技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种肿瘤分子检测/诊断试剂，具体地，涉 及一种以粪便作为检测样本的肿瘤分子检测/诊断试剂。
背景技术
目前在结直肠癌筛查上主要有两种常用技术。
一种是大便隐血试验。通常肠癌的发生演变在早期可以没有任何征兆，癌 细胞可在大肠肠壁上生长数十年再转移到其他部位，在没有任何症状前，增生 的组织可渗出少量血液，血液进入大便被排出。而大便隐血试验就是检测大便 中的血液成分(检测对象是血红蛋白)，若多次、持续的阳性反应提示消化道 出血，应做进一步检查以警惕肠道肿瘤的发生。该法的优点是结果显示快、清 晰，结果可以半定量。但其存在一系列缺点：首先，其特异性差，受饮食影响 大。含亚铁离子的食物和药物对结果有干扰，假阳性率30％。隐血检查前，指 导患者应避免服用铁剂、动物血、肝类、瘦肉以及大量绿叶蔬菜3天，如有牙 龈出血，误咽下血性唾液，以防粪便隐血检查呈假阳性；其次，其敏感度低， 出血量>90μg/ml才能检出；再次，该方法学限制条件多：患者提前准备时间长， 由于取材部位不同，反应时间不同，对显色的判断不同，故在同一方法的试验 中，也可产生误差，因此一般测试时候均要求患者采用不同天的粪便样品连续 测定。
另一种方法是肠镜检查。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效 可靠的诊断方法。绝大多数早期肠癌患者可由内镜检查发现并确诊。它通过肛 门插入可检查到直肠、乙状结肠、降结肠、横结肠、升结肠和盲肠以及与大肠 相连的一小段小肠(回盲末端)。通过镜子不但可以清楚地发现肠道病变，还可 对部分肠道病变进行治疗，如：大肠息肉等良性病变镜下直接摘除，对肠道出 血进行镜下止血，对大肠内异物进行清除。肠镜检查技术是目前其它诊疗手段 无法替代的主要手段。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的 诊断方法。然而，其也存在一系列的缺点：首先，其需要检查前准备，作肠镜 需要在检查前3天开始进食流质或少渣半流质饮食，检查当天上午空腹，检查 前一天开始服用甘露醇等导泻剂清洁肠道，服用的液体量通常高达2L，清洁灌 肠以保证肠道的清洁度，之后不能再进食。检查时医生会通过肠镜向肠腔内注 入一定量气体使肠道膨大便于观察。由于结肠结构迂回曲折，检查过程中被检 查者会有不同程度的胀痛或牵拉感觉。对于过分紧张或高度肠痉挛的受检者， 则需要使用镇静剂或解痉药物。对于不能配合的小儿，则需要在麻醉下进行。 其次，其对医生的操作熟练水平有很高的要求，初学者容易在肠镜下遗漏病变 部位造成漏诊。由于检查过程中需要注入气体，会使肠内压力增大，易引起穿 孔。再次，病人在检查过程中费力，费时，有一定的痛苦。并且检查费用高， 较难大规模推广。
除了上述两种方法之外，分子诊断方法是近年来发展迅速的癌症诊断方法。 目前，已有大量的结直肠癌分子标记物在组织和血液样本中被研究和报道，初 步估算已多达130多种。
由于组织取样创伤太大，因此，已有研究着重于粪便样本中的肠癌标记物 的筛查。例如，伍勇等尝试通过检测粪便中的标记物APC、K-ras、p53，并进 一步结合FOBT进行联合诊断。
但由于一方面粪便当中存在多种酶类，会对脱落至粪便中的DNA起到消 化、降解作用，另一方面粪便成分复杂，干扰成分过多，因此，检测结果通常 差强人意，对于同一目标基因，在粪便样本中的检测敏感性和特异性，都远远 低于在组织样本中的敏感性和特异性，严重影响了结果的判断。比如vimentin 基因在组织中对结直肠癌的敏感性为83.0％，但在粪便中的敏感性降为46％(J NatlCancerInst.2005Aug3；97(15):1124-32.)；SFRP1和SFRP2基因在组织中对 结直肠癌有很高的特异性和敏感性，SFRP1基因在组织中特异性为100％和敏 感性为95.1％(NatGenet.2002Jun；31(2):141-9.)，而在粪便中敏感性降为 52％(AdvBiomedRes.2012Dec28；1:87.)；SFRP2基因在组织中对结直肠癌的特 异性为99％和敏感性为89.5％(NatGenet.2002Jun；31(2):141-9.)，而在粪便中 特异性降为77％，敏感性降为77％(Lancet.2004Apr17；363(9417):1283-5.)。
因此，粪便样本的分子检测，目前仍很难应用于临床检测。
发明内容
本发明目的在于筛选出一种在粪便中的检测敏感性不亚于组织中的肿瘤标 记物。
本发明的进一步目的在于提供一种能以粪便作为检测样本的肿瘤分子检测/ 诊断试剂。其可以对结直肠癌或癌前腺瘤进行分子检测/诊断。并且该检测试剂 即使以粪便作为检测样本仍能获得很好的敏感性和特异性。
