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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510997214.5 (22)申请日 2015.12.25 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 四川农业大学 地址 611130 四川省成都市温江区惠民路 211 号 (72)发明人 王印 彭善珍 杨泽晓 姚学萍 邬旭龙 张鹏飞 冷伊依 肖璐 任梅渗 曾相杰 罗忠永 胡凌 林星宇 张博 刘亚东 蒙正群 李桂黎 王波 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 裴娜 (54) 发明名称 基于 TEM-PCR 和基因芯片检测猪病毒性疾病 的方法 。
2、(57) 摘要 本发明公开了一种基于 TEM-PCR 和基因芯片 检测猪病毒性疾病的方法， 依据靶序列富集多重 PCR， 采用 4 对特异性的套式 PCR 引物和探针， 并 在各内引物的 5 端分别加上能被一对通用引物 识别的标签序列。本发明克服了传统 PCR 方法的 诸多缺点， 其兼容性、 特异性、 灵活性等都比传统 PCR 方法好得多 ； 且本发明对 Tem-PCR 的反应条 件作了优化， 建立了准确高效， 方便快捷的检测方 法 ； 降低了反应的背景噪音， 大大的节省了经费 ； 首次结合了先进的 Tem-PCR 多重扩增技术和基因 芯片检测技术， 建立了在一张芯片上可同时检测 4 种病原的。
3、体系， 为以后的重要病原微生物的分 子生物学检测奠定了基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 105543410 A 2016.05.04 CN 105543410 A 1.一种基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在于， 所述基于TEM- PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法依据靶序列富集多重PCR， 采用4对特异性的套式 PCR引物和探针， 并在各内引物的5 端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列， Primer Mix的浓度为0.2 M， 反应的退火温度为50。 2.。
4、如权利要求1所述的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在 于， 所述基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法包括： DNA微阵列制备： 通过原位合成法将寡核苷酸固定到基片上， 采用玻片为基因芯片的支 持物， 在聚合反应之前， 要使表面衍生出羟基或氨基； 从细胞培养物或组织病料中提取核酸， 通过TEM-PCR方法进行扩增， 所有扩增产物用荧 光标记素对产物进行标记， 将荧光素标记在下游引物的5 末端； 芯片的杂交； 杂交反应过后， 各阵列将带有不同浓度的荧光标记， 借助激光共聚焦显微扫描仪或CCD 成像设备， 根据探针标记所用的荧光素种类选择激发光波长进行扫描，。
5、 然后应用数据分析 软件自动获取基因芯片上的各种信息， 并对信息进行处理获得结果。 3.如权利要求2所述的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在 于， 所述PCR扩增根据ASFVP72序列、 FMDV-O型序列、 PRVgB序列以及SVDV序列， 通过DNAMAN 比较同源性， 选取保守序列。 4.如权利要求2所述的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在 于， 所述PCR扩增所用Fo和Ro为特异性外引物， Fi和Ri为特异性内引物， Fs和Rs为通用引物。 5.如权利要求2所述的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在 于，。
6、 所述PCR扩增中基因芯片探针在靶序列区段内， 设计FMDV-O型、 ASFV、 PRV、 SVDV的特异性 探针， 基因芯片探针序列及修饰方法： 每条探针的5 端均通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基， 使用一段随机序列作为 位置质控， 其5 端连接有一个氨基， 3 端连接一个Cy3荧光基团； 使用烟草花叶病毒的一段 基因作为杂交质控其5 端连接有一个Cy3荧光基团， 并使用它的互补序列作为杂交质控探 针其5 端同样通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。 6.如权利要求5所述的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在 于， 所述基因芯片探针的序列为： ASFV NH。
