本申请是分案申请，原申请的申请日为2008年8月22日，申请 号为200880113585.0(PCT/US2008/009991)，发明名称为“使用miRNA 检测体内细胞死亡情况的方法”。
相关申请
该申请要求于2007年8月22日提交的U.S.临时申请第60/965,871 号的利益，其全部内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明提供了分离和检测体液中脱细胞小RNA特别是微小RNA (miRNA)序列的非介入性的方法。更具体地说，本发明涵盖通过分析 尿液和其它体液中miRNA的水平(用于临床诊断和治疗监测)检测体 内细胞死亡情况的方法。
发明背景
细胞死亡是多细胞生物体发育和机能的正常部分。作为自然过 程，细胞死亡涉及许多由内部因素引起的疾病的病理学。细胞死亡还 伴随着由外部的物理、化学、生物试剂引起的疾病的发生。
存在两种主要类型的细胞死亡：坏死和凋亡，它们表现出不同的 形态特性和分子特性(Kerr等,Br.J.Cancer.26,239-257(1972)； Umansky,Theor.Biol.97,591-602(1982)；Umansky等,AdvPharmacol. 41,383-407(1997)；Ameisen,CellDeathDiffer.11,4-10(2004)； Lockshin等.IntJBiochemCellBiol.36,2405-19(2004)；G.Kroemer, 等,CellDeathandDifferentiation12,1463-1467(2005))。坏死被认为直 接由严重的分子和/或结构损害的引起的灾难性代谢失效，并导致炎症 和对周围细胞的继发性损害。凋亡是比坏死普遍得多的生物学现象， 可由特定信号如激素、细胞因子；由特定信号如生长或粘附因子的缺 乏或由不造成灾难性地失去完整性的分子损伤所诱导。凋亡是积极的 细胞应答的结果，后者涉及分子事件有序和特定级联的开始。凋亡导 致各种现象的出现：染色质浓缩和边缘化、核碎裂、细胞萎缩、胞膜 起泡和核DNA的酶促核小体间断裂(enzymaticinternucleosomal fragmentation)(Umansky等，BiochimBiophysActa.655，9-17(1981)； Arends等，AmJPathol.136，593-608(1990))。还有文献描述以特定形 态学为特点的其它更罕见的细胞死亡模式，例如所谓的自体吞噬细胞 死亡(Bredesen等，Stroke.38(2Suppl)：652-660(2007)。
无论细胞死亡的特定机制和类型如何，检测死亡细胞类型的方法 对于各种疾病的诊断是重要的，对于疾病和治疗监测是关键的，对于 不同的诊断是有帮助的。此外，能够检测体内特定细胞死亡的方法对 于开发预防或诱导细胞死亡的药物以及对于新开发药物细胞毒性的 分析是有用的。
现存某些对与疾病相关的过度细胞死亡的诊断的临床试验，其基 于对组织特异性标记物如血液或其它体液中的抗原、酶和其它蛋白的 检测。例如，血液中肝特异性酶活性的测定是一种广泛使用的肝细胞 死亡评价方法(Amacher，等，RegulToxicolPharmacol.Apr；27(2)：1 19-130(1988)；Salaspuro，等，Enzyme37：87-107(1987)；Herlong，Hosp. Pract.(OffEd).29(11)：32-38(1994))。对心肌细胞特异抗原水平的评价 已用于诊断心肌梗塞(Mair等，ClinChemLabMed.37：1077-1084 (1999)；Nunes等，RevPortCardiol.20：785-788(2001))。然而，这种技 术的数量仅限于某些疾病，所述疾病中标记物和检测方法是已知的， 可用于提供有意义的、组织特异性结果的分析(OhS等，Curr GastroenterolRep.3：12-18(2001)；Rochling等，ClinCornerstone.3(6)： 1-12(2001))。其它方法需要对怀疑有疾病状态的特定组织进行介入性 .活检以获取分析样本。然而，某些器官和组织如大脑的活检是高度介 入性的，因而往往难以实施。
已知凋亡即程序性细胞死亡(哺乳动物机体中主要的细胞死亡形 式)伴随着核DNA的核小体间断裂。很多实验室证明了一部分这种 DNA出现在血液中(LoY.M.AnnNYAcadSci.945：1-7(2001)； Lichtenstein等，AnnNYAcadSci.945：239-249(2001)；Taback等，Curr OpinMoITher.6：273-278(2004)；Bischoff等，HumReprod Update.8：493-500，(2002))。已经证明这种断裂的DNA(称之为跨肾DNA (Tr-DNA))跨过肾屏障并可在尿液中检测到(Botezatu等，ClinChem. 46：1078-1084，(2000)；Su等，JMolDiagn.6：101-107(2004)；Su等，Ann NYAcadSci.1022：81-89(2004)。
