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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610009879.5 (22)申请日 2016.01.07 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/74(2006.01) G01N 15/14(2006.01) (71)申请人 南京工业大学 地址 210009 江苏省南京市新模范马路 5 号 (72)发明人 应汉杰 庄昆 王留勤 牛欢青 郭亭 柳东 陈勇 吴菁岚 庄伟 朱晨杰 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 肖明芳 (54) 发明名称 新型节杆菌启动子序列及其应用 (57) 摘要 本发明通过鸟枪法筛选得到了新。
2、型节杆菌启 动子的基因序列， 该启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 4 所示， SEQ ID NO ： 2 4 所示的核苷 酸序列是通过将 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列 逐渐缩短得到的。将得到的强度最强的启动子构 建到表达质粒上， 在节杆菌中过表达 cAMP 生产关 键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT， 得到的重 组菌的 cAMP 的产量达到了 7.57g/L。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表6页 附图4页 CN 105505933 A 2016.04.20 CN 1055。
3、05933 A 1.一种节杆菌启动子序列， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2、 SEQIDNO： 3或SEQIDNO： 4所示。 2.节杆菌启动子序列的筛选方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)提取节杆菌基因组DNA； (2)Sau3A 酶切节杆菌基因组DNA， 回收1001000bp之间的片段； (3)将步骤(2)得到的小片段与启动子筛选质粒连接， 然后将连接液先转化至大肠杆菌 预扩增质粒， 再提取质粒电转化至节杆菌， 并涂布在平板上， 培养36h， 所述的筛选质粒以绿 色荧光蛋白为报告基因； (4)从平板上挑取菌落在液体培养基中培养， 利用流式。
4、细胞仪分析是否产生绿色荧光 蛋白。 3.根据权利要求2所述节杆菌启动子序列的筛选方法， 其特征在于， 所述的启动子筛选 质粒， 其核苷酸序列如SEQIDNO： 5所示。 4.权利要求1所述的节杆菌启动子序列作为基因启动子在节杆菌中的应用。 5.一种表达质粒， 其特征在于， 该质粒中含有SEQIDNO： 14所示的任一种核苷酸序 列。 6.权利要求5所述的表达质粒作为基因载体在节杆菌中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505933 A 2 新型节杆菌启动子序列及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及节杆菌启动子序列及其应用。 背景技术 0002 启动子是一。
5、段位于结构基因5 端上游的DNA序列， RNA聚合酶能够与之结合并起始 基因的转录1， 这是基因表达的最关键阶段。 原核生物一个基因的转录单元是从启动子开 始至终止子结束， RNA聚合酶从转录起始位点开始沿着模板前进， 直到终止子为止， 转录出 一条完整的mRNA链。 启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力， 从而影响基因的表达水 平。 由此可见， 启动子决定了基因的表达程度和表达时间， 是基因表达最重要的调控元件之 一。 近些年， 随着合成生物学的发展， 筛选多样性的启动子也越来越受到人们的重视。 0003 节杆菌是一种在土壤中分布广泛的专性好氧微生物， 在系统分类学上属于放线菌 微球菌。
6、科(Micrococcaceae)。 节杆菌细胞在生长过程中会产生显著的形态变化， 早期培养 物中的细胞呈不规则细杆状， 部分杆菌按照一定的角度排列， 进入稳定期后细胞呈球形， 将 其转接到新鲜的培养基中， 细胞又会产生分支， 形成不规则的杆状， 如此循环是节杆菌最典 型的形态特征。 节杆菌既可以生存在普通的土壤中， 也可以生存在各种条件复杂的极端环 境中， 如有机溶剂、 极寒地区等， 近些年的研究表明节杆菌除了具有以上抗逆性以外还能用 于生产氨基酸和生物表面活性剂。 因此， 对节杆菌的相关研究具有重要的工业应用价值。 0004 但是， 目前节杆菌可用的表达质粒很少， 从而限制了节杆菌的基因研。
