技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，涉及利用基因工程技术提高植物抗病 性的方法。
技术背景
黄萎病严重影响作物的产量和品质，全球每年因黄萎病引起的损失达数十亿美元 (Peggetal.,2002)。报道称马铃薯因感染黄萎病年产量减少50％以上，通常情况下可以 引起10-15％的减产(Powelsonetal.,1993；Roweetal.,1987，2002)；生菜种植区，黄萎 病引起的损失非常容易达到100％(Subbaraoetal.,1997)；Levinet(2003)等研究发现， 油橄榄因黄萎病引起的减产可以达到70％以上；黄萎病也是多数植棉国家的棉花主要病 害，比如，澳大利亚、巴西、保加利亚、中国、希腊、秘鲁、土耳其、乌干达、美国和乌兹别克斯 坦等国家，可以造成30％以上棉花的减产(Boleketal.,2005)，发病严重的地区或年份减 产可以达到100％。黄萎病是制约我国棉花生产的一种主要病害，目前我国各棉区的发病面 积已占植棉总面积的50％以上，每年损失皮棉7.5-10万吨，直接经济损失16-20亿元(肖松 华等,2006)。在我国棉花黄萎病重病地块逐年增多，危害逐年加重，已成为当前实现棉花高 产、稳产的主要限制因素。黄萎病不仅引起作物大量减产和产品品质降低，其致病菌产生的 毒素也能危害人类的健康。
黄萎病主要是由大丽枝菌VerticilliumdahliaeKleb和黑白轮枝菌 Verticilliumalboatrum侵染引起的一种土传维管束病害。病原菌一旦侵入植物体内，便 没有有效的防治方法。黄萎病菌寄主范围广，可以侵染包括所有双子叶植物在内的200多种 植物，病原菌能以微菌核的形式在土壤中存活20年左右(Klostermanetal.,2009)，除 2001年Kawchuk等从番茄中克隆得到1个针对茄属黄萎病菌的抗病基因Ve以外，几乎没有克 隆到来自其他植物的抗病基因，对Ve抗病基因的机制研究表明该基因只对黄萎病菌的部分 小种具有抗性(Fradinetal.,2009)。早期的研究认为，植物感染黄萎病后，其导管被孢 子、菌丝以及病原菌通过植物细胞形成的胶状物等堵塞而致萎蔫坏死(Agrios,2005)，但 是，随后的研究表明，导管堵塞不是黄萎病萎蔫的主要原因，随着研究的不断深入，人们认 识到黄萎病菌产生的毒素是导致植物萎蔫的重要因素(Fradinetal.,2006)。还有一些学 者认为，维管束的堵塞也是基于毒素的诱导效应(陈旭升等，1998)。
实践证明，利用抗病品种是防治黄萎病危害的唯一经济有效的途径。传统育种方 法虽然能利用作物本身或亲缘种的抗性基因选育抗病品种，但存在着可利用的抗性品种资 源少，选育时间长，耗资大等缺点；施用化学药剂不仅难以有效防治黄萎病而且污染环境。 随着植物基因工程技术的不断发展以及对植物和病原物相互作用的深入了解使得将外源 抗性基因导入植物来提高抗病性成为一条有效途径。通过转基因技术可以打破传统育种中 的种间不亲和现象，消除杂交障碍，极大地拓宽了抗性基因的来源和应用(Groverand Gowthama,2003)。
利用外源抗病基因产物抑制黄萎病菌在植株体内的生长和繁殖可以提高植物对 黄萎病的抗性，另一方面，基于黄萎病菌毒素的致病机理，提高植物对黄萎病菌毒素的解毒 能力，也是提高植物对黄萎病抗性的有效方法之一。但是，绝大数研究者主要利用前一种方 法达到提高植物抗性的目的，尚未见成功利用外源基因的表达产物解毒病原菌产生的毒素 来提高对黄萎病抗性的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供编码黄萎病菌P类ATPase的VdP4-ATPase基因在提高 植物对黄萎病抗性中的用途，通过将编码黄萎病菌P类ATPase的VdP4-ATPase基因整合进入 目标植物构建转基因植物，并使得所述VdP4-ATPase基因在植物中表达而提高植物对黄萎 病的抗性。
本发明的另一个目的在于提供一种提高植物对黄萎病抗性的方法，通过在目标植 物体内表达外源基因而提高所述植物对黄萎病的抗性，所述外源基因为编码黄萎病菌P类 ATPase的VdP4-ATPase基因。
具体地，本发明是将含有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的黄萎病菌VdP4-ATPase基 因整合入植物中，实现这些基因的组成型表达，提高转基因植物对黄萎病菌毒素的解毒能 力，进而获得抗黄萎病的转基因植物。
更具体地，本发明的方法，包括下述步骤：
将VdP4-ATPase基因整合进入目标植物构建转基因植物，并使得所述VdP4-ATPase 基因在植物中表达。
优选地，所述的方法，包括下述步骤：
1)构建含有来自黄萎病菌VdP4-ATPase基因的重组植物表达载体；
2)将所述重组植物表达载体导入目标植物中，使得VdP4-ATPase基因在目标植物 中组成型表达；
3)获得具有提高的抗黄萎病的转基因植物。
优选地，所述VdP4-ATPase基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。
本发明的方法可以适用于的目标植物优选为番茄、烟草或棉花。
本发明方法中，步骤1)中的重组植物表达载体具有如图4所示的结构。
本发明的再一个目的是提供一种具有黄萎病抗性的转基因植物的制备方法，包括 以下步骤：
i)获得编码黄萎病菌P类ATPase的VdP4-ATPase基因，并将其可操作地插入植物表 达载体中，构建植物表达载体；
ii)用步骤i)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；