本发明首次筛选出一种分子标记物，与其他分子标记物不同的是，该分子 标记物在粪便中的检出量与结直肠癌存在极高的对应关系。其检测结果的敏感 性和特异性甚至不亚于组织样本中的检测结果。
发明提供了一种结直肠癌分子检测/诊断试剂，其特征在于以粪便作为检测 样本，并且含有SDC2基因甲基化检测试剂。
本发明筛选出的这个特殊的分子标记物即是SDC2基因。
SDC2基因是已知的一种参与细胞分裂、迁移和在结肠间充质细胞中表达 的蛋白质。据发现，肿瘤组织中SDC2目标区域的甲基化水平，显著地更高于 成对相邻非肿瘤组织中的SDC2目标区域。通过分析133例CRC患者原发肿瘤 和其成对相邻非肿瘤组织样本中的SDC2甲基化水平，研究人员发现，SDC2 基因的转录调控区域中，肿瘤组织样本显示甲基化水平显著地更高于对照的相 邻非肿瘤组织样本。
SDC2基因发生甲基化的位点相对恒定，多发生在启动子区的CpG岛。目 前，常用的SDC2基因甲基化检测方法多为针对CpG岛固定位点的甲基化检测。
甲基化的发生是胞嘧啶上多了一个甲基，经过亚硫酸氢盐处理后，胞嘧啶 会变成脲嘧啶，因为在进行PCR扩增时尿嘧啶与胸腺嘧啶相似而会被识别为胸 腺嘧啶，体现在PCR扩增序列上就是没有发生甲基化的胞嘧啶变成了胸腺嘧啶 (C变成T)，甲基化的胞嘧啶(C)则不会发生变化。PCR检测甲基化基因的 技术通常为MSP，针对处理后的甲基化片段(即片段中未改变的C)设计引物， 进行PCR扩增，如果有扩增则说明发生了甲基化，无扩增则没有甲基化。
SDC2基因在组织中的甲基化水平与结直肠癌的发病关联度是很高的。139 例组织中SDC2基因甲基化检出率为97.8％，131例肠癌和125例正常患者的血 液检测中，特异性为95.2％时，敏感性为87％(Oh,T.,etal.,TheJournalof MolecularDiagnostics,2013)。而让发明人意外的发现是，SDC2基因在粪便中 所检出的甲基化水平与结直肠癌的发病也保持了极高的关联度，其敏感性为 87％，特异性高达98％，甚至高于组织中的特异性。这在分子标记物中是极少 见的，甚至是绝无仅有的。
在发明人研究的多种分子标记物中，无一不是粪便样本的检测敏感性或特 异性对比组织样本大幅下降。例如，NDRG4基因这种结直肠癌分子标记物， 其在组织中的检测敏感性为81％，但是，在粪便中的检测敏感性降低至65.2％； BMP3基因在组织中的检测敏感性为66％，而在粪便中的检测敏感性降低至 39.0％，Septin9基因在组织中的检测特异性为90％，而在粪便中的检测特异性 降低至43％。研究发现，多种肠癌标记物仅在组织中显示出良好的检测敏感性 和特异性；而在粪便样本中，无论如何设计和优化提取方法、检测引物等，敏 感性或者特异性仍大幅下降，严重影响了肠癌的诊断。
而SDC2基因在粪便样本中仍然保持了高达87％的敏感性和98％的特异性， 这使得这种基因极其特别地可以作为粪便样本中可靠的肠癌标记物。
进一步地，发明提供了一种便于粪便中SDC2基因的提取和检测的方法。
磁珠捕获方法是采用磁珠作为固相吸附载体并使用特定设计的试剂体系及 提取流程(JournalofChinaMedicalUniversity应用磁珠法检测并提取尿液游离 甲基化DNA；2015,(10))。
磁珠捕获序列可以通过针对SDC2基因来设计。在本发明中，提供的示例 性捕获序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。通过磁珠捕获的方式，可以 对粪便中的SDC2基因进行提取和富集。
粪便的处理方式可选地为：将粪便在缓冲液中混匀、离心、取上清至另外 一个试管中，加入带有特定互补寡核苷酸捕获探针(例如优选的SEQIDNO.1： AGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG)的磁珠至上清液中，经 过孵育杂交后，用磁铁将磁珠吸附于管壁一侧，经过反复洗净后，用缓冲液将 目标基因DNA洗脱。该法可以俘获到目的基因，富集的过程约为2个小时。
被俘获的DNA经过重亚硫酸盐处理修饰后用于后续荧光定量PCR的检测。
进一步地，本发明针对甲基化多发和恒定的启动子去CpG岛来设计引物和 探针。示例性的引物如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；或SEQIDNO.5、SEQ IDNO.6；或SEQIDNO.7、SEQIDNO.8；或SEQIDNO.9、SEQIDNO.10； 或SEQIDNO.11、SEQIDNO.12；或SEQIDNO.13、SEQIDNO.14；或SEQ IDNO.15、SEQIDNO.16；或SEQIDNO.17、SEQIDNO.18；或SEQID NO.19、SEQIDNO.20；或SEQIDNO.21、SEQIDNO.22；或SEQIDNO.23、 SEQIDNO.24所示。
