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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610032734.7 (22)申请日 2016.01.19 C12N 15/71(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 张震宇 黄建华 王晓姣 姚动邦 魏照辉 (54) 发明名称 一种在生物合成法生产顺式 -3- 羟基 -L- 脯 氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法 (57) 摘要 公开了一种在生物合成法生产顺式 -3- 羟 基 -L- 脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化 率的方法。其中， 生物合成法生产顺式 -3- 羟 基 -L- 脯氨酸的系统。
2、是指， 在生物细胞内利用脯 氨酸 -4- 羟化酶在 - 酮戊二酸及亚铁离子存在 的情况下， 将游离的 L- 脯氨酸转化为顺式 -3- 羟 基 -L- 脯氨酸的生产方法。提高脯氨酸转化率的 方法为 ： 打断生物细胞内脯氨酸的降解途径。通 过使用这种方法， 顺式-3-羟基-L-脯氨酸的转化 率达到了 100。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 105543265 A 2016.05.04 CN 105543265 A 1.一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的 方法，。
3、 其特征在于， 在利用生物细胞生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的过程中， 通过打断生物细 胞内的脯氨酸降解途径来提高脯氨酸的有效转化率及顺式-3-羟基-L-脯氨酸的产量。 2.如权利要求1所述， 利用生物细胞生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的过程是指， 生物细胞 利用外源添加或者自身积累的脯氨酸， 在脯氨酸-3-羟化酶及 -酮戊二酸和亚铁离子存在 的情况下， 将游离的L-脯氨酸转化为顺式-3-羟基-L-脯氨酸。 3.如权利要求1所述， 打断生物细胞内的脯氨酸降解途径的方法： 包括生物细胞内与脯 氨酸降解途径的相关酶不能被表达或者不能行使功能的方法， 如基因敲除、 RNA干扰等。 4.如权利要求1和。
4、2所述， 生物细胞包括任何能够表达脯氨酸-3-羟化酶， 自主产生 -酮 戊二酸， 将脯氨酸转化为顺式-3-羟基-L-脯氨酸的有机体， 如大肠杆菌、 酵母、 动植物细胞 等。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543265 A 2 一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效 提高脯氨酸转化率的方法 技术领域 0001 一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率 的方法， 属于微生物基因工程领域。 背景技术 0002 羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)为亚氨基酸， 是脯氨酸羟基化后的产物， 根据其 羟基化位置的不同， 可分为3-羟。
5、脯氨酸(3-Hyp)或4-羟脯氨酸(4-Hyp)。 自然界中反式-4-羟 脯氨酸较为常见， 顺式-3-羟基-L-脯氨酸是动物组织蛋白如胶原等的重要组成部分。 顺式- 3-羟基-L-脯氨酸广泛应用于医药、 营养和美容业等方面。 0003 目前， 国内外生产羟脯氨酸的方法主要有3种： 水解法， 化学合成法以及生物合成 法。 水解法主要用于提取动物骨胶原中的反式-4-羟脯氨酸16， 由于顺式-3-羟脯氨酸在 骨胶原中含量极少， 因而无法通过常见的水解法获得。 已有的研究报道中， 获取顺式-3-羟 脯氨酸的方法主要是化学合成法和微生物转化法。 0004 生物合成法能将游离的脯氨酸通过脯氨酸-3-羟化酶。
6、的催化， 转化为顺式-3-羟 基-L-脯氨酸， 但在生物细胞中， 游离的脯氨酸也是一种可以被利用的碳源， 所以有必要打 断生物细胞的脯氨酸降解途径， 以阻止菌体降解脯氨酸。 0005 本发明所提供的使含有重组DNA的顺式-3-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方 法， 具有重要的工业应用价值。 发明内容 0006 针对生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸时， 需降解脯氨酸会限制顺式-3-羟 脯氨酸合成等缺点， 本发明的目的是提供一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的 系统中能够有效提高脯氨酸转化率的方法。 0007 本发明是一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的系统中有效提。