7、究和工业应 用。 已经报道的节杆菌质粒主要有如下几个： 1988年Shaw等利用来源于谷氨酸棒杆菌的复 制原点pBL100， 以pULRS8为骨架构建了一种隐蔽质粒。 2005年Sandu等利用来源于谷氨酸棒 杆菌的复制原点pCG100构建了pART2和pART3两种质粒。 其中pART2可以用于基因的组成型 表达， pART3可以用尼古丁诱导基因表达。 以上所报道大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒都是利用 系统发育相近物种的隐蔽质粒构建的。 2008年Miteva等报道了以节杆菌隐蔽质粒p54为骨 架的杂交载体(hybridvector)pSVJ21。 2011年Ruta等报道了以Arthrobact。
8、errhombi隐蔽 质粒pPRH为复制子来源的E.coli-Arthrobacter穿梭质粒Prmu824Km。 上述几种质粒， 只有 pART2和pART3可以用于在节杆菌中表达基因， 其他的质粒仅限于用于研究质粒在节杆菌中 的拷贝数及节杆菌的电转化实验。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是， 提供一种高效的节杆菌新型启动子。 0006 本发明还要解决的技术问题是， 提供一种节杆菌启动子的筛选方法。 0007 本发明最后要解决的技术问题是， 提供上述节杆菌启动子的应用。 0008 为解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案： 0009 一种节杆菌启动子序列， 其核苷酸序列如SE。
9、QIDNO： 1、 SEQIDNO： 2、 SEQIDNO： 3或SEQIDNO： 4所示。 0010 SEQIDNO： 24所示的核苷酸序列是在SEQIDNO： 1的基础上逐渐缩短得到的。 说明书 1/5 页 3 CN 105505933 A 3 0011 节杆菌启动子序列的筛选方法， 包括如下步骤： 0012 (1)提取节杆菌基因组DNA； 0013 (2)Sau3A 酶切节杆菌基因组DNA， 回收1001000bp之间的片段； 0014 (3)将步骤(2)得到的小片段与启动子筛选质粒连接， 然后将连接液先转化至大肠 杆菌预扩增质粒， 再提取质粒电转化至节杆菌， 并涂布在平板上， 培养36。
10、h， 所述的筛选质粒 以绿色荧光蛋白为报告基因； 0015 (4)从平板上挑取菌落在液体培养基中培养， 利用流式细胞仪分析是否产生绿色 荧光蛋白。 0016 其中， 所述的启动子筛选质粒， 其核苷酸序列如SEQIDNO： 5所示。 0017 上述的节杆菌启动子序列在节杆菌的应用。 0018 一种表达质粒， 该质粒中含有该质粒中含有SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2、 SEQID NO： 3、 SEQIDNO： 4所示的任一种核苷酸序列。 0019 上述表达质粒作为基因载体在节杆菌中的应用。 0020 有益效果： 0021 本发明通过构建节杆菌启动子探针质粒， 在节杆菌中筛选到一种高强。
11、度启动子， 利用该启动子构建了新的节杆菌表达质粒， 丰富了节杆菌的分子生物学操作工具。 利用本 发明构建的节杆菌表达质粒在节杆菌CGMCC3584中表达腺苷酸环化酶， 其cAMP的产量比出 发菌株提高了47。 附图说明 0022 图1节杆菌基因组提取。 0023 图2 Sau3A 随机酶切节杆菌基因组。 M： DL2000DNAmarker1： Sau3A 酶切节杆菌 基因组15min2： Sau3A 酶切节杆菌基因组30min3： Sau3A 酶切节杆菌基因组45min。 0024 图3基因组随机酶切片段琼脂糖凝胶电泳胶回收及BamH 单酶切pARK-SDGFP。 M: DL5000DNAm。
12、arker， 1:基因组酶切片段胶回收， 2： BamH 单酶切pARK-SDGFP。 0025 图4流式细胞仪分析各启动子强度。 0026 图5菌落PCR获得启动子片段。 M： DL2000DNAmarker， 125： P1P25启动子片段。 0027 图6启动子序列多重比对。 0028 图7启动子P8序列分析。 0029 图8启动子强度分析。 具体实施方式 0030 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的内容仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。 0031 本发明中所用的节杆菌为节杆菌CGMCC35。
13、84， 该菌株的详细信息在申请号为 201010191515.6的中国专利中详细公开。 0032 实施例1： 节杆菌基因组的提取 0033 节杆菌基因组的提取方法参照下面的步骤进行： 说明书 2/5 页 4 CN 105505933 A 4 0034 1)收集20mL过夜培养的菌液， 用50mMTris-HCl(pH8.0)洗两遍， 用5mL50mM Tris-HCl(pH8.0)重悬； 0035 2)加溶菌酶至终浓度为10mg/mL， 37水浴30min； 0036 3)加0.5ml10的SDS， 混匀， 70水浴15min； 0037 4)加蛋白酶K至终浓度为0.1mg/mL， 55水浴1。