尽管脱细胞血浆DNA和Tr-DNA都可被用作诊断工具，但是当 评估组织特异性事件如细胞死亡时它们提供的方法相当有限。因此， 提供更广范围的特定病理学适应症的非介入性分析方法，因其检测特 定组织和器官中死亡细胞水平的能力，而可用于诊断和监测患者不同 疾病状态或病理学状况。另外，提供用于监测患者对疾病治疗反应的 工具的组织特异性分析方法可用于确定治疗效果，并且在药物治疗情 况下可用于确定给药所需的最适剂量。
为了解决这些问题，本发明致力于作为监测体液如血清或尿液中 体内细胞死亡的诊断工具的微小RNA(miRNA)的应用。与脱细胞血浆 DNA和Tr-DNA不同的是，许多miRNA显示细胞、组织和器官特异 性表达概况(Liang等，Genomics，8：166(2007)；Lukiw等，Neuroreport. 18：297-300(2007)；Lagos-Quintana等，CurrBiol.12：735-739(2002)； Chen等，NatGenet.38：228-233(2006)；Beuvink等，J.NucleicAcidsRes. 35：e52(2007))。此外，已证明了miRNA细胞和组织特异概况与不同 病理学和肿瘤类型的相关性(VisoneR.，等Oncogene.26：7590-7595 (2007)；Nelson等，NeuropatholExpNeurol.66：461-468(2007)；Negrini 等，JCellSci.120：1833-1840(2007)；Chang等，AnnuRevGenomics HumGenet.8：215-239(2007)；Jay等，CellBiol.26：293-300(2007))。
因此，本发明提供了通过检测具有特定病理学特征的组织特异性 miRNA来测量体液如血清或尿液中体内细胞死亡的方法。基于检测体 液中miRNA的本方法可用于进一步开发诊断或监测试验。
发明概述
本发明涉及以下新方法：通过分析从体液获得的脱细胞核酸的特 定miRNA序列的水平来检测和测量体内细胞死亡，所述miRNA来源 于整个身体的细胞死亡；以及用所得到的分析结果确定患者疾病状态 或异常的医学病症。
本发明方法基于脱细胞核酸在阴离子交换剂上的吸附和洗脱，这 使得浓缩和分离大于10个核苷酸的核酸片段成为可能。具体而言， 本发明证明了：(i)miRNA在体液中的存在；(ii)在尿液中对来源于位 于泌尿系统外部器官的miRNA(例如跨肾miRNA(Tr-miRNA))的检 测，这意味着所述miRNA已跨越了肾屏障；(iii)对血清中的miRNA 的检测，(iv)与特定细胞、组织和/或器官中细胞死亡相关的病理伴随 着所述器官特异性miRNA水平的变化。
本发明提供了以下方法：检测和定量体液中细胞、组织和/或器官 特异性脱细胞miRNA，以评价各种组织和器官中的体内细胞死亡情 况，其中体内细胞死亡情况与特定组织和/或器官(含有从受试对象获 得的体液样品)的疾病相关；对所述体液样品进行针对一种或多种特定 miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步骤：用与所述特定 miRNA序列的一部分基本上互补的引物和/或探针检测所述miRNA。 在本发明某些实施方案中，体内细胞死亡过度或不足与特定组织疾病 有关。
在本发明的一个实施方案中，体液是尿液。在另一个实施方案中， 所述尿样分析方法包括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚合 酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和连 接酶链式反应。然而在另一个实施方案中，减少所述尿样中的核酸降 解。
本发明的方法包括减少核酸降解作用，其包括通过以下方式抑制 核酸酶活性：添加一种或多种RNA酶抑制剂；热灭活或者用选自盐 酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基硫酸钠的化合物处理 所述尿样。在本发明的一个实施方案中，尿样在膀胱中停留的时间低 于12个小时。
在本发明的一个实施方案中，体液是血清。本发明的方法包括对 血清样品的分析，其包括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚 合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和 连接酶链式反应。
然而在另一个实施方案中，本发明的方法包括检测脱细胞 miRNA，其作为用于与组织或器官中细胞死亡过度或不足相关的特定 疾病的特定标记物。任选地，所述疾病是病原体感染。优选所述病原 体是病毒。更优选所述病毒是埃巴病毒。任选地，所述疾病是脑中风、 阿尔茨海默病、帕金森病、与怀孕和/或胎儿相关的疾病或唐氏综合症。
本发明提供了检测因与组织或器官中细胞死亡过度或不足相关 的疾病而在受试对象的不同器官和组织(包括非泌尿系统区域)中产 生的尿液脱细胞miRNA的方法，所述方法包括：从受试对象获得尿 样，以及对所述尿样进行针对一种或多种特定miRNA序列的分析， 其中所述分析包括以下步骤：用与所述特定miRNA序列的一部分基 本上互补的引物和/或探针检测所述miRNA。
