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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511006949.3 (22)申请日 2015.12.30 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 广州金域检测科技股份有限公司 地址 510000 广东省广州市国际生物岛螺旋 四路 1 号标准产业单元一期生产区第 三层 304 单元 (72)发明人 胡昌明 梁耀铭 于世辉 赵薇薇 燕启江 罗锦霞 (74)专利代理机构 北京精金石专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 11470 代理人 刘晔 (54) 发明名称 一种检测 CYP2D6_G4180C 基因多态性的引物 与方法 (57。
2、) 摘要 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一 种检测 CYP2D6_G4180C 基因多态性的引物与方 法。本发明提供的 CYP2D6_G4180C 基因多态性的 引物， 包括巢式 PCR 扩增引物和 SNaPshot PCR 引 物 ； 所述巢式 PCR 扩增引物包括巢式 A 轮 PCR 扩 增引物和巢式 B 轮 PCR 扩增引物。本发明提供 的 CYP2D6_G4180C 基因多态性的引物具有特异性 好， 不会发生交叉反应， 准确性高的优点， 实现了 CYP2D6_G4180C 基因多态性的检测， 对实现基因 导向性个体化治疗， 不断提高治疗效果、 降低不良 反应具有非常重要的意义。。
3、 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 CN 105506093 A 2016.04.20 CN 105506093 A 1.一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物， 其特征在于： 包括巢式PCR扩增引物和 SNaPshotPCR引物； 所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引 物； 所述巢式A轮扩增引物为： 针对CYP2D6的上游引物5 -CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3 和 下游引物5 -CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3 。
4、； 所述巢式B轮PCR扩增引物为： 针对CYP2D6_ G4180C的上游引物5 -GCAGCACTTCAGCTTCTCG-3 和下游引物5 -TACCCCTGTCTCAAATGCG- 3 ； 所述SNaPshotPCR引物为 ： 针对CYP2D6_G4180C的SNaPshotPCR引物5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT-3 。 2.一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2采用权利要求1所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增， 对A轮PCR扩增产物进行纯。
5、 化； S3以巢式A轮PCR扩增产物为模板采用权利要求1所述的巢式B轮PCR扩增引物进行多重 PCR扩增； S4采用权利要求1所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增， 对扩增产物进行 纯化； S5毛细管电泳技术进行检测， 对检测结果进行分析， 确定SNP位点及其基因型。 3.根据权利要求2所述的检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法， 其特征在于： 所述步 骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。 4.根据权利要求2所述的检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法， 其特征在于： 所述步 骤S2中的巢式A轮PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 9。
6、83min； 阶段2： 9810s； 阶段3： 72 3min； 阶段4： 返回到阶段2， 24个循环； 阶段5： 725min； 阶段6： 25保温。 5.根据权利要求2所述的检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法， 其特征在于： 所述步 骤S3中的巢式B轮PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 983min； 阶段2： 9810s； 阶段3： 58 30s； 阶段4： 721min； 阶段5： 返回到阶段2， 29个循环； 阶段6： 725min； 阶段7： 25保 温。 6.根据权利要求2所述的检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法， 其特征在于： 所述步 骤S4中的SNaP。
7、shotPCR扩增反应条件包括： 阶段1： 9610s； 阶段2： 555s； 阶段3： 60 30s； 阶段4： 返回到阶段1， 25个循环； 阶段5： 4保温。 7.根据权利要求2所述的检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法， 其特征在于： 所述步 骤S5中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。 8.根据权利要求1所述的CYP2D6_G4180C基因多态性的引物在制备检测CYP2D6_G4180C 基因多态性试剂中的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506093 A 2 一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物与方法 技术领域 0001。
8、 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的 引物与方法。 背景技术 0002 CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶， CYP2D6是位于第22号染色体上， 其含有9个外显子和8个内含子， 总长为7kb左右， 是一个完整的功能性基因。 有研究发现， CYP2D6基因上游有2个高度同源的假基因， 分别称为CYP2D7P基因和CYP2D8P基因， CYP2D7P 基因与CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性， 而且带有TATA盒， 但是由于在外显子1的第226 位点上插入了一个胸腺嘧啶 （T） ， 从而改变了读码框架， 使转录提前终止； C。
