技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌及其在玉米炭疽病生防中的应用。
背景技术
玉米炭疽病由禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)引起，主要危害玉米叶片，病斑梭形至近梭形，中央浅褐色，四周深褐色，大小2～4×1～2(mm)，病部生有黑色小粒点，即病菌分生孢子盘，后期病斑融合，致叶片枯死。禾生炭疽菌的分生孢子盘散生或聚生，黑色；刚毛暗褐色，具隔膜3～7个，顶端浅褐色，稍尖，基部稍膨大，大小60～119×4～6(μm)；分生孢子梗圆柱形，单胞无色，大小10～15×3～5(μm)；分生孢子新月形，无色，单胞，大小17～32×3～5(μm)。
玉米炭疽病在欧美各国普遍发生，造成严重减产。该病在我国的东北三省和云南等地有分布，曾在吉林省严重发生。我国生产中缺乏相应的抗炭疽病种质资源，因此玉米炭疽病在我国东北春玉米区发生呈逐年加重趋势，也威胁着黄淮海玉米产区。
目前，玉米炭疽病的防治主要是化学防治，多采用广谱性化学药剂，例如甲基硫菌灵、苯菌灵等。中国专利申请CN103563945A公开了一种含吡唑醚菌酯和丙硫菌唑的杀菌组合物及其应用。该杀菌组合物以吡唑醚菌酯和丙硫菌唑为主要有效成分，其中吡唑醚菌酯与丙硫菌唑的重量比为1～70：1～50。该杀菌组合物可以用于防治农作物的多种真菌性病害，包括叶枯病、锈病、白粉病、霜霉病、疫病、炭疽病、疮痴病、褐斑病、立枯病、灰霉病、黑星病、青霉病等。广谱性化学药剂的危害早已得到共识，寻找具有强拮抗作用的微生物防治植物病害是最理想的植保手段之一。
目前，用于玉米炭疽病生防的微生物鲜有报道，已报到的拮抗微生物也只是起辅助防治作用，例如假单胞杆菌在玉米炭疽病生防中的应用就是一种辅助性的防治手段。目前，尚没有对玉米炭疽病菌具有强抑制作用的微生物的报道。
由于已知的能够抑制玉米炭疽病菌的微生物的拮抗作用不能满足病害防治需要，且此类微生物的种类屈指可数。因此，筛选对玉米炭疽病菌具有生防作用的微生物，尤其是筛选定植能力和对玉米炭疽病菌具有强拮抗作用的微生物，对于实现玉米炭疽病的生物防治意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型微生物，其对玉米炭疽病菌具有强拮抗作用并易于定植。
本发明的另一个目的是提供上述新型微生物在玉米炭疽病生防中的应用，以显著提升玉米炭疽病生防效果。
本发明的再一个目的是提供一种生防制剂，其使用方便，并可以显著提升玉米炭疽病生防效果。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌的16SrDNA含有如SEQIDNO:1所示的序列。
根据本发明所述的枯草芽孢杆菌，优选地，所述枯草芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11489。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌在玉米炭疽病生防中的应用为，利用以上所述的枯草芽孢杆菌抑制玉米炭疽病菌。
根据本发明提供的所述应用，优选为，将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂施于玉米叶片上，使所述枯草芽孢杆菌在玉米叶片上定植，抑制玉米炭疽病菌。
根据本发明的所述应用，优选地，所述菌剂为含有所述枯草芽孢杆菌的悬浮液。
根据本发明的所述应用，优选地，所述悬浮液中的枯草芽孢杆菌的浓度为108～1012个/毫升。
根据本发明的所述应用，优选地，所述悬浮液中含有0.01～0.15重量％的助悬剂。
根据本发明的所述应用，优选地，将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上的方法为，将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂制成枯草芽孢杆菌的浓度为106～1010个/毫升的喷液进行喷雾。
所述枯草芽孢杆菌的形态为芽孢。