14、h； 0038 5)加2mL5M的NaCl， 混匀后， 加入等体积的酚/氯仿(1:1)或酚/氯仿/异戊醇(25: 24:1)， 混匀， 12000rpm离心10min， 转移上层水相至干净离心管； 0039 6)再用酚/氯仿(1:1)或酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提， 至有机相与水相交界处 白色变性蛋白较少； 0040 7)转移上层水相至干净离心管， 加入等体积氯仿或氯仿/异戊醇(24： 1)， 离心， 转 移上清至干净离心管； 0041 8)加等体积异丙醇沉淀DNA， 轻轻混匀； 0042 9)-20放置15min， 12000rpm离心10min； 0043 10)弃上清， 用5m。
15、L70乙醇洗两遍； 0044 11)弃上清， 放烘箱烘至无乙醇味； 0045 12)用0.5ml灭菌蒸馏水溶解DNA沉淀(浓度约为1ug/uL)。 0046 节杆菌基因组DNA凝胶电泳图如图1所示。 0047 实施例2： Sau3A 酶切节杆菌基因组时间的确定 0048 Sau3A 酶切节杆菌基因组DNA体系参照表1进行。 0049 表1Sau3A 酶切节杆菌基因组DNA体系 0050 0051 按照以上体系在1ml离心管中依次加入各组分， 放在37水浴锅水浴， 分别于 15min、 30min、 45min取样并立即加入Loadingbuffer终止反应， 利用0.8的琼脂糖凝胶电 泳检测酶。
16、切结果。 0052 节杆菌基因组DNASau3A 酶切15min、 30min、 45min的电泳图如图2所示， 实验结果 表明酶切45min时酶切DNA片段大小分布于1001000bp之间， 所以选择37， Sau3A 酶切 45min作为鸟枪法获得DNA片段的条件。 0053 实施例3： 酶切片段的回收与连接 0054 Sau3A 酶切基因组DNA片段通过0.8的琼脂糖凝胶电泳分离， 然后切胶回收100 1000bp之间的片段。 0055 探针质粒pARK-SDGFP用BamH 单酶切后胶回收、 CIAP去除5 末端磷酸回收电泳图 如图3所示， 结果表明酶切比较完全， 且浓度较高， 可用于。
17、连接实验。 0056 线性化的探针质粒载体与DNA酶切片段的连接体系参照表2， 放置于16的反应器 说明书 3/5 页 5 CN 105505933 A 5 中， 连接12h。 0057 表2DNA片段与探针载体连接体系 0058 0059 实施例4： 质粒转化节杆菌 0060 将实施例3中的连接产物先转化至大肠杆菌DH5 感受态， 在37恒温箱培养12h 后， 用接种环将平板上的菌落刮到5ml的LB液体培养基中， 37， 200rpm培养2h， 然后将菌液 收集用于提质粒。 将从大肠杆菌中提取的质粒经DNA浓缩后电转至节杆菌。 0061 实施例5： 启动子文库质量鉴定 0062 连接液转大肠。
18、杆菌DH5 后获得大约40000个克隆， 随机从转化平板上挑取50个单 菌落， 利用如下引物进行PCR验证, 0063 Unknown-F:5 -GGGCGGCCACGGCACACGAAA-3 ； 0064 Unknown-R:5 -GCCGTAGGTGGCATCGCCCTCG-3 ； 0065 以未插入片段的pARK-SDGFP为模板作为对照组， 结果只有5个克隆PCR产物电泳条 带位置与对照位置一致， 即没有插入DNA片段， 文库插入率达到了90以上。 PCR获得的片段 大小分布在200600bp之间。 节杆菌的基因组全长为4.2Mb， 按照片段平均大小为400bp计 算， 本文所构建启动。
19、子文库大约覆盖基因组全长的3.4倍。 0066 实施例6： 流式细胞仪检测启动子强度及启动子初筛 0067 流式细胞仪检测启动子强度的方法： 挑取节杆菌平板上重组菌的单菌落， 接种到 装有5ml节杆菌液体培养基的50ml离心管中， 30， 220rpm， 培养18h。 取1ml菌液于离心管中 4000rpm离心1min， 将培养基倒干净， 然后用1mlpH8.0Tris-HCl缓冲洗三次， 最后用pH 8.0Tris-HCl缓冲重悬菌体并稀释到OD6000.2。 制备好的菌悬液立即用于流式细胞仪分 析。 0068 重组质粒按实施例4电转节杆菌后， 节杆菌电转平板上大约长出3000个单菌落， 在。
20、 365nm紫外灯下肉眼观察， 能观察到25个单菌落发出绿色荧光， 分别做好标记。 在超净工作 台将单菌落用牙签挑到液体节杆菌培养基中， 37、 200rpm培养18h， 各样品经流式细胞仪 分析结果如图4所示。 从图中可以看出虽然筛选到的启动子强度分布比较均匀， 但强度最高 的启动子是已报道的hdnOp启动子强度的17倍， 最弱的启动子强度只有已报道的hdnOp启动 子的19。 0069 实施例7： 启动子序列分析 0070 利用实施例5所示引物对， 以实施例6筛选到的绿色荧光蛋白表达菌株为模板进行 菌落PCR得到了各启动子片段， 用0.8的琼脂糖凝胶电泳检验PCR结果。 如图5所示， 启动。
