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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510998278.7 (22)申请日 2015.12.28 C12N 15/113(2010.01) C07K 14/39(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市高新园区凌工路 2 号 (72)发明人 袁文杰 高教琪 李益民 白凤武 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 贾汉生 李馨 (54) 发明名称 一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达。
2、启动 子及其表达系统 (57) 摘要 本发明提供了一种来源于马克斯克鲁维酵母 的高表达启动子 KmINU1 启动子、 高效外泌的信号 肽及其相应的表达系统及其表达系统。 其中， 具有 SEQ ID No.2表示的核苷酸序列的KmINU1启动子 具有最强的启动活性， 且活性远远高于目前报道 的KmPGK启动子。 本发明的 KmINU1 启动子无需诱 导即可启动下游基因的表达， 并且目的基因能在 宿主细胞生长稳定后高效表达， 特别适合对宿主 细胞生长有影响的外源基因的表达。本发明构建 的含有 KmINU1 启动子和高效外泌的信号肽的表 达系统适用于多种酵母菌， 包括酿酒酵母、 乳酸克 鲁维酵母和马。
3、克斯克鲁维酵母等， 为不同外源基 因的高效表达奠定了基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图5页 CN 105524923 A 2016.04.27 CN 105524923 A 1.一种高表达的启动子， 其核苷酸序列为(a)(d)中的任意一种： (a)如SEQIDNo.1表示的核苷酸序列； (b)如SEQIDNo.2表示的核苷酸序列； (c)截断上述(a)的核苷酸序列获得的核苷酸序列， 其中截断获得的核苷酸序列包含上 述(b)的核苷酸序列； (d )与上述(a )( c )的核苷酸序列具有80同源。
4、性并且在马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromycesmarxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启 动子活性的核苷酸序列。 2.一种用于引导如权利要求1所述的高表达启动子调控的外源蛋白分泌的信号肽， 其 特征在于， 其核苷酸序列为(e)和(f)中的任意一种： (e)如SEQIDNo.3表示的核苷酸序列； (f)与上述(e)的核苷酸序列具有80同源性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克 鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有外泌蛋白能力的核苷酸序列。 3.一种载体， 其包含权利要求1中所述的高表达启动子、 权利要求2中所述的信号肽和 能够在该高表达启动子的调控下工作的方。
5、式配置的外源蛋白基因。 4.根据权利要求3所述的载体， 其特征在于， 所述载体含有在酵母中扩增的复制起点序 列、 筛选标记URA3基因和卡那霉素抗性基因， 其中所述的复制起点序列如SEQIDNo.4。 5.一种转化体， 其通过将权利要求3或4所述的载体导入酵母中而得到。 6.根据权利要求5所述的转化体， 其特征在于， 所述的酵母为马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromycesmarxianus)乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中的任意一种。 7.一种外源蛋白基因的高表达方法， 其特征在于， 包括对权利要求5所。
6、述的转化体进行 培养的步骤。 8.根据权利要求7所述的外源蛋白基因的高表达方法， 其特征在于， 还包括对培养得到 的转化体中回收外源蛋白基因表达产物的步骤。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524923 A 2 一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达启动子及其表达系统 技术领域 0001 本发明属于微生物基因工程应用领域， 具体涉及包含一种来源于马克斯克鲁维酵 母的高表达启动子和外泌信号肽、 包含该启动子和信号肽的重组载体、 利用该载体在多种 酵母中实现目的基因的高表达方法。 背景技术 0002 酵母细胞用于外源蛋白的分泌表达一直以来就被人们广泛关注。 酵母细胞以其适 于大规模生产、 翻译。