7、2-T16-CTTGCTATTCCCTCGGTATCCATTCCCTTCGGCG PRVNH2-T16-CGGTCCCTGGGCTCCTCCCTCGTGAGCAACATFMDV-O NH2-T16-CCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTT SVDVNH2-T16-GCAAGGCTCGCCAGGCTGGTGGTGGAAGTT PCNH2-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-Cy3 HCCy3-CGACTATAACCTTCGCTGCCGTCATTGGGTCAAPC-p NH2-T16-TTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCG。 7.如权利要求。
8、2所述的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在 于， 所述PCR扩增的反应体系： 反应体系50 L： 2PremixrTaq25 L， 2 MPrimerMix5 L， 10 MFs2 L， 10 MRs2 权利要求书 1/2 页 2 CN 105543410 A 2 L， RNase-freeddH2O12 L,DNA4 L。 8.如权利要求2所述的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 其特征在 于， 所述基因芯片的杂交； 将Tem-PCR产物8 l， 杂交质控(1 M)1 l， 2样品杂交液 8 l置于PCR仪中， 在95条件下变性5min， 取出置。
9、于冰上， 冰浴5min； 打开芯片杂交盒， 将杂交盒平放在桌面上， 在杂交盒底部凹槽内加入5001000 L超纯 水； 将芯片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间； 放上芯片盖片， 注意有凸台的一面朝向 芯片， 上端先接触芯片， 再缓缓盖下； 然后用移液器通过盖片加样孔注入17 L变性后的杂交液， 杂交液会凭借液体表面张力 在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜， 盖紧杂交盒盖， 安装上铝合金封条， 置42 杂交盒中避光杂交3h； 杂交后， 取出芯片放在42预热好的洗液I中， 42震荡清洗4min， 再用42预热好的 洗液II， 42震荡清洗4min， 最后用42预热好的清水清洗一次， 装于。
10、塑料玻片盒， 以 1000g/min速度离心干燥5min后进行扫拭芯片信息。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105543410 A 3 基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法 技术领域 0001 本发明属于猪瘟检测技术领域， 尤其涉及一种基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病 毒性疾病的方法。 背景技术 0002 非洲猪瘟病毒(ASFV)、 猪水疱病病毒(SVDV)、 口蹄疫病毒(FMDV)、 猪伪狂犬病毒 (PRV)是猪病的4种重要病原。 目前我国虽无非洲猪瘟发生的报道， 但是， 由于邻国俄罗斯多 次报道该病的发生和其可能带来的严重后果， 能提早建立一种检测方法对预防该病非常必。
11、 要， 且能为将来研究该病提供一定的实验基础。 猪水疱病和口蹄疫在临床表现上非常相似， 很难从临床症状将它们区别开来， 所以能建立一种快速、 准确检测和鉴别这两种病的方法 对将来的治疗和预后意义重大。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 旨在建立一种快速、 准确检测和鉴别猪水疱病和口蹄疫的方法。 0004 本发明是这样实现的， 一种基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 所 述基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法依据靶序列富集多重PCR， 采用4对特 异性的套式PCR引物和探针， 并在各内引物的5 端分别。
12、加上能被一对通用引物识别的标签 序列， PrimerMix的浓度为0.2 M， 反应的退火温度为50。 0005 进一步， 所述基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法包括： 0006 DNA微阵列制备： 通过原位合成法将寡核苷酸固定到基片上， 采用玻片为基因芯片 的支持物， 支持物， 在聚合反应之前， 要使表面衍生出羟基或氨基； 0007 从细胞培养物或组织病料中提取核酸， 通过PCR方法进行扩增， 所有扩增产物用荧 光标记素对产物进行标记， 将荧光素标记在下游引物的5 末端； 0008 芯片的杂交； 0009 杂交反应过后， 各阵列将带有不同浓度的荧光标记， 借助激光共聚焦显微扫。