iii)用步骤ii)获得的转化体转化植物，获得转基因植物。
本发明利用黄萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物对黄萎病抗性的方法，具体包括 如下的步骤：
1)获得黄萎病菌VdP4-ATPase基因：引入SpeI和SmaI酶切位点设计引物，然后以黄 萎病菌cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物即为添加酶切位点的VdP4-ATPase基因序列；
2)构建组成型表达VdP4-ATPase基因的植物表达载体：将扩增获得的VdP4-ATPase 基因序列连接入植物表达载体pLGN-35S-Nos，构建一个新的植物表达载体，命名为pLGN- 35S-VdP4-ATPase；
3)植物的遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将上述步骤2)获得的pLGN-35S- VdP4-ATPase植物表达载体整合入植物基因组，实现VdP4-ATPase基因在转基因植物内的组 成型表达，提高转基因植物对黄萎病的抗性；
4)抗黄萎病的VdP4-ATPase转基因植株的获得：将步骤3)获得的转基因植物进一 步进行繁殖、分子鉴定和抗病鉴定，获得对黄萎病抗性提高的VdP4-ATPase转基因植株。
进一步，组成型表达的pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达载体构建的步骤包括：获 得黄萎病菌的cDNA后，设计上游引物：5’-GACTAGTATGGCTGGACGACCCACGGG(SpeI)-3’，下游 引物5’-CCCCGGGTCAGGTTCCCTGTCCTTGTG(SmaI)-3’进行PCR扩增，扩增产物和pLGN-35S-Nos 载体质粒分别进行SpeI和SmaI双酶切，并分别回收酶切后的大片段，再利用连接酶将回收 片段进行连接，构建一个新的植物表达载体，命名为pLGN-35S-VdP4-ATPase，以实现VdP4- ATPase基因在转基因植物内的组成型表达。
本发明所述的植物主要为烟草、番茄和棉花。
前述步骤2)所述的构建组成型表达黄萎病菌VdP4-ATPase基因植物表达载体的方 法为本领域的常规方法，使用的载体为植物基因工程的常规载体，组成型表达启动子为花 椰菜花叶病毒CaMV35S启动子，利用其他具有组成型特性的启动子也能达到同样的目的。
前述步骤3)所述的根癌农杆菌介导的植物转化方法，其中将植物表达载体转入农 杆菌的方法为电转化法，将植物表达载体整合入烟草、番茄和棉花的方法为根癌农杆菌介 导法。
前述步骤4)所述的分子鉴定为分子生物学、基因工程等领域所用的鉴定技术，如 GUS组织化学染色、PCR扩增鉴定等技术。
前述步骤4)所述的抗病鉴定是指人工气候室或温室内幼苗植株对黄萎病的抗性 鉴定，转基因烟草和番茄均采用灌菌液法进行病原菌的接种，棉花则采用浸根法进行接种。
本发明所提供的提高植物对黄萎病抗性的方法，是将来自黄萎病菌的VdP4- ATPase基因分别转入烟草、番茄和棉花细胞中，实现这些基因在转基因植株中的组成型表 达，利用外源基因编码的P4类ATP酶解毒黄萎病菌在植物体内产生的毒素，提高转基因植物 对黄萎病菌毒素的解毒能力，进而提高转基因植物对黄萎病的抗病性。
环孢菌素A(CsA)是一种由11个氨基酸组成的亲脂疏水性环肽，本发明结合了CsA 和黄萎病菌毒素部分结构的相似性，以及黄萎病菌致病机理的特性，创造性地提出利用黄 萎病菌VdP4-ATPase基因在转基因植物内组成型表达，提高转基因植物对黄萎病菌毒素的 解毒能力，进而提高转基因植物对黄萎病的抗性的策略。
本发明主要是利用转基因产物对黄萎菌毒素的解毒能力提高植物抗病性，更进一 步的以相同的方式利用转基因产物提高植物对真菌毒素的解毒能力也是本发明的保护范 围。同时本发明中涉及的植物表达载体，转化细胞等也在本发明的保护范围内。
利用本发明方法获得的VdP4-ATPase转基因烟草，T0代幼苗利用伤根灌菌液法接 种高毒力L2-1菌株30d，病情指数为29.35，较野生型对照46.34。接种30d，46个VdP4- ATPase转化子中仍有14个转化子没有出现明显的病症。VdP4-ATPase转基因棉花T1代幼苗， 利用浸根接种法接种V991落叶型黄萎病菌株20d，非转基因对照病情指数达到了82.24，有 两个VdP4-ATPase株系的病情指数低于10，分别为6.25和8.33。利用本发明获得的转基因番 茄T0代幼苗植株利用伤根灌菌液法接种高毒力L2-1菌株，非转基因番茄的病情指数达到 78.33，VdP4-ATPase转基因番茄的病情指数为40.83，较野生型对照降低37.5。研究结果表 明，利用本发明方法获得的转基因棉花、烟草和番茄可以显著提转基因植物对黄萎病的抗 病性。说明，本发明提供的提高植物对黄萎病抗性的方法效果显著。该方法不仅适用于棉 花、烟草和番茄，所有能受黄萎病菌侵染的植物均可利用该方法提高对黄萎病的抗性。
本发明提供的方法主要是利用对病原菌毒素的解毒而提高植物的抗性，因而不具 有病原菌小种抗性的特点。因此，可以广泛应用于提高不同病原菌生理小种的抗性，不存在 小种专一性抗性的特点。
附图说明
图1为植物病原菌对CsA的敏感性检测结果分析
1:白菜黑斑菌；2：黄萎病菌；3：茄链格孢菌；环孢菌素A(CsA)浓度为0μg/mL、10μg/ mL、50μg/mL和100μg/mL。在每个孔中加入5μL不同浓度的CsA，26℃条件下培养一周左右。
图2为pLGN-35S-Nos植物表达载体构建流程图
LF-LF:重组酶识别位点(LoxpRT)，为全基因合成而成；35S-MCS-Nos来自pBINAR 载体(GenBank:AB752377.1)，通过PCR获得；NPTⅡ基因来自细菌转座子Tn5上的aphA2；