9、YP2D8P基因是一 个含有多个断裂点的突变假基因。 CYP2D7P和CYP2D8P基因在人体足迹中均不表达， 只有 CYP2D6在肝、 肠、 肾和人脑中表达。 0003 现代研究发现， 肝脏中CYP2D6的含量仅占P450肝脏蛋白总量的2%， 但是， 它却参与 代谢约25%的临床用药， 包括抗抑郁药、 抗心律失常药、 抗精神病药和镇痛药等。 目前已发现 超过100种CYP2D6等位基因的变异， 主要是单核苷酸变异、 大片段基因的丢失以及多基因拷 贝， 这些变异使CYP2D6基因呈现多态性， 并决定其代谢表型的多样性， 使酶的活性表现为缺 失、 降低、 正常或是增加等几种类型。 0004 杨汐。
10、等人发表了一篇题目为 “CYP2D6基因多态性与他莫昔芬治疗” 的论文， 该论文 表明不同基因型的CYP2D6对他莫昔芬的代谢不同， 产生的活性代谢产物(4-羟基他莫昔芬 和Endoxifen)浓度不同， 其中PMs(含两个无效等位基因致CYP2D6活性缺失)血浆中活性 代谢产物浓度最低， 而UMs(含两个以上正常功能等位基因， 即多基因拷贝致CYP2D6活性增 强)血浆活性代谢产物浓度最高。 因此， CYP2D6_的多态性研究对临床具有重要的意义， 成为 目前研究的热点。 发明内容 0005 为解决现有技术中存在的问题， 本发明提供一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性 的引物与方法，。
11、 该引物检测CYP2D6基因G4180C(rs1135840)位点， 具有特异性好、 灵敏度 高、 准确性高等优点， 为CYP2D6_G4180C基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。 0006 本发明提供了一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物， 包括巢式PCR扩增引物 和SNaPshotPCR引物； 所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增 引物； 所述巢式A轮扩增引物为： 针对CYP2D6的上游引物5 -CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3 （SEQIDNO.1） 和下游引物5 -CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3（SE。
12、QIDNO.2） ； 所述巢式B轮 PCR扩增引物为： 针对CYP2D6_G4180C的上游引物5 -GCAGCACTTCAGCTTCTCG-3（SEQID NO.3） 和下游引物5 -TACCCCTGTCTCAAATGCG-3（SEQIDNO.4） ； 所述SNaPshotPCR引物 为 ：针 对 C Y P 2 D 6 _ G 4 1 8 0 C 的 S N a P s h o t P C R 引 物 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT-3（SEQIDNO.5） 。 说明书 1/7 页 3 CN 105506093 A 3 。
13、0007 另外， 本发明还提供了一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法， 包括如下步 骤： S1提取DNA样品； S2采用权利要求1所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增， 对巢式A轮PCR扩增产物进 行纯化； S3以巢式A轮PCR扩增产物为模板采用权利要求1所述的巢式B轮PCR扩增引物进行多重 PCR扩增； S4采用权利要求1所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增， 对扩增产物进行 纯化； S5毛细管电泳技术进行检测， 对检测结果进行分析， 确定SNP位点及其基因型。 0008 进一步地， 所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。 。
14、0009 进一步地， 所述步骤S2中的巢式A轮PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 983min； 阶 段2： 9810s； 阶段3： 723min； 阶段4： 返回到阶段2， 24个循环； 阶段5： 725min； 阶段 6： 25保温。 0010 进一步地， 所述步骤S3中的巢式B轮PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 983min； 阶 段2： 9810s； 阶段3： 5830s； 阶段4： 721min； 阶段5： 返回到阶段2， 29个循环； 阶段6： 725min； 阶段7： 25保温。 0011 进一步地， 所述步骤S4中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括： 阶段1： 9610。
15、s； 阶 段2： 555s； 阶段3： 6030s； 阶段4： 返回到阶段1， 25个循环； 阶段5： 4保温。 0012 进一步地， 所述步骤S5中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。 0013 除此之外， 本发明提供的CYP2D6_G4180C基因多态性的引物在制备检测CYP2D6_ G4180C基因多态性试剂中的用途。 0014 与现有技术相比， 本发明提供的技术方案具有以下优势： 本发明提供了一种检测 CYP2D6_G4180C基因多态性的引物， 该引物的特异性好， 不会发生交叉反应， 准确性好， 实现 了CYP2D6_G4180C基因多态性的检测， 对实现基因。
16、导向性个体化治疗， 不断提高治疗效果、 降低不良反应具有非常重要的意义。 附图说明 0015 图1为本发明提供的CYP2D6_G4180C的扩增片段； 图2为CYP2D6_G4180C引物扩增产物的部分测序图； 图3为样品的CYP2D6_G4180C基因多态性检测结果图。 具体实施方式 0016 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。 0017 实施例一、 引物 本发明提供的引物如表1所示， 包括巢式PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物； 所述巢式 PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物， 所述巢式B轮PCR扩增引物 和SNaPshotPCR引物是相对应。