本发明方法提供了通过定量分析体液中特定脱细胞miRNA以在 受试对象中监测疾病和/或治疗的方法，所述方法包括：定期从受试对 象获取体液样品，并对所述样品进行针对一种或多种在目标细胞、组 织或器官中特异性/过量表达的特定miRNA序列的分析，其中所述分 析包括以下步骤：用与所述特定miRNA序列的一部分基本上互补的 引物和/或探针检测所述miRNA。在一个实施方案中，所述体液是尿 液。在另一个实施方案中，所述体液是血清。
附图简述
根据附图中所阐述的内容，从本发明实施方案更详细说明可得知 本发明上述和其它目标、特征和优点。附图对于范围、重点不是必需 的，而是旨在说明本发明的原理。
图1是用Q-SepharoseTM滤过的尿液中所提取核酸的聚丙烯酰胺 凝胶电泳的照片
图2是来源于EBV的BART1miRNA特异性RT-PCR产物的聚 丙烯凝胶分析照片
图3A-3G是表示脑中风后12和24小时时间点的经标准化的患者 尿样miRNA浓度的点图。
图4是表示miRNA129和219浓度变化与脑中风结果之间相关 性的图表。标记为o和□的患者在中风后一个月其临床状况改善，标 记为x的患者在中风后一个月临床状况恶化。
图5是表示阿尔茨海默病患者和同龄对照的未过滤尿样中经标准 化的miRNA浓度的点图。
图6是表示阿尔茨海默病患者和同龄对照的过滤尿样中经标准化 的miRNA浓度的点图。
图7是表示阿尔茨海默病患者和同龄对照的血清样品中经标准化 的miRNA浓度的点图。
图8是表示帕金森病患者和同龄对照的尿样中经标准化的 miRNA浓度的点图。
图9是表示怀有唐氏综合症胎儿和正常胎儿的孕妇尿样中经标准 化的miRNA-9浓度的点图。
发明详述
本发明技术是基于对存在于体液中的小RNA、尤其是包括跨肾 miRNA(Tr-miRNA)在内的特定微小RNA(miRNA)的发现，它们的浓 度反映了与器官损伤或其它病理学相关的细胞死亡。因此，这些核酸 序列以低于或高于对照组的水平存在，表明从中获取样品的患者中可 能存在异常或病理状况。
由于本发明方法所固有的非介入性特点，其提供了优于现有的诊 断、检测和监测方法的改进。
为了帮助理解本发明，许多术语定义如下：
术语“引物”是指当处于启动引物延伸的条件下能够用作合成起始 点的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以天然存在于纯化的限制性消化物 中，或者合成制备。
选定引物使其与模板的特异性序列链“基本上”互补。引物必须充 分地互补以与模板链杂交从而使引物延伸得以发生。引物序列无需反 映确切的模板序列。例如，引物的5′末端可连接有非互补的核苷酸片 段，而引物序列的剩余部分与上述链基本上互补。还可使非互补的碱 基或较长的序列散布在引物中，前提是引物序列与模板序列有足够的 互补性来实现杂交，并由此形成用于合成引物延伸产物的模板引物复 合体。
“靶”核酸是通过杂交、扩增或任何其它分析核酸序列的方法(包括 分析方法的组合)进行评价的miRNA序列。
“杂交”方法包括使互补序列与靶核酸序列(所分析的序列)退火。 两种含有互补序列的核酸多聚体互寻并经由碱基配对作用的退火的 能力是公认的现象。由Marmur和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46：453(1960)以及Doty等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA46：461(1960)提 出的“杂交”过程的最初观察结果现已改进成现代生物学的重要工具。 杂交包括但不限于狭线杂交、斑点杂交和印迹杂交技术。
对于某些诊断应用来说，重要的是确定杂交是否代表完全或部分 互补性。例如，当期需简单地检测病原体miRNA的存在或不存在时， 唯一重要的是，存在相应的序列时杂交方法确保杂交得以进行；当部 分互补的探针和完全互补的探针会发生杂交时，可选定条件。然而， 其它诊断应用可能需要区分部分互补性与完全互补性的杂交方法。检 测遗传多态性可能是受关注的。
本文所用术语“探针”是指寡核苷酸(即核苷酸序列)，无论是天然 存在于纯化的限制性消化物中或者是合成制备的，其由于探针中至少 一段序列与其它核酸中的序列的互补性或其它可重现的吸引作用方 式而与另一核酸序列形成双螺旋结构或其它复合体。探针可用于特定 基因序列的检测、鉴定和分离。预期本发明所使用的任何探针将用任 何“报告分子”来标记，以便可在任何检测系统中进行检测，所述系统 包括但不限于酶(例如ELISA和基于酶的组织化学分析)、荧光、放射 性和发光系统。进一步期望目标寡核苷酸(即待检测的目标寡核苷酸) 将用报告分子标记。还期望探针和目标寡核苷酸两者都被标记。没有 预期本发明受限于任何特定的检测系统或标记物。
本文所用术语“miRNA”是非编码的单链小RNA的子集，其长度 大约为18-23个核苷酸，在代谢过程的调节中起重要的作用，特别是 由于它们参与调节编码特定蛋白的mRNA的稳定性和翻译。miRNA 还参与其它重要的过程，如异染色质形成和基因组重排。
术语体内细胞死亡“过度”或“不足”描述以下情况：特定器官或组 织中死亡的细胞数分别高于或低于相应年龄和性别对照中的细胞数。
本文所用术语“纯化的”、“净化的”和“灭菌的”是指去除样品中的 一种或多种污染物。