21、子 说明书 4/5 页 6 CN 105505933 A 6 片段大小分布在200500bp之间， PCR特异性较好， 将PCR产物送苏州金唯智生物技术有限 公司测序。 0071 实施例8： 启动子在线分析 0072 利用启动子在线分析网站BPROM( topicbprom&groupprograms&subgroupgfindb)对新得到的25个节杆菌启动子的调 控原件进行分析， 得到了这25个不同的节杆菌启动子的潜在共同序列(见图6)。 0073 人们对节杆菌基因表达调控的原理和启动子结构知之甚少。 目前只有pAO1质粒上 的6-羟基-尼古丁氧化酶基因的启动子hdnOp被详细研究过， 未见。
22、其他关于节杆菌启动子分 析的报道。 25个节杆菌新型启动子多重序列比对结果显示-10区域位于转录起始位点上游 6-8个碱基处， 其序列与大肠杆菌保守序列TATAAT相差比较大。 -35区在-10区上游13-22bp 处， 该区域的共同序列为TTGACA/G， 与大肠杆菌-35区域保守序列TTGACA极其相似。 同时 在-35区域的上游还发现了一段富含AG的共同序列， 这段序列可能与转录起始有关。 0074 实施例9： 启动子P8缩短实验 0075 为了获得更强启动子， 尝试对强启动子P8进行缩短实验， 首先利用启动子在线分 析网站BPROM( topicbprom&group programs。
23、&subgroupgfindb)对启动子P8的功能区域进行预测， 分析结果如图7所示。 P8启 动子全长为246bp(SEQIDNO:1)， -35区和-10区用下划线标出， +1表示转录起始位点。 图中 方框标注的是转录因子结合位点， 在P8启动子中可以找到与ntrC(TGCACTAA)转录因子结合 位点。 0076 利用定点突变技术对P8启动子分别按照图7中标注的、 、 位置进行截短， 将 P8启动子截短为P8-1224bp(SEQIDNO:2)、 P8-2142bp(SEQIDNO:3)、 P8-3102bp(SEQ IDNO:3)， 将各片段回收后利用大肠杆菌进行体内重组定点突变。 将。
24、测序正确的阳性克隆 转化节杆菌， 并用流式细胞仪分析荧光强度， 结果如图8所示。 从图中可以看出， 去除P8启动 子上游的第一段和第二段序列对其强度的影响不明显， 但是去除第三段序列后启动子的强 度比原始启动子P8提高35。 P8-3的启动子强度是已报道的hdnOp启动子的24倍。 0077 实施例10： p8-3启动子的应用 0078 构建pARK-hdnOp-hgprt和pARK-p8-3-hgprt质粒， 将两个质粒电转节杆菌进行发 酵生产cAMP实验， 种子培养基于30， 260rpm培养18h， 然后按10接种量转接至发酵培养 基， 30， 260rpm发酵72h(pARK质粒的核苷。
25、酸序列在申请号为201510186254.1的中国专利 中已经公开； hgprt基因的核苷酸序列在申请号为201310248615.1的中国专利中已经公 开)， 发酵结束后液相检测cAMP产量。 0079 种子培养基： 10g/L葡萄糖,10g/L蛋白胨10g/L牛肉膏,5g/L酵母粉,3g/LNaCl, 10g/L酸水解酪蛋白,0.001g/L生物素。 0080 发酵培养基(g/L)： 葡萄糖40g， K2HPO418g， KH2PO45g， MgSO47H2O0.1g， 尿素 10g， CoCl20.005g， NaF0.4g， 生物素0.01g， 次黄嘌呤6g， pH7.0。 0081 。
26、发酵结果： pARK-p8-3-hgprt节杆菌转化株cAMP产量7.570.42g/L， 比pARK- hdnOp-hgprt节杆菌转化株(6.360.34g/L)高19， 比节杆菌空菌(5.150.27g/L)高 47。 结果表明启动子P8-3有启动子活力并可用于基因操作。 说明书 5/5 页 7 CN 105505933 A 7 0001 0002 序列表 1/6 页 8 CN 105505933 A 8 0003 序列表 2/6 页 9 CN 105505933 A 9 0004 序列表 3/6 页 10 CN 105505933 A 10 0005 序列表 4/6 页 11 CN 105505933 A 11 0006 序列表 5/6 页 12 CN 105505933 A 12 序列表 6/6 页 13 CN 105505933 A 13 图1 图2 图3 说明书附图 1/4 页 14 CN 105505933 A 14 图4 图5 说明书附图 2/4 页 15 CN 105505933 A 15 图6 图7 说明书附图 3/4 页 16 CN 105505933 A 16 图8 说明书附图 4/4 页 17 CN 105505933 A 17 。