GUS基因为报告基因，来自大肠杆菌。
图3为pLGN-35S-VdP4-ATPase载体酶切验证结果
M：DNA分子量标准Marker15；VdP：pLGN-35S-VdP4-ATPase载体质粒经酶切后的获 得的VdP4-ATPase目标片段。
图4为pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达载体图
pLGN-35S-VdP4-ATPase载体中包含一个2×35S启动的GUS::NPTⅡ融合基因的表 达框，一个35S启动的VdP4-ATPase基因的表达框。
图5为VdP4-ATPase转基因烟草GUS组织化学染色分析
WT：野生型的非转基因烟草；VdP：VdP4-ATPase转基因烟草。
图6为VdP4-ATPase转基因烟草GUS阳性植株的PCR扩增鉴定部分结果
bp：碱基对；M：DNA标准分子量DL2000；1：野生型非转基因阴性对照；2：质粒阳性对 照；3-17：GUS染色阳性转基因烟草植株。VdP：VdP4-ATPase转基因烟草GUS阳性植株的PCR扩 增结果。
图7为接种黄萎病菌30d，VdP4-ATPase转基因烟草植株的表型
WT：野生型的非转基因烟草；VdP：VdP4-ATPase转基因烟草。
图8为VdP4-ATPase转基因株系中外源基因的表达水平和病级比较
WT：野生型对照；VdP-1、VdP-4……VdP-42：VdP4-ATPase转基因烟草株系。
图9为VdP4-ATPase转基因棉花GUS组织化学染色分析
WT：野生型的非转基因棉花；VdP：VdP4-ATPase转基因棉花。
图10为VdP4-ATPase转基因棉花GUS阳性植株的PCR扩增鉴定部分结果
bp：碱基对；M：DNA标准分子量DL2000；1：野生型非转基因阴性对照；2：质粒阳性对 照；3-17：GUS阳性转基因烟草植株。VdP：VdP4-ATPase转基因棉花。
图11为接种黄萎病菌20d，VdP4-ATPase转基因棉花T1代株系的病级、发病率(％) 和病情指数
Null：转基因株系中分离的非转基因植株对照；B1、B10、B50、B53、B56、B57、B58、 B6、B60和B61：BbP4-ATPase转基因棉花独立的转化子。VdP7、VdP8、VdP10、VdP15、VdP16、 VdP23、VdP24、VdP33、VdP48和VdP56：VdP4-ATPase转基因棉花独立的转化子。
图12为接种黄萎病菌20d，VdP4-ATPase转基因棉花T1代幼苗的表型
WT：野生型的非转基因棉花；VdP：VdP4-ATPase转基因棉花。
图13为VdP4-ATPase转基因棉花外源基因的表达水平
Null：转基因株系中分离的非转基因植株对照；VdP7、VdP8、VdP10、VdP15、VdP16、 VdP23、VdP24、VdP33、VdP48和VdP56：VdP4-ATPase转基因棉花独立的转化子。
图14为VdP4-ATPase转基因番茄GUS组织化学染色分析
WT：野生型对照；VdP：VdP4-ATPase转基因番茄。
图15为VdP4-ATPase转基因番茄GUS阳性植株的PCR扩增鉴定部分结果
bp：碱基对；M：DNA标准分子量；1：野生型非转基因阴性对照；2：质粒阳性对照；3- 17：GUS染色呈阳性反应的番茄植株。
图16为接种黄萎病菌30d，植株的表型
WT：野生型对照；VdP：VdP4-ATPase转基因番茄。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限 定。
本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方 法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。
1、发明技术核心策略的提出
1.1黄萎病菌对CsA的敏感性
分析发现来自黄萎病菌的P类ATPase基因编码的氨基酸序列与球孢白僵菌的 BbP4-ATPase基因编码的氨基酸序列相似度达78％。因此，我们将来自黄萎病菌的该类基因 命名为VdP4-ATPase。
前期研究结果表明，来自球孢白僵菌的BbP4-ATPase基因破坏突变体对CsA较为敏 感。BbP4-ATPase是一种膜蛋白，参与细胞内的囊泡运输，所以我们推测，CsA可能以囊泡运 输的方式被运输至某一特定部位进行分解或利用(如液泡)，从而提高球孢白僵菌对CsA的 耐受性，所以推测来自黄萎病菌的VdP4-ATPase可能与BbP4-ATPase具有相似的功能。我们 的研究结果还表明，相对于其它植物病原真菌(如白菜黑斑菌，茄链格孢菌等)，黄萎病菌对 CsA具有较强的耐受性，而黄萎病菌自身能够产生毒素，其产生的毒素可能对其自身的生长 产生一定的影响，所以，VdP4-ATPase可能起到解毒的作用。
为了验证黄萎病菌对CsA的敏感性，以落叶型黄萎病菌V991(Verticillium dahliae，中国农业科学研究院植物保护研究所，简桂良研究员惠赠)、白菜黑斑菌 (Alternariabrassicae，本实验室前期保存)、茄链格孢菌(Alternariasolani，本实验室 前期保存)作为研究对象，将黄萎病菌V991、白菜黑斑菌、茄链格孢菌，接种于PDA(土豆固体 培养基)培养中，26℃条件下培养14天，取适量各菌株分生孢子于0.05％Tween-80中，配制 浓度为2×106个/mL的分生孢子悬浮液，取400μL各菌株分生孢子悬浮液于60mLPDA培养基 (冷却至45℃左右)中，混匀后，取20mL培养基与分生孢子的混合物于直径为90mm的培养皿 中(每个菌株做3个重复)，待培养基完全凝固后，用直径为5mm的打孔器打孔，在每个孔中加 入5μL不同浓度的CsA，26℃条件下培养一周左右，具体结果如图1所示。图1的结果表明相对 于白菜黑斑菌和茄链格孢菌，黄萎病菌对CsA具有较强的耐受性。