在一个优选的实施例中，采用的引物为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4。
为了进一步方便结果的显示，本发明设计了检测探针。示例性的探针序列 如SEQIDNO.25或SEQIDNO.26所示。在本发明的一个优选的实施例中，探 针序列如SEQIDNO.26所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所提供的结直肠癌诊断试剂可以简便地以粪便作为检测样本，对 结直肠癌进行可靠的诊断。本发明使用的检测样本是病人的粪便样本。 样品获得非常容易，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便。使用样本 量极少，取样过程非常方便且对病人无任何影响。同时样品便于邮寄或 者是随身带到医院做检查。
2.本发明可以同时发现左右两侧结肠的肿瘤，没有其他传统方法可能出现 的检测盲区；不仅可以发现大肠癌，也可以发现癌前腺瘤，为通过摘除 癌前腺瘤而预防大肠癌提供了可能性。
3.本发明所提供的试剂/试剂盒是通过甲基化水平来检测和诊断癌症，越来 越多的研究证实甲基化改变是肿瘤发生过程中的早期事件，检测甲基化 异常更易发现早期病变。
附图说明
图1为SDC2基因检测结直肠癌(A)和癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)(B)的 ROC曲线。
图2为NDRG4基因检测结直肠癌(A)和癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)(B)的 ROC曲线。
图3为BMP3基因检测结直肠癌(A)和癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)(B)的 ROC曲线。
图4为Septin9基因检测结直肠癌(A)和癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)(B)的 ROC曲线。
图5-15依次为引物对SM-0～SM-10的扩增曲线。
图16为荧光PCR检测结果(探针1)。
图17为荧光PCR检测结果(探针2)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表 对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改 和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1样本处理和DNA提取
粪便样本和缓冲液按照1g粪便：4ml缓冲液的比例混合研磨后，离心留取 上清液，丢弃沉淀物。
取8ml上清4000rpm离心5min后转移上清5ml到事先装有3ml细胞裂解 液的新的15ml离心管中。
向各离心管中加入100ul捕获磁珠。水浴锅92℃孵育10min。室温摇床 100rpm孵育1h，简短离心后置于磁力架5min，丢弃上清。
我们有2条捕获探针可用，均有效果，可以抓到目的片段。
捕获探针1：
SEQIDNO.1:AGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG
捕获探针2：
SEQIDNO.2:CTCCTGCCCAGCGCTCGGCGCAGCCCGC
向15ml离心管中加入500ul洗涤液，振荡摇匀，使管壁磁珠完全悬下来， 简短离心后转移到新的2ml离心管中。室温干浴器900rpm孵育1min，置于磁 力架上1min，弃上清。重复4次。
加入55ul洗脱液，简短离心，干浴器92℃900rpm孵育10min。简短离心， 置于磁力架上，3min以内转移50ul洗脱液到新的EP管中。
用EZmethylationkit(ZymoResearch公司产品)对第6步中的DNA片段 进行甲基化处理，最后的样品进行PCR检测。
捕获探针的捕获效率分析：
使用2条捕获探针捕获同一份样品，所捕获的片段通过紫外分光光度计测 定DNA的浓度，结果如下：
两条探针均能捕获目标片段。相较而言SEQIDNO.1效果更优。优化实验 采用该探针。
实施例2PCR检测过程
PCR体系和程序分别如表1、表2所示。
表1.PCR体系
成分 加入量(ul) 正向引物(FP)(100μM) 0.125 反向引物(RP)(100μM) 0.125 探针(100μM) 0.05 dNTP(10mM) 1 镁离子(25mM) 5 5*buffer 5 反应酶 0.5 无核酸酶的水 8.2 待测DNA 5 合计 25