7、高脯氨 酸转化率的方法。 其特征是： 在利用生物细胞生产顺式-3-羟基-L-脯氨酸的过程中， 通过打 断生物细胞内的脯氨酸降解途径来提高脯氨酸的有效转化率及顺式-3-羟基-L-脯氨酸的 产量。 0008 本发明所述重组细胞的构建方法： 0009 1.含有脯氨酸-3-羟化酶基因的载体的构建 0010 根据大肠杆菌密码子的偏好性， 利用密码子的简并性在不改变氨基酸序列的基础 上， 消除低使用率的密码子， 优化脯氨酸-3-羟化酶基因， 使得其更有利于在大肠杆菌中得 到表达。 同时， 选用色氨酸串联启动子作为其启动子， 对其进行优化， 使得羟化酶基因得到 更为高效的表达。 0011 2.通过敲除基因p。
8、utA打断细胞内的脯氨酸降解途径 0012 putA(EC:1 .5.99.81 .5.1 .12)基因编码的蛋白PutA同时具有脯氨酸脱氢酶 说明书 1/6 页 3 CN 105543265 A 3 (PRODH)和-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(P5C)两个催化区域， 从而将脯氨酸氧化为谷氨酸。 首 先， 通过PRODH的作用， 脯氨酸被氧化为吡咯啉-5-羧酸(P5C)同时耦合着辅酶Q的还原， 之 后， P5C与水自发反应生成谷氨酸-半醛， 再在-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶的催化作用下， 转变为谷氨酸。 同时PutA蛋白也是一种多功能的DNA结合转录因子， 在脯氨酸供应不足的情 况下会作为转录阻遏子。
9、从而阻遏基因putA和putP(表达的PutP是主要的脯氨酸转运体)的 表达。 0013 敲除putA基因， 可以有效的打断细胞内由L-脯氨酸降解为谷氨酸的过程， 从而积 累更多的L-脯氨酸， 有利于羟脯氨酸的产生。 0014 3.重组大肠杆菌的发酵实验 0015 35、 220rpm培养24h， 包括BL21(DE3)putA(pET21a-ptrp2-H3p)， 取发酵液测定 顺式-3-羟脯氨酸的含量。 附图说明 0016 图1.顺式-3-羟脯氨酸在大肠杆菌细胞中的生物转化途径。 0017 图2.色氨酸启动子质粒图谱。 0018 图3.表达质粒pET21a-ptrp2-H3p图谱。 具体实。
10、施方式 0019 LB培养基:1(W/V)胰蛋白胨， 0.5(W/V)酵母抽提物， 1(W/V)NaCl， pH7.0- 7.2。 0020 Amp(Kan)抗性平板： 1(W/V)胰蛋白胨， 0.5(W/V)酵母抽提物， 1(W/V)NaCl， 1.5(W/V)琼脂糖， 氨苄青霉素(卡那霉素)50 g/mL。 0021 5KCM(大肠杆菌转化缓冲液):0.5MKCl， 0.15MCaCl2， 0.25MMgCl2。 0022 顺式-3-羟脯氨酸的定量测定： 将发酵液离心后， 取上清， 稀释到2.5mL后加于10mL 试管中， 之后加入0.2mLCuSO45H2O(CuSO45H2O浓度： 0。
11、.05M)， 然后依次加入0.5mLNaOH (NaOH浓度： 2.5M)、 0.5mLH2O2(0.5)、 0.8mLH2SO4(H2SO4浓度： 4M)、 2mL显色剂(显色剂： 称取5g对二甲氨基苯甲醛， 用45mL去离子水， 缓慢加入55mL正丙醇)摇匀后迅速将试管移至 70水浴锅中， 保温3min， 再用冷水冷却， 最后用紫外分光光度计在560nm波长处测定吸光 值。 0023 实施例1： 色氨酸串联启动子序列的设计 0024 色氨酸串联启动子来源于ptrpL1质粒， 质粒图谱如说明书附图2， 该质粒的色氨酸 启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子， 是一个适合工业生产应用的强。
12、启动子， 在 SD序列跟起始密码子序列之间有ClaI酶切位点， 同时， 色氨酸启动子的-35区上游有Hind 酶切位点， 这样便于将启动子连接到其他的表达载体上。 由于两个色氨酸启动子串联起 来可提高表达强度， 因此， 根据ptrpL1质粒的色氨酸启动子序列， 全基因合成色氨酸串联启 动子。 0025 通过优化色氨酸串联启动子， 将Hind酶切位点AAGCTT修改为EcoRI酶切位点 GAATTC， 同时， 为了使串联启动子内部的酶切位点单一， 因此将两个色氨酸启动子的结合部 位的ClaI酶切位点ATCGAT修改为ATGTCGAC， 使得连接处变为SalI酶切位点， 同时， 在第二 说明书 2。
13、/6 页 4 CN 105543265 A 4 个色氨酸启动子序列的ClaI酶切位点后面加入一个Hind酶切位点AAGCTT， 这样可利用 酶切等分子操作来优化SD序列与起始密码子之间的距离， 使得目的基因得到高效表达。 0026 本实施方式中色氨酸启动子基因序列的原始序列， 见SEQIDNO:1。 本实施方式中 优化的色氨酸串联启动子序列为人工合成； 优化的色氨酸串联启动子序列见SEQIDNO:2。 0027 实施例2： 脯氨酸-3-羟化酶基因序列的设计 0028 根据大肠杆菌的密码子使用频率来优化基因密码子， 消除低使用率的密码子， 同 时利用同义转化方法消除EcoRI酶切位点， 将原始序。
