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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610104350.1 (22)申请日 2016.02.25 C12N 5/09(2010.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) (71)申请人 李亮亮 地址 451252 河南省郑州市巩义市芝田镇喂 庄村李家巷 13 号 (72)发明人 李亮亮 (54) 发明名称 一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及生物医学领域， 尤其涉及一种癌 细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒。该方法步骤 包括 ： 将癌细胞或细菌样品与 NTA 功能化载体、 靶 标结合蛋白及 Ni2+ 共。
2、同孵育， 便可实现癌细胞或 细菌的高效捕获 ； 并且， 将捕获有癌细胞或细菌 的 NTA 功能化载体与金属离子螯合剂共同孵育， 还可轻松实现癌细胞或细菌的可控释放。本发明 提供的方法特异性强、 灵敏度高， 能够简便、 快速、 可逆地实现癌细胞或细菌的捕获及释放， 且对癌 细胞或细菌的生物活性影响较小。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105524887 A 2016.04.27 CN 105524887 A 1.一种捕获癌细胞或细菌的方法， 其特征在于， 将NTA功能化载体与含有靶标结合蛋白 和Ni2+的样品。
3、共同孵育； 所述靶标结合蛋白中包括组氨酸标签和能够与癌细胞或细菌特异 性结合的蛋白或抗体。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述Ni2+的浓度为80 mol/L220 mol/ L。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述共同孵育后还包括释放步骤， 具体 为捕获有癌细胞或细菌的NTA功能化载体与金属离子螯合剂孵育。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述金属离子螯合剂的浓度为80 mol/L 220 mol/L。 5.根据权利要求14任一项所述的方法， 其特征在于， 所述靶标结合蛋白为带有组氨 酸标签的转铁蛋白或带有组氨酸标签的伴刀豆蛋白。 6.根据权。
4、利要求14任一项所述的方法， 其特征在于， 所述样品为菌液、 细胞悬液、 血 液或组织匀浆。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述样品为细胞悬液、 血液或组织匀浆， 其 中癌细胞的浓度为95个/mL110个/mL； 所述样品为菌液、 血液或组织匀浆， 其中细菌的浓 度为98CFU/mL113CFU/mL。 8.根据权利要求14任一项所述的方法， 其特征在于， 所述NTA功能化载体的制备方法 包括： 将羟基化的载体依次与3-氨丙基三乙氧基硅烷、 N,N -琥珀酰亚胺基碳酸酯、 N-(5-氨 基-1-羧基戊基)亚胺基乙酰乙酸孵育后制得NTA功能化载体。 9.一种癌细胞或细菌的捕获试剂。
5、盒， 其特征在于， 包括NTA功能化载体、 靶标结合蛋白、 结合剂和释放剂； 所述靶标结合蛋白包括带有组氨酸标签的能够与癌细胞或细菌特异性结合的蛋白或 抗体； 所述结合剂中包括Ni2+； 所述释放剂中包括金属离子螯合剂。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述靶标结合蛋白为带有组氨酸标签 的转铁蛋白或带有组氨酸标签的伴刀豆蛋白； 所述金属离子螯合剂为EDTA。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524887 A 2 一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物医学领域， 尤其涉及一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒。 背景技术 0002 在生物。
6、医学领域， 癌细胞和病原细菌是两类非常重要的生物靶标。 对二者的高灵 敏度分析检测对于相关疾病(癌症和病原细菌引起的感染疾病)的早期诊断来说， 具有极为 重要的意义。 然而， 大多数情况下待测样品中癌细胞及病原细菌的浓度比较低(痕量级别)， 实现对其的直接生化分析和基因分型鉴定具有较大难度。 因此在癌细胞和病原细菌的实际 检测过程中， 需经过一个 “捕获-释放” 的过程， 首先对待测靶标进行有效捕获， 实现对其的 分离富集， 然后再将富集的靶标释放并对其进行最终的生化分析和基因分型鉴定。 因此， 为 实现对癌细胞和病原细菌的高灵敏度分析检测， 发展一种有效的生物捕获及可控释放通用 策略至关重要。