本文所用术语“基本上纯化”和“基本上分离”是指以下核酸序列： 所述核酸序列从它们的自然环境中移出、分离或独立出来，并且优选 60％、更优选75％、最优选90％脱离与它们天然缔合的其它组分。因 此，“分离的多核苷酸”是基本上纯化的多核苷酸。预期为了实施本发 明的方法，多核苷酸可以但不必为基本上纯化。在本技术领域中已知 有很多以不纯的形式检测核酸序列的方法。
本文中所用术语“PCR产物”和“扩增产物”是指在变性、退火和延 伸的PCR步骤的二个或多个循环完成之后所得的化合物的混合物。这 些术语包括已扩增一种或多种靶序列的一种或多种片段的情况。
本文所用术语“尿道”是指参与尿液从身体分泌和排除的器官和通 道。
本文所用术语“患者”或“受试对象”是指治疗受体。包括哺乳动物 和非哺乳动物患者。在一个特定的实施方案中，患者是哺乳动物，如 人、犬、鼠、猫、牛、绵羊、猪或山羊。在特定的实施方案中，患者 是人。
在本发明的一个实施方案中，被检测的miRNA来源于并特异性 表达于体内的特定细胞类型、组织和器官中，其中所述miRNA水平 的变化表明所述组织的急性病状，例如与心肌细胞死亡相关的急性心 肌梗塞、与神经元和神经胶质细胞死亡相关的脑中风、与由病毒或其 它感染或毒素作用引起的肝细胞死亡相关的肝炎或肝硬化、与各种胰 腺细胞死亡相关的急性胰腺炎、与所移植器官的细胞过度死亡相关的 移植器官排斥作用、各种器官的创伤性伤害、各种急性感染例如与肺 部和/或其它感染器官细胞死亡相关的肺结核。
在本发明另一个实施方案中，所检测的miRNA来源于并特异性 表达于体内特定的细胞、组织或器官中，其中所述miRNA的水平变 化表明所述组织的慢性病状，例如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞痴 呆(frontotemporaldementia)和神经元死亡所引起或伴随的其它中枢神 经系统疾病、与心肌细胞死亡相关的慢性心力衰竭、与肺细胞死亡相 关的肺气肿、与胰腺β细胞的死亡相关的1型糖尿病、与肾细胞死亡 相关的肾小球性肾炎、与活跃增生的癌前细胞的凋亡死亡相关的癌前 病症、与由于供血不足所致的大量细胞坏死相关的癌症和慢性感染器 官或组织中的细胞死亡。
在本发明又一个实施方案中，所检测的miRNA来源于并特异性 表达于体内特定的细胞类型、组织或器官，并且所述miRNA的水平 变化表明理化试剂的细胞毒作用，例如与杀死骨髓细胞的相对低剂量 和导致胃肠系统上皮细胞死亡的较高剂量以及杀死脑神经元的更高 剂量相关的辐射；以及与由天然或合成的毒性化合物引起的各种器官 和组织的细胞死亡相关的化学细胞毒性。
在本发明再一个实施方案中，所检测的miRNA来源于并特异性 表达于体内特定的细胞类型、组织或器官并可被用于疾病结果的预 后。显示疾病发展/消退、治疗或手术介入的成功的相应miRNA水平 变化可用于疾病和治疗的监测。
在本发明另一实施方案中，所检测的miRNA来源于移植的细胞、 组织或器官，并且它们的水平指示出排斥发作和相应治疗。
在本发明另一实施方案中，所检测的miRNA来源于病原体，并 可用于感染诊断和监测。在本发明特定的实施方案中，病原体是病毒 如埃巴病毒。
在本发明又一个实施方案中，所检测的miRNA来源于受感染器 官的细胞，并可用于支持诊断、评价受感染组织的损伤以及进一步监 测疾病和治疗。
在本发明再一个实施方案中，所检测的miRNA来源于孕妇的胎 儿，并以胎儿的状况或病理学为特征，例如先兆子痫，其特征在于胎 盘营养细胞的过度死亡。在再一个实施方案中，所检测的miRNA来 源于孕妇的胎儿，并以胎儿的状况或病理学为特征，例如伴随着器官 发育延迟和细胞死亡过度或受抑制的唐氏综合症和其它三体综合症 (trisomies)。
在本发明再一个实施方案中，关于单独的或与其它标记物结合的 组织或细胞特异性miRNA的水平的信息用于诊断或监测癌症或癌前 病症，例如肝癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌和其它已知的 癌症。
在一些实施例中，利用血清中遍在的miRNA水平、尿中白蛋白 或肌酸酐水平或用于标准化其它组织特异性胎儿miRNA的胎盘特异 性miRNA水平来对细胞特异性和/或组织特异性miRNA的水平进行 标准化。
在本发明的一方面，分析所述尿样以检测特定miRNA的步骤包 括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚合酶链式反应、巢式聚 合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和连接酶链式反应。
在本发明的某些方面，所述尿样中的核酸降解作用减少。减少核 酸降解作用的方法包括利用RNA酶抑制剂抑制核酸酶活性，或者用 选自以下的化合物处理所述尿样：盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌 氨酸和十二烷基硫酸钠。在本发明另一方面，所述尿样在膀胱中储存 的时间少于12小时。
在本发明的一个实施方案中，所测量的miRNA序列特别涉及到 体内的组织，这些组织可选自但不限于：肺、心、肝、神经系统、大 脑、血液、肾、骨、眼或胰腺。