1.2发明技术核心策略的提出
上述研究表明，黄萎病菌相对于白菜黑斑菌和茄链格孢菌等植物病原真菌对CsA 具有较强耐受性，同时，CsA是一种由11个氨基酸组成的亲脂疏水性环肽，其结构可能与黄 萎病菌毒素的某些致病组分的结构类似，因此，结合黄萎病菌致病机制，本发明创造性地提 出该发明的核心策略，“在转基因植株内利用黄萎病菌的P类ATP酶来解毒黄萎病菌毒素，进 而提高转基因植株对黄萎病的抗性”。
2、VdP4-ATPase基因的克隆
2.1黄萎病菌RNA的提取及cDNA的合成
取适量黄萎病菌野生型菌株V991菌丝于50mLPDB(土豆液体培养基)培养基中，200rpm，26℃振荡培养4天，抽滤、收集菌丝，利用液氮研磨法，按Aidlab公司的EASYspinRNA快速提取试剂盒使用说明书提取球孢白僵菌的总RNA，获得的RNA利用1％琼脂糖电泳检测质量。再利用TaKaRA公司的RTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒合成cDNA，操作严格按说明书进行。
2.2VdP4-ATPase基因的克隆
以实施实例2.1获得的黄萎病菌cDNA为模板，以VdP4-ATPase基因上游引物5’- GACTAGTATGGCTGGACGACCCACGGG(SpeI)-3’/5’-CCCCGGGTCAGGTTCCCTGTCCTTGTG(SmaI)-3’ 为引物，利用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)酶进行PCR扩增，回收扩增产物，获得带有SpeI/SmaI酶 切位点的VdP4-ATPase片段。
PCR扩增体系为：10×PCRBuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMgSO43μL，10μM上 下游引物各2μL，模板(50μg/μL)4μL，KOD-Plus-Neo1μL(1U/μL)，加水至50μL，扩增程序为 94℃2min；98℃10s，68℃4min30s，循环40次。
3、pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达载体的构建及农杆菌转化子的获得
3.1pLGN-35S-Nos植物表达载体的获得
pLGN-35S-Nos为本实验室由pCambia2300改造而来的一个双元植物表达载体。其 T-DNA区段(RB和LB之间区域)替换成组成型启动子CaMV35S-P控制的报告基因GUS和标记基 因NPTII的融合基因表达盒，并在这个表达盒两端各添加了一个LoxpFRT重组酶识别位点， 以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒，具体过程如图2所示。
3.2pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达载体的构建
将上述实施实例2.2扩增获得的片段回收后用SpeI和SmaI进行双酶切，并回收酶 切片段，同时用SpeI和SmaI进行双酶切pLGN-35S-Nos质粒，并回收酶切后的大片段，然后利 用DNA连接酶连接回收的VdP4-ATPase片段和pLGN-35S-Nos片段，连接产物转化大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克隆并进行酶切验证(如图3所示)，结果表明，已成功将VdP4-ATPase基因 片段连接入pLGN-35S-Nos载体。根据载体序列设计引物进行测序分析，测序验证获得的 BbP4-ATPase基因序列见序列9(SEQIDNO.9)，-80℃保存pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达 载体阳性克隆备用，载体具有图4所示的结构。
3.3pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达载体的重组农杆菌的获得
利用电转化法，将步骤3.2获得的pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达载体转入农杆 菌LBA4404感受态细胞，利用抗生素筛选标记基因进行抗性筛选，获得阳性克隆，再提取农 杆菌质粒并用SmaI和SpeI进行双酶切验证(验证结果与图3酶切验证结果相同)，获得含有 pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表达载体的重组农杆菌。
提取pLGN-35S-VdP4-ATPase载体转化的大肠杆菌或农杆菌质粒，SpeI和SmaI进行 双酶切后利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，获得了约4128bp的目的片段。
4、转基因植株的分子鉴定
4.1转基因植株的GUS组织化学染色鉴定
参照Jefferson等(1987)的方法，用9mm孔径把孔器切取再生烟草、番茄或棉花植 株幼嫩叶片置GUS染色液(500mg/LX-Gluc，0.1mol/LK3Fe(CN)6，0.1mol/LK4Fe(CN)6，1％ TritonX-100(v/v)，0.01mol/LNa2EDTA，pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液)中，37℃保温2h。 染色后，75％乙醇脱色，每4h更换一次脱色液，直至未着色部分的颜色完全褪去。叶片都没 有蓝色出现的再生材料为非转基因植株，染出蓝色的为转基因植株。
