技术领域
本发明属于微生物领域，涉及新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株及其益生功能，尤其是用于清除自由基和延缓衰老 的功能。
背景技术
肠道菌群作为虚拟“器官”，影响着人体的发育生长、营养与健康， 甚至其与代谢性疾病(肠易激综合症，炎症性肠病，心血管疾病，糖 尿病，肥胖等)密切相关，肠道菌群与人体健康乃至长寿的关联性。
湖南省浏阳市高田村地理位置相对封闭，其村民不仅长寿，而且 普遍没有慢性疾病。与此形成鲜明对比的是，周边地区既无长寿现象， 而且心血管疾病，慢性肠胃炎和癌症等疾病时有发生。
乳酸菌可调节机体胃肠道菌群平衡，提高机体免疫力降低血清胆 固醇，降血压，抗氧化抑制肿瘤发生等方面的特殊生理活性。长双歧 杆菌BBMN68分离自广西巴马长寿老人粪便，其活菌液对便秘模型 小鼠有润肠通便作用，提高免疫力。唾液乳杆菌FDB86可以缓解二 甲肼对肠道菌群的不良影响，使肠道菌群趋近于正常状态，对结肠癌 大鼠肠道菌群变化的调节作用。另外生物氧化是机体新陈代谢的重要 生理过程，但此过程中会产生多种自由基，自由基的累积，会照成体 内氧化损伤逐渐增多，导致老年慢性病发生，而清除过多的自由基可 以延缓衰老。
目前为止，没有报道来源于长寿老人肠道的植物乳杆菌物种的菌 株，具有对自由基的清除作用及延缓衰老的功能。
发明内容
现在，本发明人鉴定了一种新的植物乳杆菌ZDY03菌株，是一 类厌氧，不产孢子的革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，在MRS琼脂平 板培养基中呈乳白色，圆形，光滑的菌落。植物乳杆菌ZDY03可以 在MRS肉汤培养基上生长，是革兰氏阳性菌。
植物乳杆菌ZDY03对0.4％H2O2有较高的耐受能力，在8h后， ΔOD>0.9，具有极强的耐受性，清除自由基(DPPH、羟基自由基、 超氧阴离子等)的能力表现优秀。
ZDY03还可以提高衰老小鼠的血清和肝脏中抗氧化酶活性，降 低血清和肝脏中有害代谢产物(如：丙二醛)的含量，延缓小鼠的衰 老症状。
菌株对模拟胃液和模拟肠液有较好的耐受性。
本发明的植物乳杆菌ZDY03作为益生菌，不仅具有极强的清除 自由基能力，且有良好的耐胆盐性，能缓解D-半乳糖诱导小鼠的不 良症状，延长自然衰老小鼠寿命，促进宿主健康。是一株性能优良的 菌种。因此具有很高的研究价值和应用价值。
本发明植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株ZDY03，于2015 年9月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)， 编号：CCTCCNO:M2015589。
一种微生物菌剂，含有权利要求1所述植物乳杆菌菌株ZDY03。
包含所述的植物乳杆菌的乳制品、蔬菜制品及饮料制品。
一种组合物，包括所述的植物乳杆菌菌株，或通过所述的方法所 获得的微生物菌剂，或通过所述的方法获得的乳制品、蔬菜制品及饮 料制品。
所述的组合物是食品，保健品或护肤品。
本发明所述植物乳杆菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合 物成分，还可以用于食品和饲料的添加剂。
附图说明
图1植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶对DPPH的清除能 力
图2植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶对羟基自由基的清 除能力
图3植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶对超氧阴离子的清 除能力
图4植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶的总还原力评价
图5植物乳杆菌ZDY03对模拟胃液的耐受性
图6植物乳杆菌ZDY03对模拟肠液的耐受性
图7植物乳杆菌ZDY03对肠上皮细胞HT-29的基因表达的影响
图8植物乳杆菌ZDY03对D-半乳糖小鼠血清中抗氧化酶和丙二醛 (MDA)的影响
图9植物乳杆菌ZDY03对D-半乳糖小鼠肝脏中抗氧化酶和丙二醛 (MDA)的影响