选作分析的组织可以是正常组织或异常组织(例如恶性组织)。恶 性组织和肿瘤通常包括：癌症、肉瘤、黑素瘤和白血病，更具体地说 选自与以下癌症相关的恶性组织和肿瘤：胆管癌、膀胱细胞癌、骨癌、 脑和CNS癌、乳癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、慢性骨髓性白血病、结肠 癌、结缔组织癌、皮肤T-细胞白血病、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、 滤泡性淋巴瘤、胃癌、毛细胞白血病、何杰金白血病、上皮内瘤、喉 癌、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)、黑素瘤、多 发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、 直肠癌、肾细胞癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌 和肾癌。该方法可用来区别良性和恶性肿瘤。
可从中收获所述组织样品的受试对象包括那些处于发展癌症的 风险中的受试对象。处于发展成癌症的风险中的受试对象是具有高度 发展成癌症可能性(即比一般人群中的可能性更高的可能性)的受试对 象。例如，这些受试对象包括：具有遗传异常(已证明其存在与发展为 癌症的可能性有关，这种可能性高于一般人群的可能性)的受试对象、 暴露于致癌因子(即致癌物)如烟草、石棉、或其它化学毒素的受试对 象、或者以前接受过癌症治疗并正处于明显的减退的受试对象。
本方法包括从患者体液中分离miRNA。在本发明的一个方面，可 在体液如血液、羊水、脑脊液、血浆、乳液、精液、血清、痰、唾液 和尿液中检测目标miRNA。在本发明的一个方面，在尿液中检测 miRNA。在另一个实施方案中，在血清中检测miRNA。
分离本发明miRNA的本发明方法可利用市售的阴离子交换材料。 不论强的还是弱的阴离子交换剂都可使用。通过利用所选的吸附和洗 脱溶液，可将miRNA纯化、浓缩并基本上地分离。
可通过利用已知离子强度的溶液使miRNA与阴离子交换柱材料 初步结合，将包括其它带负电的分子如蛋白质(微弱结合的污染物)在 内的大多数水溶性组分经由交换柱洗去。对于洗脱，通过使用已知浓 度的盐如NaCl(其可与缓冲液混合以控制pH)来达到所需的离子强 度，理想的是，所述离子强度对应于核酸被完全洗脱的最低离子强度。 由此，以比核酸更高的严格性结合到阴离子交换树脂的污染物可留在 柱内，即，结合较强的污染物与核酸分离开。
优选的弱交换剂是其中伯、仲或叔胺基团(即可质子化的胺)提供 交换位点的那些交换剂。强碱阴离子交换剂具有季胺基团(即不可质子 化并且总是带正电荷的)作为交换位点。可根据其各自的吸附和洗脱离 子强度和/或用于分离miRNA的pH来选定这两种交换剂。溶液强度 高于结合强度。
在本发明的一个方面，提供了从尿液中分离跨肾miRNA的方法， 该方法包括提供来自受试对象的尿液；任选通过过滤或离心从尿液中 分离细胞和细胞碎片；向尿液中加入EDTA和Tris-HCl；向尿液中加 入无硅阴离子交换树脂；温育混合物；从尿液中除去阴离子交换介质； 并从树脂中洗脱miRNA。
在一个从尿液中分离miRNA的方法的实施方案中，EDTA和 Tris-HCl在加入尿液中之后的浓度在10-100mM范围之间，溶液的pH 在约8.0-约8.5之间。
在进一步的实施方案中，在吸附到阴离子交换介质之前，任选地 将体液通过膜进行预过滤。
在进一步的实施方案中，阴离子交换介质是用阳离子季铵基团功 能化的基于琼脂糖的树脂。用阳离子季铵基团功能化的基于琼脂糖的 树脂的实例包括Q-SepharoseTMANX-4SepharoseTMFastFlow、 DEAE-SepharoseTM和Q-Sepharose-XLTMDEAESepharoseFastFlow (GEHealthcare)。
在进一步的实施方案中，阴离子交换介质选自基于琼脂糖的季铵 阴离子交换介质如Q-过滤剂(Q-filter)或Q-树脂(Q-resin)。
在本发明进一步的实施方案中，将阴离子交换介质固定在单独的 载体上，其中该载体是可用于运输或储存介质/核蛋白结合复合体的柱 式、筒式或便携式过滤系统。
在本发明另一个实施方案中，例如，定期对存在于同一人的尿液 样中的miRNA序列进行分析，可提供关于特定器官或组织中病理过 程的早期信息。例如，miRNA122仅在肝脏中合成，并且其数量的增 加可为肝炎或其它肝脏病理标志。阿尔茨海默综合症可伴随着神经元 中特异性表达的miRNA浓度的增加。
在另一个实施方案中，对患者样品体液中组织特异性miRNA的 更详细的监测可用于评价疾病的严重性和治疗的有效性。
在又一个实施方案中，关于组织特异性miRNA的数据联合肿瘤 特异突变的分析有助于确定肿瘤位置。
本发明其它方面涉及由一种或多种特定miRNA表达的变化所引 起或伴随的疾病。所述技术将有助于诊断这种类型的病状。
在又一个实施方案中，本方法的应用可延伸至监测患者尿液中合 成的siRNA的药物代谢动力学，从而加强siRNA药物设计的最优化。
除非另有说明，否者本文所使用的所有科技术语具有如本发明所 属领域普通技术人员通常所理解的同等含义。尽管相似或等同于那些 本文所述的方法和材料可用于本发明的实践中，但合适的方法和材料 描述如下。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资 料清楚地通过整体引用结合到本文中。在有冲突的情况下，将以包括 定义在内的本说明书为准。另外，本文所描述的材料、方法和实施例 仅仅是说明性的，没有限制的意思。