4.2VdP4-ATPase转基因植株的PCR扩增鉴定
所有再生的GUS组织化学染色呈阳性反应的烟草、番茄和棉花植株，取其幼苗叶片 约0.1g，按照说明书的操作程序，利用Aidlab公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提 取DNA，获得DNA后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后以提取的DNA为模板，扩增 VdP4-ATPase基因的片段，以检测再生植株是否都整合了VdP4-ATPase基因。
VdP4-ATPase基因PCR扩增引物为：上游引物：5’-TATTCCTCTCGTTGCCGTGC-3’；下游 引物：5’-CAATGTCTGCGGGAAAAGGC-3’。
25μL扩增体系包括：10×LAPCRBuffer，2.5μL；25mmol/LMgCL2，2.5μL； 2.5mmol/LdNTPMixture，2μL；模板DNA，1μL(约10ng)；5μmol/L上游引物，1μL；5μmol/L下 游引物，1μL；LATaq酶，0.2μL；ddH2O，14.8μL。
PCR温度循环参数：94℃，5min；94℃，30s，57℃，30s，72℃，30s，扩增30个循环；72 ℃，10min。最后扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
5、抗病鉴定致病菌的获得及植株病级统计标准
5.1抗病鉴定用致病菌的获得
PDA固体培养基活化的落叶型黄萎病菌V991或强致病力L2-1菌株(河北农业大学， 马峙英教授惠赠)，挑取少许菌丝接种入CZB(察氏液体培养基)中，180rpm，26℃振荡培养 7d，再按10％(菌液/CZB培养基)的比例接种入CZB培养基，180rpm，26℃振荡培养7d，用四层 无菌纱布过滤去除菌液中的菌丝及杂质，去离子水调整黄萎病菌孢子浓度达到107个/ml， 该孢子悬浮液即为抗病鉴定接种的致病菌接种液。
5.2转基因植株的病级统计标准
参照Bhat和Subbarao(1999)的棉花幼苗病级的5级病级统计方法，统计棉花、烟草 和番茄植株的病级。
0级：植株外表无病症；
1级：植株叶片1/3以下显病症；
2级：植株叶片1/3-2/3显病症；
3级：植株叶片2/3以上显病症；
4级：植株叶片全部表现病症。
5.3发病率和病情指数计算公式
6、基因转录表达检测
6.1RNA的提取及cDNA的合成
利用植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab产品)，提取植物RNA，所有操作严格按说明书进行，获得的RNA利用1％琼脂糖电泳检测质量。再利用RTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒(TaKaRa产品)合成cDNA，再以cDNA为模板扩增目标基因，RNA中植物基因组DNA的去除以及cDNA的合成均严格按说明书进行。
6.2基因转录表达检测
利用Real-timePCR方法检测植株内转基因的表达水平。为均一化cDNA浓度，棉花 以GhHIS3基因为内标，烟草则以18S基因为内标。
20μL反应体系包括：cDNA1μL，上下游引物各1μL，2×iQSYBRGreenSupermix 10μL，用无RNA酶的双蒸水补足20μL。
扩增程序为：95℃预扩增3min；94℃10s，56℃30s，72℃30s，共扩增40个循环。扩增 完成后利用GeneStudy软件分析基因的相对表达量。
7、烟草的遗传转化及转基因植株的获得
7.1烟草遗传转化用培养基
MSB：MS无机盐(MurashigeandSkoog,1962)+B5有机(Gamborg等，1968)。
种子萌发培养基：MSB+30g/L蔗糖，加入2.0g/LGelrite进行固化，pH6.0。
共培养培养基：MSB+30g/L蔗糖+0.5mg/LIAA(吲哚乙酸)+2.0mg/L6-BA(6-苄氨 基嘌呤)，加入2.0g/LGelrite进行固化，pH5.4。
愈伤诱导培养基：MSB+30g/L蔗糖+0.5mg/LIAA+2.0mg/L6-BA+400mg/LCef(头 孢霉素)+100mg/LKm(卡那霉素)，加入2.0g/LGelrite进行固化，pH5.8。
幼芽诱导培养基：MSB+30g/L蔗糖+2.0mg/L6-BA，200mg/LCef+100mg/LKm，加入 2.0g/LGelrite进行固化，pH5.8。
生根培养基：MSB+30g/L蔗糖+200mg/LCef，加入2.5g/LGelrite进行固化， pH5.8。
7.2烟草遗传转化外植体的获得
取成熟烟草种子数粒，75％的酒精灭菌1min，快速倾去酒精；1％的次氯酸钠溶液 灭菌15min，期间不停振荡，以达到充分消毒的目的；倾去氯酸钠溶液，利用无菌双蒸水漂洗 种子7-8次。无菌条件下120rpm，室温振荡培养至种子萌芽，再转入种子萌发培养基，16h光 照/8h暗培养条件下培养至4-6片真叶。取生长完全的真叶，超净台上无菌条件下用手术刀 片切成3-5mm介方的叶盘用作转化的外植体。
7.3农杆菌浸染液的制备
-80℃保存的含LGN-35S-VdP4-ATPase载体的农杆菌菌株划线培养分别获得单菌 落，再挑取单菌落，接种入附加50mg/LKm和125mg/LSm(硫酸链霉素)的YEB培养基中(5g/L 蔗糖，1g/L细菌用酵母抽提物，10g/L细菌用胰化蛋白胨，0.5g/LMgSO4·7H2O，pH7.0)，28 ℃、200rmp振荡培养过夜，至菌液OD600值达到0.8时，取菌液离心，菌体用添加同体积MSB液 体培养基重悬，重悬液即为转化用的农杆菌浸染液。