7、。 0003 目前， 针对癌细胞和病原细菌的捕获及可控释放技术主要有DNA适配体法、 温控法 和微流控法。 DNA适配体法是基于DNA适配体对相应靶标高特异性的亲和能力来实现癌细胞 和病原细菌的特异捕获， 并利用DNA酶裂解适配体来实现捕获靶标的可控释放。 温控法是基 于热敏型聚合物在不同温度下其亲疏水性质的变化来实现癌细胞和病原细菌的温控捕获 和释放。 微流控法主要依据待测靶标尺寸的大小来构建相应的微流控捕获芯片， 并通过控 制微流剪切力的方向和大小来实现癌细胞和病原细菌的可控释放。 0004 但是， DNA适配体法、 温控法和微流控法都存在着各自的缺点。 DNA适配体法无法实 现可逆的靶标。
8、捕获和可控释放， 只能满足单次癌细胞和病原细菌特异捕获和释放的要求。 温控法涉及复杂的温敏聚合物合成步骤， 其中使用的有机分子对生物靶标的活性有一定影 响， 从而降低了最终癌细胞和病原细菌的检测准确性和灵敏度。 微流控法需根据不同靶标 尺寸的大小精确控制微流控捕获芯片的结构， 制备过程复杂， 而且基于微流剪切力的靶标 释放过程会降低癌细胞和病原细菌的活性。 0005 因此， 进一步建立一种针对癌细胞和病原细菌的生物捕获及可控释放通用策略十 分必要。 发明内容 0006 有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供一种癌细胞或细菌的捕获方法及其 试剂盒。 该方法特异性强、 灵敏度高， 能够简便、 。
9、快速、 可逆地实现癌细胞或细菌的捕获及释 放， 且对癌细胞或细菌的生物活性影响较小。 0007 为了实现上述发明目的， 本发明提供如下技术方案： 0008 本发明提供了一种癌细胞或细菌的捕获方法， 该方法将NTA功能化载体与含有靶 标结合蛋白和Ni2+的样品共同孵育； 靶标结合蛋白中包括组氨酸标签和能够与癌细胞或细 菌特异性结合的蛋白或抗体。 NTA为次氮基三乙酸， 组氨酸标签(His-tag)为多个成串组氨 酸的肽段。 研究表明， NTA在Ni2+存在条件下会与含有组氨酸(His)的分子通过螯合作用非 说明书 1/4 页 3 CN 105524887 A 3 共价结合到一起， 且此非共价结合。
10、作用在有螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA)存在的情况下 可被打破。 本发明利用该原理， 构建了NTA功能化载体， 使其在Ni2+存在的条件下， 与靶标蛋 白(携带有His-tag的能够与癌细胞或细菌特异性结合的蛋白或抗体)相结合， 进而实现对 癌细胞或细菌的捕获。 由于靶标结合蛋白与细胞或细菌的结合为特异性结合， 所以所捕获 的癌细胞或细菌皆可具有良好的纯度。 经实验证实， 采用本发明提供的方法对癌细胞的捕 获率可达95； 对细菌的捕获率可达96。 当需要将癌细胞或细菌释放时， 以含有金属离子 螯合剂的溶液作为释放剂， 便可实现癌细胞或细菌的释放。 实验表明， 使用本发明提供的方 法在捕获后，。
11、 对癌细胞的释放率可达87， 对细菌的释放率可达85， 且对癌细胞或细菌的 生物活性影响较小。 0009 在本发明的实施例中， 因转铁蛋白(TRF)对癌细胞具有特异性结合的能力。 而伴刀 豆蛋白(ConA)对细菌具有特异性结合能力。 因而本发明选用了His-tag转铁蛋白作为捕获 癌细胞的靶标结合蛋白， 而选择His-tag伴刀豆蛋白作为捕获细菌的靶标结合蛋白。 0010 在本发明提供的一些实施例中， His-tag-转铁蛋白的浓度为30 g/mL。 0011 在本发明提供的一些实施例中， His-tag-伴刀豆蛋白的浓度为30 g/mL。 0012 在本发明提供的一些实施例中， His-ta。
12、g中组氨酸的个数为6个。 0013 在本发明提供的一些实施例中， 采用His-tag转铁蛋白捕获宫颈癌细胞； 采用His- tag-伴刀豆蛋白捕获大肠杆菌。 0014 本发明对结合剂中的阴离子不做限定， 在一些实施例中， Ni2+由硝酸镍或硫酸镍 提供。 0015 在本发明提供的一些实施例中， Ni2+的浓度为100 mol/L200 mol/L。 0016 作为优选， Ni2+的浓度为100 mol/L。 0017 在本发明提供的一些实施例中， 捕获过程中样品与结合剂Ni2+共同孵育的温度为 2537， 时间为30min120min。 0018 作为优选， 捕获过程中样品与结合剂Ni2+共同。
13、孵育的温度为25， 时间为60min。 0019 本发明提供的方法只需将癌细胞或细菌样品与NTA功能化载体、 靶标结合蛋白及 Ni2+共同孵育， 便可实现癌细胞或细菌的高效捕获。 另外， 为更好满足后续癌细胞或细菌生 化分析和基因分型鉴定的需要， 将捕获有癌细胞或细菌的NTA功能化载体与金属离子螯合 剂共同孵育， 还可轻松实现癌细胞或细菌的可控释放。 0020 为了实现癌细胞或细菌的可控释放， 在本发明的实施例中， 共同孵育后还包括释 放步骤， 具体为捕获有癌细胞或细菌的NTA功能化载体与金属离子螯合剂孵育。 0021 作为优选， 金属离子螯合剂的浓度为100 mol/L200 mol/L。 。
14、0022 在本发明提供的一些实施例中， 金属离子螯合剂为EDTA。 0023 在本发明提供的一些实施例中， 金属螯合剂的浓度为100 mol/L 0024 在本发明提供的一些实施例中， 在癌细胞或细菌释放过程中， NTA功能化载体与金 属螯合剂孵育的温度为2537， 时间为10min30min。 0025 作为优选， 在癌细胞或细菌释放过程中， NTA功能化载体与金属螯合剂孵育的温度 为25， 时间为20min。 0026 在本发明的实施例中， 样品为细胞悬液、 血液或组织匀浆。 0027 在本发明提供的一些实施例中， 样品中癌细胞浓度为102个/mL106个/mL； 说明书 2/4 页 4 。