7、后修饰系统较为完善以及无内毒素污染问题等优点而被研究人员广泛 应用。 但同样酵母细胞也具有表达量不高、 信号肽加工不完全导致不能分泌大蛋白等缺点。 目前， 应用广泛同时也相对成熟的酵母表达系统包括酿酒酵母、 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、 乳酸克鲁维酵母等。 但是， 传统的酵母表达体系在表达量和信号肽加工等方面 还有待进一步完善。 0003 一些新型的非传统酵母， 特别是马克斯克鲁维酵母， 具有生长快、 底物谱广泛、 耐 受高温等优势， 受到了越来越多的关注， 是极具开发前景的新型酵母表达系统和生物基化 学品和生物能源的生产菌株(ApplMicrobiolBiotechno。
8、l,2008,79:339-354； FEMSYeast Research,2015,15,1-13)。 但截止目前， 较为理想的启动子和信号肽研究较少， 同时能够在 其中自主复制并能够简单筛选的表达系统也相对匮乏， 这些问题最终导致了马克斯克鲁维 酵母至今无法广泛应用于各种蛋白的异源表达和基因工程改造。 0004 外源蛋白在宿主细胞内的异源表达的前提在于携带目的基因的载体能够在宿主 细胞内进行自主的复制、 转录和翻译过程， 这一过程受制于不同宿主细胞内不同的复制起 点。 但是， 与酿酒酵母和毕赤酵母相比， 克鲁维属酵母作为宿主细胞的表达载体相对受限。 真正使得克鲁维属酵母作为表达宿主而被人们。
9、关注是由于pKD1质粒的发现(Falconeet al.Plasmid,1986,15:248-252.)。 含有pKD1质粒复制起点的表达载体能够保证其在酿酒酵 母、 乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母等中进行复制， 并最终实现外源蛋白的表达。 0005 外源蛋白的表达量或者表达效率在很大程度上取决于选取的启动子的转录活性 (PNAS， 2005， 102(36):12678-12683)。 目前应用于克鲁维属表达系统的启动子分为三类： 其 自身启动子、 来源于酿酒酵母启动子和非酵母启动子， 如Tet-off， 且多使用酿酒酵母的启 动子(ApplMicrobiolBiotechnol， 20。
10、13， 97(5):2029-41)。 而蛋白的胞外表达借助于外泌 信号肽的介导， 高效的信号肽同样能够帮助蛋白在胞外实现高表达量， 并有利于进一步的 蛋白分离纯化工作。 发明内容 0006 本发明提供一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达启动子(KmINU1启动子)、 高效 外泌的信号肽及其相应的表达系统。 0007 本发明是采用如下技术方案来实现的： 0008 本发明的第一方面， 提供一种高表达的启动子， 其核苷酸序列为(a)(d)中的任 说明书 1/8 页 3 CN 105524923 A 3 意一种： 0009 (a)如SEQIDNo.1表示的核苷酸序列； 0010 (b)如SEQIDNo。
11、.2表示的核苷酸序列； 0011 (c)截断上述(a)的核苷酸序列获得的核苷酸序列， 其中截断获得的核苷酸序列包 含上述(b)的核苷酸序列； 0012 (d)与上述(a)(c)的核苷酸序列具有80同源性并且在马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromycesmarxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启 动子活性的核苷酸序列。 0013 上述高表达启动子命名为KmINU1启动子。 0014 本发明的第二方面， 提供一种用于引导如上述所述的高表达启动子(KmINU1启动 子)调控的外源蛋白分泌的信号肽， 其特征在于， 其核苷酸序列为(e)和(f)中的任意一种： 0015 (。
12、e)如SEQIDNo.3表示的核苷酸序列； 0016 (f)与上述(e)的核苷酸序列具有80同源性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克 斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有外泌蛋白能力的核苷酸序列。 0017 本发明的第三方面， 提供一种载体， 其包含上述所述的高表达启动子(KmINU1启动 子)所述的高表达启动子、 上述所述的信号肽和能够在该高表达启动子的调控下工作的方 式配置的外源蛋白基因。 0018 进一步地， 所述载体含有在酵母中扩增的复制起点序列、 筛选标记URA3基因和卡 那霉素抗性基因， 其中所述的复制起点序列如SEQIDNo.4。 0019 本发明上述所述的载体， 带有在克鲁维。