13、描仪 或CCD成像设备， 根据探针标记所用的荧光素种类选择激发光波长进行扫描， 然后应用数据 分析软件自动获取基因芯片上的各种信息， 并对信息进行处理获得结果。 0010 进一步， 所述PCR扩增根据ASFVP72序列、 FMDV-O型序列、 PRVgB序列以及SVDV序 列， 通过DNAMAN比较同源性， 选取保守序列。 0011 进一步， 所述PCR扩增所用Fo和Ro为特异性外引物， Fi和Ri为特异性内引物， Fs和 Rs为通用引物。 0012 进一步， 所述PCR扩增中基因芯片探针在靶序列区段内， 设计FMDV-O型、 ASFV、 PRV、 SVDV的特异性探针， 基因芯片探针序列及修。
14、饰方法： 0013 每条探针的5 端均通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基， 使用一段随机序列 作为位置质控， 其5 端连接有一个氨基， 3 端连接一个Cy3荧光基团； 使用烟草花叶病毒的 说明书 1/8 页 4 CN 105543410 A 4 一段基因作为杂交质控其5 端连接有一个Cy3荧光基团， 并使用它的互补序列作为杂交质 控探针其5 端同样通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。 0014 进一步， 所述基因芯片探针的序列为： 0015 ASFVNH2-T16-CTTGCTATTCCCTCGGTATCCATTCCCTTCGGCG 0016 PRVNH2-T16-CGGTCCCTGG。
15、GCTCCTCCCTCGTGAGCAACAT 0017 FMDV-ONH2-T16-CCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTT 0018 SVDVNH2-T16-GCAAGGCTCGCCAGGCTGGTGGTGGAAGTT 0019 PCNH2-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-Cy3 0020 HCCy3-CGACTATAACCTTCGCTGCCGTCATTGGGTCAA 0021 PC-pNH2-T16-TTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCG。 0022 进一步， 所述PCR扩增的反应体系： 0023 反应体系50 L： 2Prem。
16、ixrTaq25 L， 2 MPrimerMix5 L， 10 MFs2 L， 10 M Rs2 L， RNase-freeddH2O12 L。 0024 进一步， 所述基因芯片的杂交 0025 将Tem-PCR产物8 l， 杂交质控(1 M)1 l， 2样品杂交液8 l置于PCR仪中， 在95 条件下变性5min， 取出置于冰上， 冰浴5min； 0026 打开芯片杂交盒， 将杂交盒平放在桌面上， 在杂交盒底部凹槽内加入约5001000 L超纯水； 将芯片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间； 放上芯片盖片， 注意有凸台的一 面朝向芯片， 上端先接触芯片， 再缓缓盖下； 0027 然后用移液器。
17、通过盖片加样孔注入17 L变性后的杂交液， 杂交液会凭借液体表面 张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜， 盖紧杂交盒盖。 安装上铝合金封条， 置42杂交盒中避光杂交3h； 0028 杂交后， 取出芯片放在42预热好的洗液I中， 42震荡清洗4min， 再用42预热 好的洗液II， 42震荡清洗4min， 最后用42预热好的清水清洗一次， 装于塑料玻片盒， 以 1000g/min速度离心干燥5min后进行扫拭芯片信息。 0029 本发明提供的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法， 与现有技术相 比， 具有以下优势： 0030 1、 本发明采用Tem-PCR(靶序列富集多重。
18、PCR,Target-EnrichedMultiplexPCR) 扩增技术来扩增靶序列， 克服了传统PCR方法的诸多缺点， 其兼容性、 特异性、 灵活性等都比 传统PCR方法好得多； 且本发明对Tem-PCR的反应条件作了优化， 建立了一套准确高效， 方便 快捷的检测方法， 临床样品可在短时间内完成检测， 为疾病的早期诊断和治疗提供了重要 的契机。 0031 2、 基于Tem-PCR， 用于基因芯片信号检测的荧光标记Cy3只需要加在通用超级引物 下游(Rs)就能实现所有待检靶序列都被加上荧光标记， 降低了反应的背景噪音， 且大大的 节省了实验经费。 0032 3、 本发明首次结合了先进的Tem。