表2.PCR程序
设计引物并对其扩增效率进行研究(如表3)，扩增体系及程序 如上所示。
表3.引物及扩增效率
对引物的PCR效果分别如图5-15所示。由结果可知，扩增效率最高的为 SEQIDNO.3、SEQIDNO.4这对引物。
采用扩增效率最高的SEQIDNO.3、SEQIDNO.4作为引物对。
进一步设计检测探针。优化的检测探针示例如下。
探针1：SEQIDNO.25：AGTTTCGAGTTCGAGTTTTCGAGTTTG
探针2：SEQIDNO.26：CAAACTCGAAAACTCGAACTCGAAACT
重复10个孔。重复2次实验。PCR体系和程序如表1、表2。
探针1、探针2的荧光曲线分别如图16、17所示。
由结果可知，探针1和探针2均可以保证PCR过程正常进行，相较来说， 探针2所得到的荧光值更高，更有利于对结果的判断，尤其是阳性样本的判断。
优化实验的样本检测采用探针2。
实施例3样本检测
临床收集46例肠镜及病理检查确诊为肠癌的患者的粪便样本，46例肠镜 及病理检查确诊为癌前腺瘤(息肉≥1cm)的患者的粪便样本，46例肠镜检查 确诊为正常的患者的粪便样本。
按照实施例1中的方法对上述粪便样本进行处理和DNA提取，使用实施 例2中的PCR检测过程对138例样本进行PCR检测。
检测46肠癌(Ca)(肠镜确诊为肠癌)，46例正常(Norm)(肠镜确诊为正常)， 46例癌前腺瘤(息肉直径≥1cm，LA，肠镜确诊为息肉直径≥1cm)。
使用MedCalc软件对数据进行处理分析。
结果如图1、2所示。
图1A为SDC2基因检测结直肠癌的ROC曲线；图1B为SDC2基因检测 癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)的ROC曲线。
对于结直肠癌，SDC2基因的检测敏感性为87％，特异性为98％，受试者 曲线下面积为0.953。
对于癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)，SDC2基因检测敏感性为73％，特异性 为96％，受试者曲线下面积为0.882。
实施例4示例性的其他分子标记物检测结果
在探索本发明技术方案的过程中，发明人探索了多种肠癌标记物。
参照实施例1、2、3的体系设计方法，本发明探索了例如NDRG4基因、 BMP3基因、Septin9基因的粪便检测。
在分别对它们都采用了最优化的检测方法之后，对同实施例3的样本进行 同样的临床样本分析。
NDRG4基因检测结直肠癌和癌前腺瘤的结果如图2所示。
图2A为NDRG4基因检测结直肠癌的ROC曲线；图2B为NDRG4基因检 测癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)的ROC曲线。
对于结直肠癌，NDRG4基因的检测敏感性为65.2％，特异性为97.8％，受 试者曲线下面积为0.826。
对于癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)，NDRG4基因检测敏感性为45.7％，特异 性为97.8％，受试者曲线下面积为0.694。
BMP3基因检测结直肠癌和癌前腺瘤的结果如图3所示。
图3A为BMP3基因检测结直肠癌的ROC曲线。图3B为BMP3基因检测 癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)的ROC曲线。
对于结直肠癌，BMP3基因的检测敏感性为50.0％，特异性为89.1％，受 试者曲线下面积为0.694。
对于癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)，BMP3基因的检测灵敏度为26.1％，特异 性为89.1％，受试者曲线下面积为0.549。
Septin9基因检测结直肠癌和癌前腺瘤的结果如图4所示。
图4A为Septin9基因检测结直肠癌的ROC曲线。图4B为Septin9基因检 测癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)的ROC曲线。
对于结直肠癌，Septin9基因的检测敏感性为82.6％，特异性为63.0％，受 试者曲线下面积为0.737。
对于癌前腺瘤(息肉直径≥1cm)，Septin9基因的检测敏感性为13.0％，特 异性为97.8％，受试者曲线下面积为0.534。
上述实施例仅显示了本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受 上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、简化，均未脱离本发明的内容，都包含在本发明的保护范 围内。