13、酵母中扩增的复制起点， 能够在克鲁维属 酵母中实现目的基因的胞外高表达； 且该载体带有URA3基因和卡那霉素抗性基因， 具有简 单筛选特性。 0020 本发明的第四方面， 提供一种转化体， 其通过将上述所述的载体导入酵母中而得 到。 0021 进一步地， 所述的酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)乳酸克 鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的任意一 种。 0022 本发明的第五方面， 提供一种外源蛋白基因的高表达方法， 包括对上述所述的转 化体进行培养的步骤。 0023 进一步地， 上。
14、述所述的外源蛋白基因的高表达方法， 还包括对培养得到的转化体 中回收外源蛋白基因表达产物的步骤。 0024 与现有的克鲁维属的表达载体相比， 本发明具有如下优点： 0025 (1)本发明所述的KmINU1启动子具有较强的转录启动活性， 不需要诱导物即可启 动其下游基因的转录。 并且该启动子在很大程度上解除了酵母中普遍存在的碳源阻遏效 应， 在相对较高的碳源浓度条件下能够保持较高的转录活性； 0026 (2)本发明所述的外源蛋白表达载体含有高效的菊粉酶信号肽， 能够实现外源蛋 白的胞外表达， 为后续的分离纯化奠定基础； 0027 (3)本发明所述的外源蛋白表达载体含有卡那霉素的抗性基因， 能够在。
15、酵母菌宿 主内实现快速方便筛选； 说明书 2/8 页 4 CN 105524923 A 4 0028 (4)本发明所述的表达载体的蛋白表达量随着时间逐渐积累， 特别适合表达影响 细胞生长的蛋白。 附图说明 0029 图1是本发明提供的含有卡那抗性基因的载体pCXJ10-kan的结构示意图。 0030 图2是本发明提供的含有367bpKmINU1启动子和信号肽的胞外蛋白表达载体 pCXJ10-kan-PS的结构示意图。 0031 图3是本发明提供的含有菊粉酶的表达载体pCXJ10-kan-inu的结构示意图。 0032 图4是不同截断长度的KmINU1启动子的启动活性比较。 0033 图5是36。
16、7bpKmINU1启动子进一步截断的启动活性比较。 0034 图6是KmINU1启动子(如SEQIDNo.1所示)的结构与功能示意图。 0035 图7是以乳酸克鲁维酵母为宿主， 绿色荧光蛋白为报告基因的KmINU1启动子和 KmPGK启动子的活性比较。 0036 图8是在乳酸克鲁维酵母中， KmINU1启动子启动菊粉酶基因表达性能评价。 0037 图9是在马克斯克鲁维酵母中， KmINU1启动子启动菊粉酶基因表达性能评价。 具体实施方式 0038 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。 下述实施例中， 如无特殊说明， 所使用的实验方法均为。
17、常规方法， 所 用材料、 试剂等均可从生物或化学公司购买。 0039 本发明使用的材料： 质粒pCXJ10(Gene,1996,172:131-136)， NCBIGeneBank U34314； 质粒pYES2 .0为Biovector公司的Biovector104802； 质粒pFA6a-kanMX4 (NucleotidesequenceofthekanamycinresistancetransposonTn903 , J.Mol.Biol.1981， 147(2),217-226)， GeneBank:AJ002680.1； 质粒pZQ03(张秋美.酿酒酵母 乙醇响应报告载体的构建和研。
18、究 .大连理工大学硕士论文， 2009 )， 带有eGFP基因 (GeneBank:JQ064510.1)； 聚合酶链式反应(PCR)扩增试剂盒为Takara公司的产品PCR试剂 盒。 0040 本发明所用引物名称以及其序列如表1， 划线部分为酶切位点。 0041 表1.引物名称以及其序列 0042 说明书 3/8 页 5 CN 105524923 A 5 0043 0044 实施例1 0045 (1)KmINU1启动子的获取 0046 将鹰嘴豆胞克鲁维酵母(Kluyveromycescicerisporus)CBS4857的基因组为模 板， Inu-1058(SEQIDNo.11)和Inu-。
19、0(SEQIDNo.13)为引物， 通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增方式获得KmINU1启动子， 其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示， 其总长度为1058bp。 0047 将鹰嘴豆胞克鲁维酵母(Kluyveromycescicerisporus)CBS4857的基因组为模 板， inu-PS-F(SEQIDNo.5)和Inu-0(SEQIDNo.13)为引物， 通过聚合酶链式反应(PCR)扩 增方式获得KmINU1启动子， 其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示， 其总长度为367bp。 0048 (2)高效外泌信号肽(SEQIDNo.3)的获取 0049 将鹰嘴豆胞克鲁维酵母(Kluyve。