实施例
实施例的提出是为了更充分地说明本发明的各种实施方案。这些 实施例决不应理解为限制所附权利要求书中所记载的本发明的范围。
实施例1
从尿液中提取miRNA
尿液的收集：为了进行这些实验，将来自患者或志愿者的尿样收 集到无菌110ml尿液收集杯中，并立即用EDTA补充至终浓度到10 -150mM之间，优选为50mM。样品于-80℃下以10-50ml等份试样 贮存。在收集样品之后、加入EDTA之前立即在StericupTM(Millipore， VacuumDrivenFiltrationSystem，0.45μDuraporeTM过滤器)上进行尿液 的选择性过滤。
Q结合：在50ml的试管中，用等体积50mMEDTA(pH8.0)和 50mMTris-HCl(pH8.0)稀释20mL的尿液，然后补充1-2mlQ- SepharoseTM(GEHealthcare；17-0510-10)浆液，于室温下剧烈搅拌混合 10-30min。使用浮桶式转头(swingbucketrotor)的台式临床离心机在 室温下以2000g离心5min收集结合了核酸的树脂。通过抽吸将接近 500μl的上清液除去。将树脂沉淀重悬于残存的上清液中并转移至 MicroBio-Spin色谱柱(Bio-Rad)或等效物中，其通过真空离心来操作。 用500μl2xSSC(300mMNaCL/30mM柠檬酸钠(pH7.0))或具有相近 离子强度的缓冲液(例如300mMNaCl或LiCl)洗涤柱中的树脂三次。 用高离子强度(例如1MNaCl或LiCl)将核酸从Q-Sepharose中洗脱下 来，但下面所描述的方法能更好地保存RNA。
Q-Sepharose TM 和TRIzol TM 相分离洗脱：用500μlTRIzolTM试剂 (Invitrogen)进一步洗脱结合的核酸。按照制造商的指示从TRIzol中萃 取核酸。简言之，为了进行相分离，用100μl氯仿补充TRIzol洗脱液， 剧烈混合，于室温下孵育3-5min并以12,000xg于4℃离心15min。 将300μl上层相转移至新的离心管中，同时避免碰触界面。然后将核 酸沉淀或者另外在硅胶柱上进行清洗并脱盐。
核酸沉淀：为了进行核酸沉淀，用1μl20mg/mL糖原(Roche)和 300μl100％异丙醇补充上述制备物。离心收集核酸，用200μl70％乙 醇洗涤沉淀两个，室温下风干5min，然后将核酸溶解在30μl0.1mM EDTA/1xRNASecure(Ambion)。将样品于60℃下孵育10min以灭 活残存的RNA酶活性。
核酸的硅胶柱清洗：为了与硅胶柱(QiagenPCR清洗柱或等效物) 结合，将3倍体积96％的乙醇加入到来自Trlzol上层相的核酸制备物 中，室温下孵育3min之后，将混合物加样到在柱上。用500μl2M LiCl/80％乙醇洗涤柱子两次，并用500μl80％乙醇洗涤两次。用50μl 的0.1mMEDTA/1xRNASecure(Ambion)洗脱核酸。于60℃下温育 样品10min灭活任何残存的RNA酶。
DNA酶I和RNA酶A消化：为了检验用上述方案从尿液中提取材料的核酸身份，用DNA酶I和/或RNA酶A消化该制备物。在含有2个单位无RNA酶的DNA酶I(NEB)的DNA酶I反应缓冲液(NEB)中进行DNA酶I的消化。在补充了50ng/mL经煮沸RNA酶A的TE缓冲液中进行RNA酶A的消化。于37℃下孵育样品60min，在加入加样染料之后，将样品进行5％聚丙烯酰胺1xTBE凝胶电泳，并用1/10000稀释的Gold(Invitrogen)进行染色。如图1所示，经分离的材料代表低分子量的核酸、主要是RNA及其片段。另外(见图1)，为了进行比较，泳道2和3为用3MNaCl从Q-树脂洗脱的核酸，泳道4和5为用TrizolTM洗脱的核酸。
在图1中，泳道1和5分别代表用高盐和TriZol从Q-Sepharose洗 脱来分离的核酸；泳道2和6；3和7；4和8分别代表用DNA酶、 RNA酶或DNA酶+RNA酶处理后的核酸。
此外，为了证明RNA的存在和分子大小，用DNA酶I消化纯化 的核酸的RNA等份试样，即泳道3和5。
从血清中提取RNA
为了进行这些实验，将1.2mlTRIzolLS加到0.4ml血清中，以 14,000rpm离心混合物10min。将上清液转移至2mlEppendorf管中， 加入0.3ml氯仿，将混合物振荡15秒钟。14,000rpm离心15min之 后，将上清液转移至5ml管中并加入乙醇至最终浓度为70％。将混合 物加样到QuiagenQuick柱真空歧管上，用0.5ml的2MLiCl-80％ EtOH洗涤柱子两次，一次用0.5ml80％乙醇-80mM醋酸钠(pH5.0)， 最后用0.5ml95％乙醇。以14,000rpm在1.5mlEppendorf管中离心 柱子3min，并用40μlH2O洗脱RNA。
实施例2
该实施例证明了来自死亡细胞的miRNA跨越肾屏障，并可在患 者的尿液中检测到。
尿液中人类miRNA分子的检测