19、-PCR多重扩增技术和基因芯片检测技术， 建立了 在一张芯片上可同时检测ASFV、 PRV、 SVDV、 FMDV4种病原的体系， 为以后的重要病原微生物 的分子生物学检测奠定了基础。 0033 4、 在单管反应中实现多种不同基因的高通量检测， 避免了多重PCR扩增效率因多 说明书 2/8 页 5 CN 105543410 A 5 对引物不兼容而受到影响， 没有统一的反应条件， 存在引物扩增偏爱性。 附图说明 0034 图1是本发明实施例提供的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法流 程图。 0035 图2是本发明实施例提供的杂交结果图； 0036 图中： 1-8： PC、 HC、。
20、 ASFV、 FMDV-O、 PRV、 SVDV、 NC、 PC。 0037 图3是本发明实施例提供的杂交结果； 0038 图中： 1-8： PC、 HC、 ASFV、 FMDV-O、 PRV、 SVDV、 NC、 PC。 0039 图4是本发明实施例提供的杂交结果图； 0040 图中： 1-8： PC、 HC、 ASFV、 FMDV-O、 PRV、 SVDV、 NC、 PC。 0041 图5是本发明实施例提供的杂交结果； 0042 图中： 1-8： PC、 HC、 ASFV、 FMDV-O、 PRV、 SVDV、 NC、 PC。 具体实施方式 0043 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更。
21、加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0044 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。 0045 如图1所示， 本发明实施例的基于TEM-PCR和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法包 括以下步骤： 0046 S101： DNA微阵列制备： 通过原位合成法将寡核苷酸固定到基片上， 采用玻片为基 因芯片的支持物， 支持物， 在聚合反应之前， 要使表面衍生出羟基或氨基； 0047 S102： 从细胞培养物或组织病料中提取核酸， 通过PCR方法进行扩增， 所有扩增产 物用荧光标记素对产物进行标记。
22、， 将荧光素标记在下游引物的5 末端； 0048 S103： 芯片的杂交； 0049 S104： 杂交反应过后， 各阵列将带有不同浓度的荧光标记， 借助激光共聚焦显微扫 描仪或CCD成像设备， 根据探针标记所用的荧光素种类选择激发光波长进行扫描， 然后应用 数据分析软件自动获取基因芯片上的各种信息， 并对信息进行处理获得结果。 0050 下面结合实验对本发明的应用效果作进一步的说明。 0051 本实验分析了ASFV、 SVDV、 FMDV、 PRV致病因子基因的基础上， 依据靶序列富集多重 PCR(Tem-PCR)的原理， 设计了4对特异性的套式PCR引物和探针， 并在各内引物的5 端分别 加。
23、上能被一对通用引物识别的标签序列。 本实验建立了一种能同步检测4种常见病原的 Tem-PCR方法。 0052 优化后的Tem-PCR方法PrimerMix的最佳浓度0.2 M， 反应的最佳退火温度为50 。 实验结果表明： ASFV、 SVDV、 FMDV、 PRV这4种病原， 使用该方法可以在1支反应管内快速、 同步进行检测， 得到大小分别为272bp(ASFV)， 218bp(SVDV)、 233bp(FMDV)和576bp(PRV)的 特异性产物。 Tem-PCR方法对4种病原基因组的检测灵敏度分别为： 3.5106copies/ L (ASFV)、 6.3105copies/ L(SV。
24、DV)、 4.2106copies/ L(FMDV)、 4.6103copies/ L 说明书 3/8 页 6 CN 105543410 A 6 (PRV)。 特异性实验发现该Tem-PCR方法从阳性重组质粒基因组中均得到了大量的特异性扩 增产物， 其他基因组DNA无特异性条带出现。 用优化的Tem-PCR方法同时检测4种猪病毒， 并 将产物用基因芯片技术检测， 结果所有的杂交质控位点及检测样品均发出绿色荧光， 所有 的阴性质控位点均未发出荧光， 表明杂交过程是有效可靠的。 0053 实验的具体步骤如下： 0054 1.原理 0055 1.1Tem-PCR的技术原理 0056 Tem-PCR(。
25、靶序列富集多重， Target-EnrichedMultiplexPCR)技术是近几年才出 现的一种检测技术。 在Tem-PCR中， 首先针对待扩增的每一种靶序列， 设计两对巢式的特异 性引物： 外引物(Fo/Ro)、 内引物(Fi/Ri)。 另外还有一对超级引物Fs、 Rs。 在内引物的5 端带 有一个标签序列， 该序列能被通用的超级引物(SuperPrimer)Fs、 Rs识别的。 在进行Tem-PCR 扩增时， 所有的特异性引物和超级引物都进入同一体系当中。 但是那些基因特异性的巢式 引物的浓度极低， 其作用主要是在Tem-PCR的初始阶段富集目标序列。 只有超级引物的浓度 足以进行指数。