7.4烟草的遗传转化及植株再生
步骤7.2获得的叶盘外植体于步骤7.3制备的农杆菌浸染液内浸染30min，之后倾 去菌液，经农杆菌感染的烟草外植体，接种至共培养培养基内，26℃暗培养2d，然后继代入 愈伤诱导培养基，14d后继代入芽诱导培养基，再培养约14d，切取再生绿芽继代入生根培 养基中，生根培养基内培养至2-3叶幼苗，洗净根周围的琼脂，移栽入盛装草炭土的营养钵 内，并放置于温室进行培养。
7.5转基因烟草的分子鉴定及转基因植株的获得
按照实施实例4的方法分别对再生的烟草植株进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴 定。凡烟草叶片GUS组织化学染色能获得如图5所示蓝色(右侧)的植株均是转基因植株。经 GUS组织化学染色鉴定共获得了46个VdP4-ATPase转基因株系。为了进一步确定GUS组织化 学染色鉴定呈阳性反应的植株内是否都整合了VdP4-ATPase基因，所有GUS染色呈阳性反应 的再生植株提取叶片总DNA后，再以DNA为模板，以序列3和序列4扩增VdP4-ATPase基因的片 段，结果显示，所有VdP4-ATPase转基因再生烟草GUS阳性反应植株都能扩增获得VdP4- ATPase基因约200bp的目标片段(图6)，说明GUS染色阳性植株内均整合了BbP4-ATPase或 VdP4-ATPase基因。经GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定，共获得了38个BbP4-ATPase转基因 烟草的独立转化子，46个VdP4-ATPase转基因烟草的独立转化子，所有这些转化子全部用于 抗病鉴定分析。
8、转基因烟草对黄萎病的抗性
经实施实例7遗传转化和分子鉴定获得的转基因烟草植株温室内生长至6-10片叶 时，利用手术刀片在离植株约1-2cm处进行伤根处理，然后每株浇灌实施实例7.1制备的L2- 1接种液30mL(伤根灌菌液法)，置22℃(夜间)-26℃(白天)的人工气候室内培养。接种30d， 按实施实例7.2的标准统计转基因植株的病级。结果显示，46个独立的VdP-ATPase转化子的 平均病级为1.17，病情指数为29.25。而野生型非转基因对照(再生的野生型植株)的平均病 级为3.03，病情指数为75.65(表1)，与非转基因对照相比，VdP-ATPase转基因株系的病情指 数降低了46.34。
接种30d，VdP4-ATPase转基因烟草不仅病级和病情指数明显低于野生型非转基因 对照，46个VdP4-ATPase转化子中有14个转化子没有明显的病症，而非转基因对照植株全部 严重萎蔫，叶片失绿(图7)。随机选取5个未发病转化子利用腋芽进行扩大繁殖，然后再利用 相同的方式接种黄萎病菌，进行抗病鉴定，结果显示接种30d，这些转化子仍未表现出明显 的病症，进一步证实获得的抗病转基因烟草对黄萎病的抗性显著提高。结果表明，利用 VdP4-ATPase基因能明显提高转基因烟草对黄萎病的抗病性。
为了进一步明确转基因株系抗病水平提高与转基因表达水平间的关系，随机选取 20VdP4-ATPase转基因烟草为研究对象，以实施实例6.1的方法提取转基因烟草植株叶片的 RNA，并按实施实例6.1的方法合成cDNA，再以cDNA为模板扩增VdP4-ATPase基因片段，然后 按实施实例6.2的方法进行定量PCR扩增，以18SrRNA基因为内标。结果显示，所有转转基因 植株内VdP4-ATPase基因都能进行有效的转录表达，且转录表达水平越高转基因植株的病 级越低，即抗性与转基因的转录表达水平存在着一定的相关性，其转基因的转录表达水平 越高，转基因植株对黄萎病的抗性越好。转基因株系的表达水平和病级见图8。
以转基因烟草幼苗叶片为材料，提取转基因植株的RNA，并反转录合成cDNA，以序 列3和序列4为引物扩增VdP4-ATPase基因，为均一化cDNA浓度，以烟草的18SrRNA基因为内 标基因，并以序列5和序列6为引物进行扩增，扩增完成后利用GeneStudy软件分析基因的 相对表达量。
表1接种黄萎病菌30d，VdP4-ATPase转基因烟草的病级和病情指数
WT：野生型植株；VdP4-ATPase：VdP4-ATPase转基因烟草植株。
46个VdP4-ATPase转基因烟草转化子全部利用伤根灌菌液法接种黄萎病菌孢子悬 浮液(107个孢子/mL)，接种30d，按0-4级的5级标准统计每个转化子的病级，然后分别计算 所有转化子和对照的平均病级和病情指数。非转基因对照全部严重发病，平均病级达到了 3.03，病情指数达到了75.69，而VdP4-ATPase转基因株系的平均病级为1.17，病情指数为 29.35。
9、棉花的遗传转化：
9.1棉花遗传转化用培养基
基本培养基:MSB(MS无机盐+B5有机)；
种子萌发培养基:1/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，自来水配制，自然pH；
共培养培养基:MSB+0.5mg/LIAA+0.1mg/LKT(6-糠氨基嘌呤)+30g/L葡萄糖+100 μmol/L乙酰丁香酮+2.0g/LGelrite，pH5.4；
筛选脱菌培养基:MSB+0.5mg/LIAA+0.1mg/LKT+75mg/LKm+500mg/Lcef+30g/L 葡萄糖+2.0g/LGelrite，pH5.8；
愈伤诱导培养基:MSB+0.5mg/LIAA+0.1mg/LKT+75mg/LKm+200mg/Lcef+30g/L 葡萄糖+2.0g/LGelrite，pH5.8；