20、romycescicerisporus)CBS4857的基因组为模 板， inu-PS-F(SEQIDNo.5)和inu-PS-R(SEQIDNo.6)为引物， 通过聚合酶链式反应(PCR) 扩增方式获得菊粉酶启动子,信号肽共436bp， 其中转录起始位点(ATG)定义为+1位， +1+ 69区间为本发明的高效外泌信号肽， 其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示， 其总长度为69bp， - 1-367bp区为本发明的KmINU1启动子， 其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示， 其总长度为 367bp。 0050 为了后续连入目的基因的方便， 通过引物设计在信号肽下游额外添加了NotI、 SpeI。
21、和SacII三个酶切位点。 0051 实施例2 0052 1.不同长度KmINU1启动子启动活性的差异分析 0053 将实施例1得到的SEQIDNo.1的KmINU1启动子截为5段， 如图6所示。 图6中， 将转 录起始位点(ATG)定义为+1位， -1058-1区间为KmINU1启动子， 而+1+69区间为本发明所 述的高效外泌信号肽。 所述KmINU1启动子从ATG开始， 分别在-217bp， -367bp， -567bp， - 817bp， -1058bp处截断， 分别得核苷酸序列长度分别为217、 367、 567、 817和1058bp的KmINU1 启动子序列。 0054 为了研究。
22、上述不同长度的KmINU1启动子启动活性的差异， 并进一步确定其核心启 动区域， 将上述不同长度的启动子分别连接到含有卡那霉素抗性基因和报告基因绿色荧光 蛋白(EGFP)的高拷贝酿酒酵母质粒pYES2.0上， 再转化进酿酒酵母S288c宿主中进行荧光强 度分析。 结果如图4。 0055 由图4可以看出， 不同长度的启动子对于绿色荧光蛋白的启动活性具有较大差异。 说明书 4/8 页 6 CN 105524923 A 6 1058、 817、 567和367四种长度的启动子单位生物量荧光强度随时间的变化趋势一致。 其中， 817bp和367bp的启动子活性相似， 且均明显高于另两种长度的启动子， 。
23、是1058bp的1.5倍， 是567bp的2倍。 但是， 当将启动子截断至-217bp时， 启动活性完全消失。 由现有的实验结果 推测， 在KmINU1启动子中， -367-567bp和-817-1058区间存在抑制区， 而在-567-817 区间存在激活区。 并且， KmINU1启动子的核心启动区可能存在于-217-367之间。 另外， 值 得注意的是， 在12h处， 367bp启动子活性要明显高于其他三种启动子。 实验表明， 本发明所 述的长度为367bp的KmINU1启动子(如SEQIDNo.2所示)具有最强的启动活性， 并且在很大 程度上解除了碳源阻遏效应， 在克鲁维属外源蛋白表达过程。
24、中具有巨大的应用前景。 0056 2.KmINU1启动子核心启动区域的确定 0057 为了确定KmINU1启动子的核心启动元件， 获得不含调控元件的基本启动区域， 将 367bp长度的启动子(如SEQIDNo.2所示)进行进一步的截断。 根据生物信息学的预测， 在- 1-367bp的区域内含有两个可能的启动子核心元件， 因此， 以这两个预测的核心启动区为 分界点， 将367bp长度的启动子截成四段(-367-271， -367-221， -367-160和-367- 110)， 如图6所示。 0058 同样， 将不同截断长度的启动子连接到含有卡那霉素抗性基因和报告基因绿色荧 光蛋白(EGFP)。
25、的高拷贝酿酒酵母质粒pYES2.0上， 转化到酿酒酵母S288c中， 在20g/L的YPD 培养基中进行发酵。 发酵36小时后， 单位OD的最大荧光强度如图5所示。 与上述1中所述的不 同截断长度的启动子相比， -367-271片段和-367-221片段均不具有启动活性； -367- 160片段具有微弱的启动活性； -367-110片段达到相对较强的启动活性， 其活性基本与 1058bp的KmINU1启动子的启动活性相当， 略低于367bp的启动活性。 0059 由上述可见， 尽管两个核心启动区域(-367-160片段和-367-110片段)均具有 一定的功能， 但是第二个核心启动区(-160。