在本实施例中所分析的微小RNA种类可分成三组不同的类型， 即在所有或多种组织中表达的遍在miRNA、组织特异性miRNA和在 特定的组织或细胞类型中其表达有显著变化的miRNA。如表1所示， 从16名健康的志愿者和所登记供者的尿液中获得20种不同的 miRNA，之后用市售的miRNA表达分析试剂盒(ABI)通过实时 RT-PCR进行检测。用相应的合成miRNA寡核苷酸作为标准品。按照 供应商所推荐的严格地进行反应。
表1检测的miRNA
在大多数尿液RNA制备物中检测到所有三种类型的miRNA。最 高的拷贝数以遍在miRNA为特征。然而，组织特异性miRNA或在特 定组织或细胞类型中过量表达的miRNA也是可检测到的。已经清楚 地表明：来自死亡细胞的一部分miRNA不被降解，但出现在血液里， 并最终分泌到尿液中。
实施例3
该实施例证明了来自人类鼻咽癌(NPC)细胞的miRNA可跨越患 者的肾障碍，并可通过实时RT-PCR在患者的尿液中检测出来。
尿液中来源于病毒的miRNA
已知以一些病毒也编码和合成miRNA。由于埃巴病毒(EBV)涉及 鼻咽癌(NPC)的发展，该系统用于探求来自NPC细胞的病毒miRNA 是否可以达到患者的尿液中并从中检测出来。按照本申请的实施例1 所描述的方法收集并贮存来自NPC患者的尿样。通过检测尿液中病毒 特异性DNA序列来证实EBV的感染。从健康供者收集的尿液呈EBV 特异性DNA序列阴性。在此项研究中，分析了两种EBV特异性 miRNA，即BART3-3p和BART1-3p：
BART3-3PCGCACCACUAGUCACCAGGUGUSEQIDNO：21
BART1-3PUAGCACCGCUAUCCACUAUGUCUSEQIDNO：22
反转录在15μl体系中完成，取1/10的RT反应物，用来自Sigma 的JumpStartDNA聚合酶进行PCR扩增。下列引物的使用浓度为500 nM。
以15％聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)分析产物。
如图2中所示，BART3和BART1miRNA两者都在NPC患者的 尿液中检测出来，但在健康供者尿液中没有检测到。这些数据再次说 明可在尿液中检测到来自位于泌尿系统外的死亡细胞的miRNA。在图 2中，泳道1代表标记物；泳道2和3代表鼻咽癌患者；泳道4和5 代表对照患者；泳道6代表阳性对照，其代表相应的合成miRNA。
实施例4
该实施例证明可通过测量患者尿液中神经元特异性miRNA的浓 度指示体内由中风引起的神经元死亡。
脑中风诊断
为了进行这些实验，对脑中风患者进行了研究，以分析中风后脑 特异性miRNA或脑中过量表达的miRNA浓度的变化情况。由于目前 还不清楚什么类型的脑细胞以及在脑部什么区域表达这些miRNA，因 此对9种不同的脑特异性miRNA进行了研究。
患者：从在医院急诊室接收的患者中收集尿样。脑中风的诊断基 于临床症状。中风后12和24小时收集尿样。对照尿样由没有中风症 状的同龄志愿者提供。按照本申请实施例1所述的方法收集并贮存样 品。
miRNA种类：按照实施例1所述的方法提取尿液中的miRNA。 对与675μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取 1/10的RT-PCR混合物的进行最终实时PCR，这通过用制造商所提供 的方案来实施。通过按照尿液中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得 的数据进行针对个体肾过滤率(individualkidneyfiltrationrate)的标准 化。为了进行这些实验，将从同一年龄组的健康供者中收集的尿样用 作基线。不同的miRNA种类如下所示：
A.hsa-mir-128a
B.hsa-mir-9
C.hsa-mir-127
D.hsa-mir-137
E.hsa-mir-129
F.hsa-mir-219
G.hsa-mir-218
图3A-3G总结的结果清楚地表明：在脑中风之后，几种脑特异性 miRNA(128a，129，218，219)水平的显著增加，这反映了脑细胞死亡的 动力学。
实施例5
该实施例证明：中风后患者尿液中miRNA浓度的动力学提供了 有关疾病结果的信息。
脑中风监测
为了进行实验，对脑中风患者进行了研究，以分析脑特异性 miRNA浓度变化与疾病发展之间相关性。
患者：从在医院急诊室接收的患者中收集尿样。脑中风的诊断基 于临床症状和MRI分析。在中风后12、24、48小时和一周收集尿样。 中风后30天对患者临床状态进行评价。由无中风症状的同龄志愿者 提供对照尿样。根据本申请实施例1所述的方法收集和贮存样品。
miRNA种类：根据实施例1所述的方法从尿液中提取miRNA， 并用TaqManmiRNA测定(AppliedBiosystems)对其进行分析。对与 400μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取1/10的 RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过用制造商所提供的方案来 实施。通过按照尿液中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的数据进行 针对个体肾过滤率的标准化。