本发明提供的一种生防制剂为本发明的上述应用中的所述悬浮液。
本发明提供的枯草芽孢杆菌为玉米炭疽病的生防提供了具有强拮抗作用并易于定植的新型微生物。本发明提供的枯草芽孢杆菌在玉米炭疽病生防中的应用，是一种高效稳定的玉米炭疽病生防方法，其利用了所述枯草芽孢杆菌在玉米叶片上易于定植且对玉米炭疽病菌具有强拮抗作用的特点，能够更好地满足农业生产中防治玉米炭疽病的要求。
附图说明
图1-1、1-2和1-3分别为所述枯草芽孢杆菌的菌落以及油镜和电镜下的菌体形态；
图2为枯草芽孢杆菌D1的16SrDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为枯草芽孢杆菌D1的16SrDNA系统发育树；
图4-1和图4-2分别为用于检验枯草芽孢杆菌D1对玉米炭疽病生防作用的试验中对照和处理条件下玉米炭疽病菌菌落形态；
图5-1和图5-2分别为芽孢杆菌对玉米炭疽菌分生孢子萌发影响实验的对照和处理的显微图像。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明所述的“生防”是植物保护领域的常用术语，即，“生物防治”的简称。
在没有特别说明的情况下，本发明所述的枯草芽孢杆菌可以为营养体，也可以为芽孢。
本发明提及的“D1”为本发明的枯草芽孢杆菌在研发过程的代号，为了表述方便，本发明继续沿用。
<枯草芽孢杆菌>
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌的16SrDNA含有如SEQIDNO:1所示的序列。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌，是从河南新乡的玉米炭疽病发生田的玉米叶片表面分离、筛选和培养而得的菌株，其对于玉米炭疽病具有稳定而显著的拮抗效果，经微生物学形态分类与分子鉴定，属于枯草芽孢杆菌。
所述枯草芽孢杆菌接种于LB培养基平板上，30℃，培养24小时。菌落呈淡黄色半透明，表面稍粗糙，有隆起，边缘不规则。显微观察细菌菌株D1菌体呈杆状，两端钝圆，长2.1-3.1μm，宽0.7-0.8μm。图1-1、1-2和1-3分别为所述枯草芽孢杆菌的菌落以及油镜和电镜下的菌体形态。
所述枯草芽孢杆菌的16SrDNA的扩增方法为：挑取少量菌落，置于PCR管中，加入20μL去离子水，95℃处理10分钟，冷却后作为PCR模板，用于扩增16SrDNA序列。
扩增所用引物为细菌16SrDNA序列通用引物27F和1492R。正向引物为如SEQIDNO:2所示的引物(27F)，反向引物为如SEQIDNO:3所示的引物(1492R)。
PCR扩增体系为20μL：模板1μL，引物1和2各1μL，Taq酶0.3μL，Buffer2μL，dNTP1.2μL，其余用dd水补足。扩增条件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，30循环，72℃5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小为1500bp左右，凝胶成像参见附图2所示。
经序列分析D1的16SrDNA序列长度约为1500bp。将D1的16SrDNA序列进行BLAST比对分析，结果显示D1菌株与B.subtilis的相似度最高，达到了99％。
将得到的16SrDNA序列与GenBank的核苷酸数据库进行BLAST比对，获得相近的16SrDNA序列，用MEGA5.0的Neighbor-joining法构建系统进化树。参见图3所示，D1菌株与B.subtilis的进化距离最短，位于同一分支，是B.subtilis的近似种。结合形态特征和分子鉴定，将D1菌株确定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
本发明提供的枯草芽孢杆菌已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2015年10月13日，保藏号是CGMCCNo.11489，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。