图10植物乳杆菌ZDY03对D-半乳糖小鼠小肠基因表达的影响
图11植物乳杆菌ZDY03对衰老小鼠寿命的影响
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施例仅用于说明本发 明，而本发明的应用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。
实施例1：植物乳杆菌ZDY03的分离与鉴定
植物乳杆菌ZDY03是从健康长寿老人的粪便(取样地：湖南省 浏阳市高田村)中分离。取1g粪便溶于10mL10％蛋白胨溶液中， 充分溶解，滤纸滤去残渣，滤液用5000rmp离心10min，弃去上清， 收集沉淀，用1mL10％蛋白胨水重悬。按1％接种到MRS液体培养 基中，过夜培养。培养液采用10倍梯度稀释，梯度稀释为10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9，每个梯度取1mL分别均匀 涂布于MRS肉汤的琼脂平板上，37℃厌氧培养48h。挑取单菌落， 在平板上划线分离，反复进行纯化培养，用革兰氏染色法观察菌落形 态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后，平板培养，用 接种环挑取单一的菌落作为模板，进行菌落PCR。将阳性PCR产物 送至公司测序。
将所分离菌菌株的16SrRNA碱基序列分析测序碱基序列进行 比对分析，发现与数据库里的植物乳杆菌序列一致(该碱基序列见序 列表)，并保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2015589。
本发明植物乳杆菌ZDY03菌株，是一类厌氧，不产孢子的革兰 氏阳性菌，菌体呈短杆状，在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色，圆 形，光滑的菌落。植物乳杆菌ZDY03可以在MRS肉汤培养基上生 长，是革兰氏阳性菌。
实施例2：菌株对氧胁迫的耐受性
将新鲜培养的菌株以1％的比例接种到含0.4mmol/LH2O2的 MRS液体培养基中，37℃厌氧培养8h，分别测定0h与8h的OD630， 检测菌株对H2O2的耐受性。
结果表明：ΔOD>0.9，具有极强的耐受性。
实施例3：菌株和发酵上清液清除DPPH自由基能力
按照接种量为1％接入MRS培养基中，厌氧37℃培养18h，6000 r/min离心10min，分别收集发酵上清液和菌体。菌体用PBS(pH7.2) 溶液洗涤2次，再用PBS溶液重悬至乳酸菌数为109cfu/mL。发酵上 清和重悬的菌体作为清除自由基试验的样品。
2mL样品中加入2mLDPPH无水乙醇溶液(0.2mmol/L)混合 均匀，室温避光反应30min，6000r/min离心10min，取上清液于517 nm处测定吸光度值Ai；空白组以等体积无水乙醇代替DPPH无水乙 醇溶液Ao，对照组以等体积空白溶剂代替样品溶液Aj，并以等体积 蒸馏水和乙醇混合液空白调零。清除率(％)＝100-(Ai-Ao)/Aj×100
实验结果：
如图1所示植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液，菌株和酸奶对 DPPH自由基的清除率均达到60％，其中酸奶对DPPH自由基的清除 能力的最强。
实施例4：菌株和发酵上清液清除羟基自由基的能力
0.5mL的邻二氮菲(6mmol/L)，0.5mL的FeSO4溶液(6mmol/L) 与1.0mL的PBS溶液(pH7.2)混匀。再向此体系中加入0.5mL样 品和0.5mL0.1％过氧化氢，用双蒸水将总体积定容至4.0mL。混匀 后在37℃下孵育1h，于536nm下读取吸光度。羟自由基的清除率 按下式计算：清除率(％)＝[(As-Ao)/(A-Ao)]×100
As：样品的吸光度值；Ao：用H2O替代样品；A：用H2O替代 H2O2和样品
实验结果：
见图2，结果表明，植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液，菌株和酸 奶对羟基自由基的清除率中，发酵上清最高，其次为酸奶。
实施例5：菌株和发酵上清液清除超氧阴离子的能力