14、列中的终止子修改为TAAT强终止子， 为了便于将脯氨酸-3-羟化酶基因连接到其他质粒载体上， 因此在终止子后面插入一个酶 切位点BamHI(GGATCC)。 0029 还要考虑到mRNA的二级结构， 首先要保证ATG起始密码子及其后的几个碱基组成 的密码子翻译口袋呈打开状态， 降低核糖体结合到mRNA上的能势， 使得核糖体能够顺利地 沿着起始密码子向后翻译。 0030 本实施方式中优化的脯氨酸3-羟化酶基因序列为人工合成； 优化的脯氨酸3-羟化 酶序列见SEQIDNO:3。 0031 实施例3:脯氨酸3-羟化酶基因表达载体的构建 0032 先分别合成设计好的色氨酸串联启动子与脯氨酸3-羟化酶基。
15、因， 由于色氨酸串联 启动子基因序列5 端序列带有EcoRI(GAATTC)酶切位点， 3 端有Hind(AAGCTT)酶切位 点， 而脯氨酸3-羟化酶基因5 端序列带有Hind(AAGCTT)酶切位点， 而3 端有BamH (GGATCC)酶切位点。 0033 将色氨酸串联启动子基因序列用限制性内切酶EcoRI和Hind双酶切， 将脯氨 酸3-羟化酶基因用Hind和BamHI双酶切， 同时， 将质粒载体pET21a也分别用EcoRI和 BamHI消化处理。 将双切酶后的色氨酸串联启动子基因序列、 脯氨酸3-羟化酶基因以及 pET21a质粒载体用琼脂糖凝胶试剂盒回收， 然后用T4DNA连接酶将。
16、三个基因片段连接起 来， 将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。 0034 转化过程为： 将6 L连接液加入至50 L的BL21(DE3)感受态细胞中， 然后再加入10 L的5KCM缓冲液， 混匀后， 在冰上放置30min后， 42热激90s， 然后在冰上放置5min后， 加 入500 L的SOC培养基， 37， 200rpm培养60min后， 涂布至Amp抗性平板上， 培养12h后。 0035 然后提取质粒进行验证， 进一步测序验证基因序列是否正确。 从而得到了构建好 的pET21a-ptrp2-H3p重组质粒， 质粒图谱如说明书附图3， 同时获得重组大肠杆菌BL21 (DE。
17、3)pET21a-ptrp2-H3p。 0036 实施例4： putA基因敲除 0037 由 N C B I 获 得 p u t A 的 基 因 序 列 ， 采 用 短 同 源 臂 ， 设 计 引 物 对 P 1 (TTAACCTATAGTCATTAAGCTGGCGTTACCGCCAGCGGCAGCGGTATTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)P2 (ATGGGAACCACCACCATGGGGGTTAAGCTGGACGACGCGACGCGTGAGCGCATATGAATATCCTCCTTAG)以 pKD4为模板， 获得含有putA上下游同源臂和抗性基因(Kan)的打靶片段。 通过化学。
18、转化法获 得含有质粒pKD46的大肠杆菌BL21(DE3)， 之后将其制备为电转感受态， 利用电转仪将打靶 片段导入到电转感受态中， 在质粒pKD46表达的三个蛋白的作用下， 利用Red重组系统完成 基因重组。 电转后， 30复苏3h， 涂布含有卡那霉素的平板。 之后转入质粒pCP20， 用于消除 抗性基因， 将菌株分别点种于无抗性、 Amp抗性平板、 Kan抗性平板， 选择只在无抗性平板上 说明书 3/6 页 5 CN 105543265 A 5 生长的单菌落。 利用引物对Y1( CGAGCTCGAGAATAGCCATCTAAAGTCTCCA )和Y2 (CCGCATATGTGGGCTTCC。
19、ACTCAACATTAC)， 菌落PCR验证基因是否敲除， 从而获得敲除基因putA 缺失型的菌株BL21(DE3)putA。 0038 实施例5： 重组菌株的发酵实验 0039 摇瓶培养： 挑取重组大肠杆菌单菌落， 接种到LB液体培养基(含氨苄青霉素50 g/ mL)中， 37、 220rpm培养8h后， 按8(V/V)接种量接入含有30mL发酵培养基(1(W/V)葡萄 糖， 0.5(W/V)甘油， 0.8(W/V)胰蛋白胨， 0.5(W/V)硫酸铵， 0.1(W/V)磷酸氢二钾， 0.2(W/V)氯化钠， 3mM硫酸亚铁， 0.2g/L硫酸镁， 0.015g/L氯化钙， 30mML-脯氨酸。
20、， pH7.5) 的250mL摇瓶中， 在旋转式摇床中30、 220rpm培养24h。 取发酵液检测顺式-3-羟脯氨酸浓 度。 顺式-3-羟脯氨酸的测定方法详见实施方式一般性说明。 发酵结果显示， 重组大肠杆菌 BL21(DE3)putA/pET21a-ptrp2-H3p的顺式-3-羟脯氨酸产量达到0.36mM， 脯氨酸转化率 约为百分之百。 0040 说明书 4/6 页 6 CN 105543265 A 6 0041 说明书 5/6 页 7 CN 105543265 A 7 说明书 6/6 页 8 CN 105543265 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 9 CN 105543265 A 9 。