26、扩增。 0057 整个扩增过程由以下3个阶段组成： (1)富集阶段： 低浓度的基因特异性引物被给 予足够的时间以发现并结合模板。 对每个目标序列， 根据所使用的引物， 可以形成4种产物： Fo/Ro、 Fi/Ro、 Fi/Ri和Fo/Ri。 这一阶段一般进行10个循环。 (2)加标签阶段： 把退火温度提 高到72， 此时， 仅有长至40寡核苷酸的内部引物(Fi和Ri)能够结合模板。 10个循环后， 所 有的PCR产物都被标记上和通用超级引物相同的标签序列。 (3)扩增阶段： 高浓度的超级引 物高效地扩增所有的靶序列， 并在此过程中以生物素标记PCR产物。 0058 1.2基因芯片原理 0059。
27、 基因芯片又称为DNA微阵列、 DNA芯片。 它的工作原理是： 先将已知序列的寡核苷酸 探针或者DNA密集排列， 形成的探针阵列， 然后让经过特定标记的靶DNA与芯片上特定位置 的固定探针杂交， 根据碱基互补配对的原理来确定靶DNA序列。 基因芯片可以将生物样品的 制备、 分离及各种生化反应集成在一块或几块生物芯片上， 具有快速、 高效率、 高通量等优 势。 操作程序如下： 0060 (1)DNA微阵列制备： 通过原位合成法或分配法将靶标固定在可寻址的、 已经修饰 好的固体支持物上， 原位合成法一般只能合成几十个核苷酸， 分配法一般是将PCR扩增获得 的靶标采用点样法分配在微阵列表面上， 片段。
28、较长， 一般在l00bp以上。 本实验就是通过原 位合成法将寡核苷酸固定到基片上。 固体支持物有很多种， 比如玻璃和生物膜等。 由于玻片 的理化性能较其它固体支持物优秀， 因而玻片成为基因芯片技术中最常用的支持物。 作为 原位合成的支持物， 在聚合反应之前， 要通过特殊的处理， 使其表面衍生出羟基或氨基。 0061 (2)样品制备与标记： 从细胞培养物或组织病料中提取核酸， 通过PCR方法进行扩 增。 为了进行后续的检测， 所有扩增产物都要经过标记。 通常用同位素或者荧光标记素对产 物进行标记。 荧光素应用得最为广泛。 标记的方法通常有两种。 一种方法是将荧光素标记在 下游引物的5 末端， 另。
29、一种方法是， 荧光素被标记在dNTP当中， 在进行PCR扩增时， 作为底物 参与到扩增过程中。 0062 (3)杂交： DNA微阵列原理就是核酸杂交， 因此杂交条件是否严谨极为关键。 影响核 酸杂交的因素有杂交时间， 杂交温度， 杂交液等。 要想使杂交效果达到最佳， 必须经过大量 说明书 4/8 页 7 CN 105543410 A 7 的实验， 不断摸索和总结， 最终得出杂交的最佳反应条件。 不同的实验目的对杂交的严谨度 要求也不一样。 如果实验目的是为了检测突变碱基， 那就需要极高的杂交严谨性。 如果实验 目的是为了进行疾病诊断， 杂交严谨性太高了反而不好， 因为过于严谨的杂交条件可能会 。
30、降低检出率， 这时候杂交温度的选择比其它因素更重要。 0063 (4)信号检测和分析： 杂交反应过后， 各阵列将带有不同浓度的荧光标记， 这些荧 光信号需要借助仪器来捕捉分析。 检测仪器主要有激光共聚焦显微扫描仪或CCD成像设备。 根据探针标记所用的荧光素种类选择激发光波长进行扫描， 如荧光素Cy3和Cy5的激发光波 长分别为540nm和650nm， 然后应用数据分析软件自动获取基因芯片上的各种信息， 并对信 息进行处理获得实验结果。 0064 2.Tem-PCR扩增引物 0065 根据ASFVP72序列、 FMDV-O型序列、 PRVgB序列以及SVDV序列， 通过DNAMAN比较其 同源性。
31、， 选取保守序列， 本实验所用引物详见表1， Fo和Ro为特异性外引物， Fi和Ri为特异性 内引物， Fs和Rs为通用引物。 0066 表1.引物序列与目的扩增产物大小 0067 0068 3.基因芯片技术探针 说明书 5/8 页 8 CN 105543410 A 8 0069 在靶序列区段内， 设计FMDV-O型、 ASFV、 PRV、 SVDV的特异性探针。 芯片探针序列及 修饰方法： 每条探针的5 端均通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。 使用一段随机序 列作为位置质控(Positioncontrol,PC)， 其5 端连接有一个氨基， 3 端连接一个Cy3荧光 基团； 使用烟草花。
32、叶病毒的一段基因作为杂交质控(Hybridcontrol,HC)其5 端连接有一 个Cy3荧光基团， 并使用它的互补序列作为杂交质控探针(Hybridcontrol-probe,HC-p)其 5 端同样通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。 探针序列具体如表2： 0070 表2. 0071 0072 4.Tem-PCR反应体系和参数 0073 反应体系(50 L)： 2PremixrTaq25 L， 2 MPrimerMix5 L， 10 MFs2 L， 10 M Rs2 L， RNase-freeddH2O12 L， DNA模板4 L反应参数为见表3。 0074 表3.Tem-PCR反应程。