胚性愈伤诱导培养基:MSB+0.1mg/LKT+30g/L葡萄糖+2.0g/LGelrite，pH5.8；
液体悬浮培养基：MSB+1.91g/L硝酸钾+0.1mg/LKT+30g/L葡萄糖,pH5.8；
体胚成熟培养基:MSB+15g/L蔗糖+15g/L葡萄糖+0.1mg/LKT+2.5g/LGelrite， pH6.0；
成苗培养基:SH+0.4g/L活性碳+20g/L蔗糖，pH6.0。(Schenk&Hildebrandt，1972)
9.2转化外植体的获得
陆地棉种子去壳，籽仁0.1％升汞灭菌10min，无菌自来水漂洗5-6次后，接种于种 子萌发培养基，28℃暗培养5-7d。无菌下胚轴切成3-5mm长的切段，作为转化外植体。
9.3转化用农杆菌浸染液的制备
转化用农杆菌的制备同实施实例7.3，培养的农杆菌菌液离心后，菌体用添加同体 积的共培养液体培养基重悬，重悬液即为转化用农杆菌浸染液。
9.4棉花下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导
外植体用农杆菌浸染液浸染20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余 的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26℃暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱 菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)和头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的 诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮 培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。
9.5体胚的诱导和成苗培养
液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均匀分散地接 种入体胚成熟培养基，约15d产生大量的体胚，将其继代入SH培养基，促进体胚进一步成苗。 3-4叶的再生苗移栽入温室进行繁殖。
9.6VdP4-ATPase转基因棉花的获得和分子验证
以再生的棉花叶片为材料，按实施实例4的方法分别对再生植株进行GUS组织化学 染色和PCR扩增鉴定。GUS组织化学染色能获得图9所示的蓝色(右侧)的植株为转基因植株， 以来源于一个外植体的再生植株为一个株系进行计算，经GUS组织化学染色鉴定获得的 VdP4-ATPase转基因棉花为10个GUS阳性株系，为111株转基因植株。为进一步确定GUS阳性 植株中是否全部整合了VdP4-ATPase基因，按实施实例4.2的方法进一步对转基因植株进行 PCR扩增鉴定，结果显示，所有GUS组织化学染色呈阳性反应的植株均能扩增出VdP4-ATPase (约200bp)基因的目标特异带(图10)。以相同的方式对T1代幼苗进行分子鉴定，经分子鉴定 的转基因植株T1代幼苗均用于抗病分析。
以转基因棉花叶片的DNA为模板，以合成序列3和序列4为引物扩增VdP4-ATPase基 因的片段，所有GUS染色阳性反应的植株均能扩增出VdP4-ATPase(约200bp)基因的目标特 异带。
10、转基因棉花对黄萎病的抗性
温室繁殖T0代植株收获的种子去壳留籽仁，28℃萌发后进行水培养，直至子叶平 展开始出现真叶，采用浸根接种法接种实施实例7.1获得的V991落叶型黄萎病菌，根侵染2d 后移栽入营养钵内，然后22℃(夜间)-26℃(白天)，16h光照，8h黑暗条件下培养，接种后间 隔5d按实施实例5.2的病级标准统计一次植株的病级，接种20d，转基因株系中分离的非转 基因植株(Null)全部发病，病情指数达到82.24，获得的10个转基因VdP4-ATPase株系的病 情指数也都低于非转基因对照，其中VdP8、VdP10、VdP15、VdP16、VdP24、VdP33和VdP56等7个 株系的发病率低于50％，分别为28.57％、50.00％、50.00％、33.33％、50.00％、46.25％和 25.00％，病情指数分别为14.29、12.50、12.50、8.33、25.00、21.15和6.25，其中的VdP16和 VdP56株率的病情指数分别为8.33和6.25，低于10，达到了抗病水平。利用平均病级进行比 较，结果显示，接种20d，非转基因对照的平均病级为3.29，对非落叶型黄萎病V991菌株表现 为易感，VdP8、VdP10、VdP15、VdP16、VdP24、VdP33和VdP56这7个株系的病级分别为0.57、 0.50、0.50、0.33、1.0、0.85和0.25(图11)，对黄萎病V991菌株同样表现为抗或耐。
接种20，非转基因对照植株因黄萎病菌感染叶片都出现了黄萎病典型的病症，上 部叶片失绿变色、部分叶片坏死甚至脱落，VdP4-ATPase转基因棉花真叶叶色正常，植株生 长正常，只是个别植株子叶出现了轻微的病症，有少许病斑(图12)，明显提高了对黄萎病的 抗性。
为了进一步说明转基因表达水平与抗病性间的关系，利用Real-timePCR检测外 源基因的转录表达水平。以转基因株系为材料，每个株系取三个样品提取RNA，并反转录合 成cDNA，然后以cDNA为模板，以合成的序列3和序列4为引物扩增VdP4-ATPase基因，为均一 化cDNA浓度，以GhHIS3基因为内标基因，扩增引物序列为序列7和序列8。结果显示(图13)， 所有VdP4-ATPase转基因植株内VdP4-ATPase基因也都能有效转录表达，与转基因株系病情 指数相比较，结果显示，转基因表达水平的高低影响着转基因株系的抗性水平，转基因表达 水平较高时，转基因株系的抗病性更好。
