与分析
1.Mabselect SuRe中间品实验数据如表2所示：
表2：Mabselect SuRe数据汇总
结果分析：表2显示，每亚批的纯度都在89％以上，得率都是在85％以上。
2.Capto adhere实验数据如表3所示：
表3：Capto adhere数据汇总
结果分析：表3显示，通过Capto adhere进一步纯化出来的样品纯度可以达到98.5％，得率是70％。
3.讨论
按照本发明确定的SuRe-adhere两步纯化工艺条件，纯化CHO细 胞表达的rhEPO-Fc蛋白，总收率可以达到70％，目的蛋白纯度可以达到98.5％。证实了SuRe-adhere两步层析工艺纯化rhEPO-Fc项目有效、简便、可行。所以最后rhEPO-Fc项目纯化工艺流程如下：
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。