33、序 0075 说明书 6/8 页 9 CN 105543410 A 9 0076 0077 5.DNA微阵列制备 0078 使用北京博奥点样缓冲液配制点样体系。 分别将6 L位置质控(PC， 50 M、 杂交质控 (HC， 50 M)、 阴性质控(NC， ddH2O)、 检测探针(50 M)与等量2点样缓冲液混合， 按设计方案 加入386孔板内。 0079 使用PersonalArrayerTM16微阵列芯片点样系统进行点样。 打开电源， 并在电脑上 打开晶芯PersonalArrayer16操作软件， 待其自检完毕后进入设置界面。 首先装载点样 针， 随后进行位置校正。 清洗位置、 抽干位置。
34、、 超声位置、 第一片玻片位置、 点样板A24孔位置 均需要进行校正。 对超声清洗槽注入超纯水至标定位置， 放入386孔板， 放入待点醛基基片 和用于预点样的玻片， 控制点样仪内环境湿度为50-60(仪器自动控制)。 在操作软件中 设置点样参数， 在玻片设置中OX:11.3， OY:11.3， 起始玻片1， 点样玻片数和预点样玻片数按 实际放入数量设置； 在点阵设置中针阵点距X向和Y向均为400 m， 针阵点数均为8， 样品重复 点数为8， 阵间间隔X向为1mm， Y向为11.1mm， 阵数X向为1， Y向为4， 阵列重复选择是， 预点样 点数为20， 预点样间距为500 m； 在样品设置中按。
35、实际386孔板布局设置， 在样品设置的高级 选项中， 点样停留时间为0.02s， Z轴抬针高度为2mm， Z轴落针深度为2mm， 取样时Z轴深度修 正为0mm， 取样停留时间为1.5s； 在清洗设置中清洗、 超声、 抽干均为1s， 重复12轮以上。 按芯 片点阵设计要求， 每个点样体系样品重复8个点， 点样顺序为PC、 HC、 样品1(ASFV)、 样品2 (FMDV-O)、 样品3(PRV)、 样品4(SVDV)、 NC、 PC， 形成88的点阵。 芯片探针点完后， 在点样仪 内静置10-30min， 然后把点好探针的芯片置于暗湿盒内， 37水化过夜， 使探针与基片充分 结合。 0080 水。
36、化后进行基因芯片的封闭， 封闭需避光进行： 将芯片放入清洗液(0.2SDS)中 100g/min缓慢摇动5min， 取出放入超纯水中提拉20次， 放入封闭液中100g/min缓慢摇动 5min， 取出放入超纯水中提拉20次， 最后1000g/min离心10min甩干， 密封、 室温保存备用。 0081 6.芯片的杂交 0082 表4待检样品杂交体系 0083 0084 将此置于PCR仪中， 在95条件下变性5min， 立即取出置于冰上， 冰浴5min。 打开芯 说明书 7/8 页 10 CN 105543410 A 10 片杂交盒， 将杂交盒平放在桌面上， 在杂交盒底部凹槽内加入约500100。
37、0 L超纯水。 将芯 片正面朝上(围栏面朝上， 标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间； 放上芯片盖片， 注意有凸台的一面朝向芯片， 上端先接触芯片， 再缓缓盖下； 然后用移液器通过盖片加样孔 缓慢注入17 L变性后的杂交液， 杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面 之间形成一道液膜。 盖紧杂交盒盖。 安装上铝合金封条， 置42杂交盒中避光杂交3h。 0085 杂交后， 取出芯片放在42预热好的洗液I中， 42震荡清洗4min， 再用42预热 好的洗液II， 42震荡清洗4min， 最后用42预热好的清水清洗一次， 装于塑料玻片盒， 以 1000g/min速度离心干燥5min后。
38、进行扫拭芯片信息。 0086 7.芯片的扫描分析 0087 使用博奥Luxscan-10K/A芯片扫描仪扫描。 Luxscan-10K/A芯片扫描仪参数设置： 通道： 绿光通道； 荧光染料： Cy3； Power： 95； PMT： 600； 分辨率： 10。 0088 8.结果与分析 0089 经过扫描， 得到图2、 3、 4、 5四个重复结果。 以下四张图均为88的点阵， 每张图中， 每一横排为8个重复点样， 8个纵行依次是： PC、 HC、 样品1(ASFV)、 样品2(FMDV-O)、 样品3 (PRV)、 样品4(SVDV)、 NC、 PC。 所有的杂交质控位点及检测样品均发出绿色荧光， 所有的阴性 质控位点均未发出荧光， 表明杂交过程是有效可靠的， 杂交实验是成功的。 0090 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 8/8 页 11 CN 105543410 A 11 图1 图2图3 说明书附图 1/2 页 12 CN 105543410 A 12 图4 图5 说明书附图 2/2 页 13 CN 105543410 A 13 。