利用浸根接种法接种落叶型黄萎病菌V991菌株，接种20d，按0-5级病级标准统计 病级，并计算发病率、病情指数，以及计算每个株系的平均病级。结果显示，转基因株系的 发病率、病情指数和平均病级都明显低于非转基因对照，表明VdP4-ATPase转基因棉花对黄 萎病的抗性明显提高。
11、番茄的遗传转化
11.1番茄遗传转化用培养基
基本培养基:MSB0(MS无机+B5有机+30g/L蔗糖，pH5.8)。固体培养基加入6g/L的琼 脂(Murashige和Skoog，1962；Gamborg等，1968)；
共培养培养基MSB1:MSB0+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+100uMAS(乙酰丁香酮)+ 6g/L琼脂，pH5.4；
筛选培养基MSB2:MSB1+500mg/Lcb(羧苄青霉素)+100mg/LKm+6g/L琼脂，pH5.8；
继代培养基MSB3:MSB0+200mg/Lcb+100mg/LKm+6g/L琼脂，pH5.8；
生根培养基MSB4:MSB0+0.5mg/LIAA+200mg/LCef+50mg/LKm+6g/L琼脂，pH6.0。
11.2番茄遗传转化外植体的获得
Micro-Tom番茄种子1％次氯酸钠溶液灭菌10-15min，然后无菌自来水冲洗5-6次， 接种至MSB0培养基上，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期于萌发7d左右，生长健壮平展的无菌 幼苗子叶切去两端，中部约2/3的部分留作农杆菌介导遗传转化的外植体。
11.3转化用农杆菌浸染液的制备
转化用农杆菌的制备同实施实例7.3，培养的农杆菌菌液离心后，菌体用添加同体 积的MSB0液体培养基重悬，重悬液即为转化用农杆菌浸染液。
11.4番茄遗传转化
参考Cortina等(2004)的方法，以生长约7d无菌苗的子叶为外植体，利用根癌农杆 菌介导法进行遗传转化。
农杆菌浸染液浸染外植体10min后倾去菌液，无菌吸水纸吸去外植体表面多余菌 液，然后接种入铺有一层无菌滤纸的共培养培养基MSB1，25℃暗共培养2d。共培养完成后， 将外植体接种入筛选培养基MSB2中进行分化培养，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期培养2 周，然后将外植体继代入MSB3培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次。产生Km抗性幼芽后，将 幼芽切下接种入MSB4生根培养基，获得Km抗性再生植株。根长3-5cm的再生幼苗，移栽入温 室生长成苗。
11.5转基因番茄的分子鉴定和转基因植株的获得
按照实施实例6的方法分别对再生的番茄植株进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴 定。凡番茄叶片GUS组织化学染色能获得如图14所示蓝色(右侧)的植株均是转基因植株，经 GUS组织化学染色鉴定共获得了30株VdP4-ATPase转基因番茄植株，为了进一步确定GUS组 织化学染色鉴定呈阳性反应的植株内是否都整合了VdP4-ATPase基因，所有再生植株提取 叶片总DNA，再以DNA为模板，以合成序列3和序列4为引物，扩增VdP4-ATPase基因的片段，结 果显示，所有GUS阳性反应植株都能扩增获得VdP4-ATPase(约200bp)基因的目标特异带(图 15)。PCR扩增结果说明，GUS染色呈阳性反应的VdP4-ATPase植株内均整合了VdP4-ATPase基 因。经GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定，共获得了30个VdP4-ATPase转基因植株，所有这些 转化子T0代植株全部用于抗病鉴定分析。
12、转基因番茄对黄萎病的抗性
经实施实例11遗传转化和分子鉴定获得的转基因番茄植株，温室内生长至4-6片 叶时，利用手术刀片在离植株约1-2cm处进行伤根处理，每株对称地伤根然后每株浇灌实施 实例5.1制备的L2-1接种液15mL，置22℃(夜间)-26℃(白天)的培养室内培养。接种20d，按 实施实例7.2的标准统计转基因植株的病级。
抗病鉴定结果显示(表2)，接种30d，野生型对照(再生的野生型植株)的平均病级 为3.13，病情指数为78.33。30个VdP4-ATPase转化子的平均病级为1.63，病情指数为40.83， 与非转基因对照相比，转基因株系的病情指数降低了37.50。接种30d，30个VdP4-ATPase转 化子中有18转化子的病级没有超过1，提性提高的转基因植株只是最底部的叶片出现轻微 的病症，而非转基因对照植株的病级都在3以上，且中上部的叶片已经开始失绿变黄(图 16)。
抗病鉴定结果表明，利用VdP4-ATPase基因能明显提高转基因番茄对黄萎病的抗 病性。
表2接种黄萎病菌30d，转基因番茄的病级和病情指数
WT：野生型对照；VdP：VdP4-ATPase转基因番茄。
所有植株利用伤根灌菌液法接种黄萎病菌孢子悬浮液(107个孢子/mL)，接种30d， 按0-4级的5级标准统计每个转化子的病级，然后分别计算所有转化子和对照的平均病级和 病情指数。非转基因对照全部发病，平均病级为3.13，病情指数达到了78.33，VdP4-ATPase 转基因番茄的病级和病情指数均显著下降。
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