15、CN 105524887 A 4 0028 作为优选， 样品中细胞的密度为2104个/mL。 0029 在本发明中， 样品为菌液、 血液或组织匀浆。 0030 在本发明提供的一些实施例中， 样品中细菌的浓度为103CFU/mL107CFU/mL。 0031 作为优选， 菌液中细菌的密度为106CFU/mL。 0032 本发明中所述的NTA功能化载体可为自行制备也可参照本发明提供的方法制得。 经修饰后的载体可单次使用， 也可反复使用， 或可在使用前重新制备。 本发明对此不做限 定， 其实施皆在本发明的保护范围之内。 0033 在本发明中， NTA功能化载体的制备方法包括： 将羟基化的载体依次与3。
16、-氨丙基三 乙氧基硅烷、 N,N -琥珀酰亚胺基碳酸酯、 N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚胺基乙酰乙酸孵育后 制得NTA功能化载体。 0034 在本发明的实施例中， 本发明提供的试剂盒采用His-tag-转铁蛋白捕获癌细胞； 采用His-tag-伴刀豆蛋白捕获细菌。 0035 在本发明一些实施例中， 本发明提供的试剂盒采用His-tag-转铁蛋白捕获宫颈癌 细胞； 采用His-tag-伴刀豆蛋白捕获大肠杆菌。 0036 在本发明提供的一些实施例中， His-tag-转铁蛋白的浓度为30 g/mL。 0037 在本发明提供的一些实施例中， His-tag-伴刀豆蛋白的浓度为30 g/mL。 00。
17、38 本发明提供了一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒。 该方法步骤包括： 将癌 细胞或细菌样品与NTA功能化载体、 靶标结合蛋白及Ni2+共同孵育， 便可实现癌细胞或细菌 的高效捕获； 并且， 将捕获有癌细胞或细菌的NTA功能化载体与金属离子螯合剂共同孵育， 还可轻松实现癌细胞或细菌的可控释放。 本发明提供的方法特异性强、 灵度高， 能够简便、 快速、 可逆地实现癌细胞或细菌的捕获及释放， 且对癌细胞或细菌的生物活性影响较小。 具体实施方式 0039 本发明提供了癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒， 本领域技术人员可以借鉴本 文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换。
18、和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳 实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文的方法和 应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0040 本发明采用的试剂皆为普通市售品， 皆可于市场购得。 0041 利用MTT实验对实施例6释放的癌细胞的活性进行了考察。 实验以未经捕获过的癌 细胞为对照样品。 分别于培养1天、 2天、 3天进行细胞活性检测。 结果显示， 与对照组同等浓 度的Hela细胞相比， 实施例6释放的Hela细胞的MTT吸收在三天内没有明显降低， 说明捕获 的癌细胞释放。
19、后活性基本没有受到影响。 0042 将实施例2制得的NTA功能化载体浸没到不同浓度的E.coli细菌(浓度106CFU/mL) 样品中， 然后再向其中加入His-tag-伴刀豆蛋白和Ni2+， 使其最终浓度分别为30 g/mL和 100 M， 室温共同孵育1小时进行捕获。 将捕获后的载体进行荧光标记观察， 可见NTA功能化 载体上分布有大量细菌， 说明该载体可以将大肠杆菌特异捕获。 经过对捕获后细菌样品中 剩余细菌进行涂板计数， 计算其捕获效率。 0043 捕获效率()捕获细菌数(个)/细菌总数(个)。 说明书 3/4 页 5 CN 105524887 A 5 0044 经计算， 对不同浓度的。
20、细菌捕获效率可达94。 0045 实施例10细菌的捕获 0046 将实施例2制得的NTA功能化载体浸没到不同浓度的E.coli细菌(浓度103CFU/mL) 样品中， 然后再向其中加入His-tag-伴刀豆蛋白和Ni2+， 使其最终浓度分别为30 g/mL和 100 M， 室温共同孵育1小时进行捕获。 经过对捕获后细菌样品中剩余细菌进行涂板计数， 计 算其捕获效率。 0047 捕获效率()捕获细菌数(个)/细菌总数(个) 0048 经计算， 对不同浓度的细菌捕获效率可达89。 0049 实施例11细菌的捕获 0050 将实施例2制得的NTA功能化载体浸没到不同浓度的E.coli细菌(浓度107CFU/mL) 样品中， 然后再向其中加入His-tag-伴刀豆蛋白和Ni2+， 使其最终浓度分别为30 g/mL和 200 M， 室温共同孵育1小时进行捕获。 经过对捕获后细菌样品中剩余细菌进行涂板计数， 计 算其捕获效率。 0051 以上仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。 说明书 4/4 页 6 CN 105524887 A 6 。