<枯草芽孢杆菌在玉米炭疽病生防中的应用>
本发明提供的枯草芽孢杆菌在玉米炭疽病生防中的应用为，利用以上所述的枯草芽孢杆菌抑制玉米炭疽病菌。具体操作手段为，将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂施于玉米叶片上，使所述枯草芽孢杆菌在玉米叶片上定植，控制玉米炭疽病菌。
将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂施于玉米叶片上的时期可以为任一时期；优选为六叶期以后，且在吐丝期之前为好；更优选为六叶期到十叶期，这个时期的玉米植株具有了易于承载菌剂的叶片面积，而且炭疽病一般不会发展到严重的程度，所以利用发挥较好的防控效果。
将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上的方法可以采用本领域通常采用的喷施法，即，利用喷雾设备将含有所述枯草芽孢杆菌的喷液喷到玉米植株上。所述喷液的枯草芽孢杆菌的浓度可以参照普通生防菌喷液的浓度，例如可以为106～1010个/毫升，优选为107～109个/毫升。所述喷液的喷施量可以为2～20升/亩，优选为5～10升/亩，以多次喷施为佳。
所述喷液可以直接由各种形式和浓度的含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂配置而成。所述悬浮液中的所述枯草芽孢杆菌的浓度，可以为108～1012个/毫升，优选为108～1010个/毫升。所述悬浮液中可以含有0.01～0.15重量％的助悬剂。所述助悬剂可以为本领域常用的各种助悬剂，例如可以选自吐温、羧甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、甘露醇、山梨醇等，优选为吐温，更优选为吐温80。在本发明的一个优选实施方式中，用以配置所述喷液的菌剂为由所述枯草芽孢杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。所述悬浮液中助悬剂的重量百分数优选为0.02～0.1重量％，更优选为0.03～0.08重量％。
用以配置所述喷液的菌剂中的枯草芽孢杆菌可以为其营养体或芽孢。优选为芽孢，芽孢代谢相对静止，抗逆能力强，能够长期保存，利于开发为菌剂。所述枯草芽孢杆菌的芽孢可以采用如下方法而获得：利用LB或NA培养基，在30～32℃温度下培养枯草芽孢杆菌3～5天，大量产生枯草芽孢杆菌的芽孢。
<生防制剂>
含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂就是本发明要保护的生防制剂。所述生防制剂通常为含有枯草芽孢杆菌的悬浮液，优选地，所述悬浮液含有0.01～0.15重量％的助悬剂。所述悬浮液可以由所述枯草芽孢杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的。所述悬浮液中的所述枯草芽孢杆菌的浓度，可以为107～1012个/毫升，优选为108～1010个/毫升。所述悬浮液中助悬剂的重量浓度优选为0.02～0.1重量％，更优选为0.03～0.08重量％。所述助悬剂可以为本领域常用的各种助悬剂，例如可以选自吐温、羧甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、甘露醇、山梨醇等，优选为吐温，更优选为吐温80。
用以配置所述喷液的菌剂中的枯草芽孢杆菌可以为其营养体或芽孢。优选为芽孢，芽孢代谢相对静止，抗逆能力强，能够长期保存，利于开发为菌剂。所述枯草芽孢杆菌的芽孢可以采用如下方法而获得：利用LB或NA培养基，在30～32℃温度下培养枯草芽孢杆菌3～5天，大量产生枯草芽孢杆菌的芽孢。优选的保存温度为23～28℃，更优选为24～26℃。
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
以下实施例涉及到的各种培养基都是本领域常用的标准培养基，例如：
LB液体培养基为胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，氯化钠1％(w/v)，pH7.0-7.2。