17、的。 本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对， 无 已知SNP位点。 说明书 2/7 页 4 CN 105506093 A 4 0018 表1本发明提供的引物 实施例二、 引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting， 结果如下： CYP2D6_G4180C基因特异引物于UCSC中进行Blast， 无其它同源基因。 CYP2D6_G4180C扩 增片段位于chr22:42126391-42126685， 长度为295bp， 扩增序列如图1。 0019 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序， 测序结果显示， 各引物扩增片段与CYP2D6_。
18、G4180C基因参考序列吻合， 结果如图2所示。 使用表1中SNaPshot PCR引物， SNaPshot法进行检测， 结果如图3所示。 从图3可知， 各产物峰的相对位置及测序反 应掺入的碱基与预期相符， 且无其它干扰峰。 0020 实施例三、 CYP2D6_G4180C基因多态性的检测 1） 提取EDTA抗凝外周血的DNA样品， 提取方法参照TIANampBloodDNAKit （购自 Tiagen， 货号DP318） 的说明书， 将DNA样品稀释至100ng/ L， 备用。 0021 2） 配制引物混合物： 配制巢式A轮PCR引物混合物， CYP2D6-Fwd:CYP2D6-Rev:H2。
19、O= 1:1:3， 引物终浓度为1pmol/ L， 震荡混匀， 短暂离心后备用； 配制B轮PCR引物混合物， 引物 终浓度为0.5pmol/ L； 短暂离心后备用； PCR扩增采用Q5热启动超保真2XMasterMix （购 自NEB公司， 货号M0494L） ， 反应体系如表2所示。 A轮PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 98 3min； 阶段2： 9810s； 阶段3： 723min； 阶段4： 返回到阶段2， 24个循环； 阶段5： 72 5min； 阶段6： 25保温。 巢式B轮PCR以A轮PCR产物为模板， 巢式B轮PCR扩增反应条件包括： 阶段1： 983min； 阶段2： 98。
20、10s； 阶段3： 5830s； 阶段4： 721min； 阶段5： 返回到阶 段2， 29个循环； 阶段6： 725min； 阶段7： 25保温。 PCR扩增结束后， 取2.0 LExoSAP-IT （购自Affymetrix， 货号78205） 和3.0 LddH2O， 混匀， 加入PCR扩增产物2.0 L， 混匀微离心； 在PCR仪中进行酶切反应， 程序： 37， 15min； 80， 15min； 4， 保温。 0022 表2、 PCR试剂配制表格 3） 配置SNaPshotPCR引物混合物， 引物终浓度为0.8pmol/L， 采用SNaPshot 说明书 3/7 页 5 CN 105。
21、506093 A 5 MultiplexKit （购自ABI公司， 货号4323151） 进行扩增， 反应体系如表3所示。 SNaPshot PCR反应条件包括： 阶段1： 9610s； 阶段2： 555s； 阶段3： 6030s； 阶段4： 返回到阶段 1， 25个循环； 阶段5： 4保温。 0023 表3、 SNaPshot试剂配制表格 在SNaPshotPCR产物中加入1.0 LSAP酶， 按照以下程序进行反应： 37， 15min； 80， 15min； 4， 保温。 反应完毕后， 毛细管电泳技术进行检测， 对检测结果采用GENEMAPPERID V4.1软件进行分析， 确定SNP位点。
22、及其基因型， 结果如图3所示。 0024 实施例四、 检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法的特异性 本发明方法的特异性定义为阴性符合率。 本发明对22例样本进行优化SNaPshot测序法 检测， 检测结果采用Sanger测序法进行验证。 SNaPshot测序法检测出的阴性结果与Sanger 法显示的结果相符(见表4） 。 本发明的检测特异性为100%。 0025 表4、 CYP2D6_G4180C检测特异性试验数据 实施例五、 检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法的灵敏度 本发明方法的灵敏度定义为阳性符合率。 本发明对22例样本进行优化SNaPshot测序法 检测， 检测结。
23、果采用Sanger测序法进行验证。 SNaPshot测序法检测出的阳性结果与Sanger 法显示的结果相符(见表5） 。 本发明的检测灵敏度为100%。 0026 表5、 CYP2D6_G4180C检测灵敏度 说明书 4/7 页 6 CN 105506093 A 6 实施例六、 检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法的准确度 本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。 本发明共对22例样本进行SNaPshot 测序法检测， 检测结果均采用Sanger测序法进行验证。 不同方法检测结果一致， 如表6所示。 本发明的准确度为100%。 0027 表6、 CYP2D6_G4180C基因SN。
24、Ps位点检测准确度 说明书 5/7 页 7 CN 105506093 A 7 实施例七、 检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法的精密度 本发明的精密度定义为对标本进行重复检测得到同一结果的能力。 本发明进行了人员 间、 不同时间、 不同仪器、 同一标本不同孔间的对比试验(见表7)， 所有结果均显示一致， 本 发明精密度为100%。 0028 表7、 批间精密度试验数据 说明书 6/7 页 8 CN 105506093 A 8 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱。
25、 离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护 范围。 说明书 7/7 页 9 CN 105506093 A 9 SEQUENCELISTING 广州金域检测科技股份有限公司 一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物与方法 5 5 PatentInversion3.3 1 22 DNA 人工序列 1 ccagaaggctttgcaggcttca22 2 22 DNA 人工序列 2 ctgagccctgggaggtaggtag22 3 19 DNA 人工序列 3 gcagcacttcagcttctcg19 4 19 DNA 人工序列 4 tacccctgtctcaaatgcg19 5 48 DNA 人工序列 5 序列表 1/2 页 10 CN 105506093 A 10 ttttttttttttttttttttttttttttttttttttaccatggtgtct48 序列表 2/2 页 11 CN 105506093 A 11 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 12 CN 105506093 A 12 。