A11组：2mLTris-HCl缓冲液(150mMpH8.0)中加入1mL邻 苯三酚溶液，再加入0.5mL样品；A10组：用1mL蒸馏水取代邻 苯三酚溶液；A01组：用0.5mL蒸馏水取代样品；A00组：用1.5mL 蒸馏水取代1mL邻苯三酚和0.5mL样品；混匀，室温反应30min 后于325nm处测定吸光值；记录数据并计算清除率：
清除率(％)＝[1-(A11-A10)/(A01-A00)]×100
实验结果：
如图3所示，植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液对超氧阴离子自由 基的清除率超过90％，清除能力最强。
实施例5：菌株和发酵上清液总还原力测定
0.5mL0.2MPBS溶液(pH6.6)中加入0.5mL0.1％的铁氰化钾 溶液和0.5mL样品；充分混匀，50℃保温20min；加入等体积的10％ 三氯乙酸，3000g离心10min；取1mL上清，加入0.175mL0.1％ FeCl3溶液，混合均匀，反应10min；700nm处测定吸光值。
实验结果：
如图4所示，植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液的OD700达到1.3， 总还原能力最强，菌株和酸奶的总还原力能力相对较弱。
实施例6：菌株对模拟胃液的耐受性评价
模拟胃液：将磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH2.2)中添加胃蛋白 酶使终浓度为3mg/mL，现用现配。将对H2O2耐受性高的菌株，5000 rmp离心10min，菌体洗涤两次，菌体洗涤两次后重悬于模拟胃液中， 保持菌浓度相同，37℃厌氧孵育30min。在0min和30min分别用 MRS固体培养基活菌计数。
实验结果：
如图5所示，植物乳杆菌ZDY03在模拟胃液中30min，数量级 降低一个水平，仍能对模拟胃液保持较高的耐受性。
实施例7：菌株对模拟肠液的耐受性的评价
模拟肠液：将PBS缓冲液pH调节为8.0，并添加0.45％胆盐， 终浓度为1mg/mL的胰蛋白酶，现用现配。将耐H2O2的菌株，5000 rmp离心10min，菌体洗涤两次后重悬于模拟肠液中，保持菌浓度相 同，37℃共孵育2h。0h和2h分别用MRS固体培养基活菌计数。 实验结果：
如图6所示，植物乳杆菌ZDY03在模拟肠液中2小时后，没有 数量级的变化，能极好的耐受模拟肠液。
实施例8：菌株对肠上皮细胞的抗氧化基因的作用
将细胞培养瓶中培养好的HT-29细胞分别与植物乳杆菌ZDY03 共孵育2h，提细胞的RNA，反转录后，用q-PCR检测基因的表达情 况。
实验结果：
如图7所示，与植物乳杆菌ZDY03共孵育后，HT-29细胞中与 抗氧化及细胞分化的相关基因均上调，表明，植物乳杆菌ZDY03对 基体具有一定的抗氧化作用。
实施例9：菌株对D-半乳糖诱导小鼠的作用
5周大的BALB/c小鼠，饲养一周后，其中20只用50mg/kg的 D-半乳糖腹腔注射30天，30天后，以10只为一组，实验组(ZDY308)： 灌胃植物乳杆菌ZDY03共28d，并同时腹腔注射D-半乳糖；对照组 (D-gal)：灌胃与菌株重悬液相同体积的PBS缓冲液。10只为空白 组(NC)：腹腔注射与D-半乳糖同等剂量的生理盐水，30天后灌胃 与菌株重悬液同体积的PBS缓冲液，同时持续腹腔注射，共28天。 灌胃结束的第二天，眼眶采血后，劲椎脱臼法处死小鼠，分别取肝脏 和小肠，用于后续实验。
实验结果：
如图8和9所示，血清和肝脏中抗氧化酶SOD和GSH-PX的含 量均增加，丙二醛减少，说明，植物乳杆菌ZDY03能缓解D-半乳糖 对小鼠的氧化损伤。
如图10所示，植物乳杆菌ZDY03提高了小鼠肠上皮细胞抗氧化 基因的表达量，进一步从分子机制证明了植物乳杆菌ZDY03对小鼠 氧化损伤的缓解作用。
实施例10：菌株对自然衰老小鼠衰老的延缓作用
8周大的BALB/c小鼠，随机分两组，每组10只，实验组(ZDY03)： 灌胃植物乳杆菌ZDY03至小鼠衰老自然死亡；对照组：灌胃同等体 积的生理盐水至小鼠自然死亡。分别统计两组小鼠的生长寿命，并做 比较分析。
实验结果：
如图11所示，持续灌胃植物乳杆菌ZDY03的小鼠的寿命较对照 组延长了125天，可见，该菌株对自然衰老也有延缓的效果。