图4A和B总结的结果清楚地表明：在脑中风之后，Tr-miRNA129 和Tr-miRNA219的变化动力学在不同的患者中有差异，并且与疾病 的发展相关。第3名患者中风后一周神经元死亡的增加对应于患者临 床状况的恶化。与此同时，研究证明，跨肾神经元特异性miRNA趋 于正常化的两名患者有显著改善。
实施例6
阿尔茨海默病诊断
阿尔茨海默病是由神经元(特别是在大脑皮质和海马组织)死亡引 起的渐进性神经系统疾病。诊断基于神经检查并排除其它痴呆因素， 而仅在尸检时才可作出确定的诊断。本发明证明了以过度神经元死亡 为表征的阿尔茨海默病可通过测量从患者尿液中分离到的脑特异性 miRNA水平来监测。
为了进行这些实验，对诊断为阿尔茨海默病的患者进行了研究， 以分析因神经元死亡引起的脑特异性miRNA或过量表达的miRNA浓 度的变化。
患者：从诊断为不同时期阿尔茨海默病的患者收集尿样和血清样 品。由没有阿尔茨海默病症状的同龄志愿者提供对照尿样和血清样 品。根据本申请实施例1所述的方法收集和贮存样品。在按照实施例 1所述进行收集之后，过滤某些尿样以除去细胞和细胞碎片。
miRNA种类：根据实施例1所述的方法从尿液和血清中提取 RNA。
在一组实验中，对与750μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进 行反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，者通 过用制造商(AppliedBiosystems)所提供的方案来实施。通过按照尿液 中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的数据进行针对个体肾过滤率 的标准化。图5清楚地表明：在阿尔茨海默病患者的尿液中几种脑特 异性miRNA的浓度增加。
在另一组实验中，分析了从过滤的尿液或血清中分离的RNA。对 与0.6ml尿液或50μl血清中所分离的RNA等量的RNA进行反转录 PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过用制造商 (AppliedBiosystems)所提供的方案来实施。通过按照尿液中的肌酸酐 浓度重新计算来对所获得的关于尿液miRNA的数据进行针对个体肾 过滤率的标准化。按照遍在miRNA-16对所获的关于血浆miRNA的 数据进行标准化。图6和图7显示：在阿尔茨海默病患者的过滤的尿 液和血清中某些神经元特异性miRNA的水平都比同龄对照高。
实施例7
帕金森病
帕金森病是一种通常损害患者运动技巧和语言能力的中枢神经 系统退行性疾病。本发明证明：特征在于多巴胺能神经元的过度细胞 死亡的帕金森病可以通过测量分离自患者尿液中的脑特异性miRNA 的水平来监测。
为了进行这些实验，对诊断为帕金森病的患者进行研究，以分析 由神经元死亡引起的脑特异性miRNA或过量表达的miRNA的浓度变 化。
患者：从诊断为各个时期帕金森病的患者中收集尿样。由没有帕 金森病症状的同龄志愿者提供对照尿样。根据本申请实施例1所述的 方法收集和贮存样品。
miRNA种类：为了进行这些实验，根据实施例1所述的方法从尿 液中提取RNA。对与750μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行 反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过 用制造商(AppliedBiosystems)所提供的方案来实施。通过按照尿液中 的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的数据进行针对个体肾过滤率的 标准化。图8证明：帕金森病患者的尿液中几种脑特异性miRNA的 浓度增加。
实施例8
怀孕相关疾病或胎儿疾病的产前试验
肾屏障对miRNA分子渗透性的重要发现开辟了利用母体尿液进 行对先天性疾病的完全非介入性产前诊断的先河。这种非介入性筛查 可如下进行：
首先，从怀孕患者中收集尿样。然后根据需要，用上述方法分离、 纯化和/或处理尿样中的miRNA以防降解。然后用定量PCR或miRNA 阵列进行miRNA概况分析(profiling)，根据关于以上其它病状所述， 所得的数据用来确定不同的胎儿病状。
实施例9
唐氏综合症
为了进行实验，研究了怀有正常胎儿和唐氏综合症胎儿的妇女的 母体尿液中脑特异性miRNA浓度的差异。
患者：从通过羊膜腔穿刺术诊断为唐氏综合症的孕妇中收集尿 样。同龄的正常孕妇提供对照尿样。根据本申请实施例1所述的方法 收集和贮存样品。
miRNA种类：根据实施例1所述的方法从尿液中提取miRNA。 对与750μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取 1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过用制造商(Applied Biosystems)所提供的方案来实施。按照胎盘特异性miRNA518对所得 数据进行标准化。图9表明，与正常孕妇尿液相比，怀有唐氏综合症 胎儿的孕妇尿液中脑特异性miRNA9的浓度较低，这表明与相应的对 照相比细胞死亡不足。