LB固体培养基(简称LB培养基)是在上述LB液体培养基的基础上添加了琼脂1.5-2％(w/v)，即为胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，氯化钠1％(w/v)，pH7.0-7.2。
实施例1
本发明的枯草芽孢杆菌对玉米炭疽病菌抑制作用的鉴定：
纯化后的枯草芽孢杆菌(D1菌株)，单菌落接种在LB培养基上，30℃培养24h。挑取一接种环接入装有100mL的LB液体培养基的250mL三角瓶中，在30℃，200rpm/min的条件下振荡培养24h。菌悬液经12000rpm离心，再经孔径0.22μL细菌过滤器过滤。吸取1mL滤液加入到19mL的43℃左右的PDA培养基中，混匀，待培养基冷却后，接入直径5mm玉米炭疽病菌菌饼，25℃培养。无菌水为对照。每个处理3次重复。培养7d后，采用十字交叉法测量菌落直径。计算抑制率。
抑制率＝[(对照菌直径－处理菌直径)/(对照菌直径－菌饼直径)]×100％。
参见图4-1和图4-2，在对照处理下，玉米炭疽病菌生长快速，生长7天的菌落直径为8.84cm，而加入菌株D1发酵液的PDA培养基上，玉米炭疽病菌生长缓慢，菌落直径为2.23cm，因此计算抑菌率为79.3％。
实施例2
本发明的枯草芽孢杆菌D1对玉米炭疽病菌分生孢子萌发的抑制实验：
将玉米炭疽菌在PDA培养基上培养4d，无菌水冲洗并收集分生孢子，配成浓度106个/mL孢子悬浮液。取80μL孢子悬浮液与20μL的D1菌株发酵液混合，置于预先涂有石蜡的凹玻片上，25℃培养，24h，观察孢子萌发状况。以无菌水为对照。
参见图5-1，在对照处理下，分生孢子正常萌发，产生芽管，顶端生成黑色附着胞。参见图5-2，在本发明的枯草芽孢杆菌D1发酵液处理下，分生孢子也能萌发，但分生孢子顶端膨大成球形，未形成附着胞。这种情况下，玉米炭疽菌不能侵染玉米叶片。
实施例3
本发明的生防制剂(悬浮液菌剂)的制备方法：
LB培养基，培养3d，30-32℃，即可产生大量芽孢。用含有0.05重量％的吐温80的无菌水将芽孢配制成悬浮液，浓度为108个/mL，25℃保存。
其他保存温度的对比试验：
分别在4℃、20℃、25℃、30℃保存1个月、2个月，检测枯草芽孢杆菌菌体活力，发现25℃条件下，菌体活力最强，未见衰退，且保存期1个月和2个月菌体活力无显著差别，因此选择该条件为芽孢的保存条件。
实施例4
在玉米植株上测试本发明的枯草芽孢杆菌在玉米炭疽病生防中的应用的效果。
该测试为温室盆栽试验，尽量排除外界干扰条件。温室位于中国农业科学院植物保护研究所。玉米品种为Mo17，对炭疽病高感；营养基质为草炭：蛭石按照2：1比例混合。将玉米种子种于营养钵中，待六叶期，将实施例3得到悬浮液稀释10倍，通过喷雾法喷到玉米叶片上，24h后，再通过喷雾法将玉米炭疽菌分生孢子接种到玉米叶片，浓度为106个/mL。对照为无菌水，然后接种同样的玉米炭疽分生孢子悬浮液。对照30株玉米，处理30株玉米。每株玉米喷洒枯草芽孢杆菌菌剂10倍稀释液2mL、玉米炭疽菌分生孢子悬浮液2mL和无菌水2mLmL。温室环境温度为28～30℃，相对湿度80％。培养14d检查玉米叶片发病情况，统计病情指数，计算防效。利用本发明实施例3的悬浮液处理的玉米叶片炭疽病发病率病情指数为14，而对照下病情指数为39，实施例3的悬浮液的平均防效为64.1％。
实施例5
枯草芽孢杆菌D1在玉米叶片定植能力检测：
实施例4的试验中，调查玉米炭疽病病情指数的同时，采回玉米叶片，分离叶片表面细菌，并鉴定是否存在枯草芽孢杆菌。用无菌水刷洗玉米叶片表面微生物到1.5mL离心管中，12000rpm离心3min，弃上清后，加入无菌水后重悬，将悬浮液涂布在LB培养基表面，30℃培养24h，待细菌菌落长出后，纯化菌落，并进行16SrDNA鉴定。经鉴定，从玉米叶片表面能够分离出枯草芽孢杆菌，占所有分离细菌总数的18.5％。由此可见，枯草芽孢杆菌在玉米叶片的定植能力很好，能够持续的发挥生防效果。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。