26、-110片段的启动活性更为重要。 而第一个核心 启动区(-367-160片段)所含有的TATAbox原件， 在发挥启动活性方面也起到了一定的调 控作用。 对于367bp启动子的进一步截断实验结果分析， 我们确定了KmINU1启动子的真正启 动核心区域位于启动子上游-271-110bp之间， 这160bp的序列基本可以实现较强的启动 活性， 保证进一步的启动子应用。 而且由于在这段序列中不存在相应的转录因子调控位点， 可能在一定程度上解除KmINU1对于碳源的抑制作用， 为其进一步的分析和应用奠定了一定 的基础。 0060 综合实施例1和实施例2的实验结果， 本发明所述的KmINU1的启动子(如。
27、SEQID No.1所示)的简化的功能与结构示意图如附图6所示。 0061 实施例3 0062 367bp长度的KmINU1启动子(SEQIDNo.2所示)与KmPGK启动子启动活性的比较 0063 为了比较本发明提出的最理想的KmINU1启动子(SEQIDNo.2所示)与目前报道的 克鲁维属最强的KmPGK启动子的启动活性的强弱关系， 以乳酸克鲁维酵母为表达宿主， 绿色 荧光蛋白为报告基因进行实验。 具体实验步骤如下： 0064 (1)以质粒pCXJ10为基本骨架(GenBankU34314)， 并根据其酶切位点特性， 选择 BamHI和EcoRI酶切位点插入卡那霉素抗性基因(kanMX4)。
28、。 所述kanMX4片段来源于质粒 pFA6a-kanMX4的双酶切产物， 酶切位点为BamHI和EcoRI， 酶切产物经回收纯化得到 kanMX4DNA片段， 用T4连接酶与载体pCXJ10进行连接， 连接产物转化至大肠杆菌 说明书 5/8 页 7 CN 105524923 A 7 (Escherichiacoli)DH5 ， 重组质粒经过酶切验证后命名为pCXJ10-kan， 其结构示意图如 图1。 0065 (2)KmINU1启动子与KmPGK启动子的插入 0066 以上述构建的pCXJ10-kan为基本骨架， 根据其酶切位点特性， 选择BamHI和SalI酶 切位点分别连入367bp长。
29、度的KmINU1启动子和KmPGK启动子DNA片段。 具体方法为： 以鹰嘴豆 胞克鲁维酵母(Kluyveromycescicerisporus)CBS4857提取的基因组DNA为模板， 用相应引 物进行PCR扩增反应获得KmINU1启动子与KmPGK启动子的DNA片段。 其中， KmPGK启动子DNA片 段以BamHI-KmPGK-F(SEQNo.7)和SalI-KmPGK-R(SEQNo.8)分别作为上游引物和下游引 物； KmINU1启动子片段以inu-PS-F和Inu-0分别作为上游引物和下游引物。 纯化后的PCR产 物经过BamHI和SalI双酶切后， 与同样酶切后的质粒pCXJ10-。
30、kan进行连接， 连接产物转化至 大肠杆菌DH5， 重组质粒经酶切验证后分别命名为pCXJ10-kan-KmINU1和pCXJ10-kan- KmPGK。 0067 (3)含有EGFP报告基因的表达载体的构建 0068 以上述的载体pCXJ10-kan-KmINU1和pCXJ10-kan-KmPGK为基本骨架， 根据其酶切 位点特性， 选择SalI单酶切位点进行eGFP的片段连接。 具体方法为： 以含有eGFP序列的载体 pZQ03为模板， 以SalI-eGFP-F(SEQIDNo.9)和SalI-eGFP-R(SEQIDNo.10)为引物， 经PCR 扩增反应获得eGFPDNA片段。 纯化后。
31、的PCR产物经过酶切后， 与去磷酸化的SalI单酶切质粒 进行连接， 转化大肠杆菌DH5， 重组质粒经测序确定正确后分别命名为pCXJ10-kan- KmINU1-eGFP和pCXJ10-kan-KmPGK-eGFP。 0069 (4)绿色荧光蛋白荧光强度的测定 0070 将获得的含有启动子和绿色荧光蛋白的表达载体采用电转化的方法转化乳酸克 鲁维酵母， 以G418(300 g/ml)抗性平板筛选转化子。 将获得的转化子在含有100 g/ml的 G418的YPD培养基中进行发酵， 发酵条件为30， 150rpm。 每48h补充一定量的G418以保证质 粒不丢失， 直至发酵结束。 0071 每12。
32、h取样测定菌体在620nm处的吸光度以及对应的荧光强度。 荧光强度测定方法 如下： 取1ml菌体， 3000g离心5min， 去上清， 用等量的PBS缓冲液洗涤2次。 再用1ml的PBS重悬 细胞， 重悬后的细胞在485/520nm的条件下测定荧光强度。 以未转化的原始乳酸克鲁维酵母 作为对照。 0072 以原始的乳酸克鲁维酵母为对照(Control)， 尽管KmINU1启动子与KmPGK启动子均 可以启动绿色荧光蛋白的表达， 但二者启动转录的活性存在差别。 367bp长的KmINU1启动子 (图7中的KmINU1启动子)的活性要比KmPGK启动子强34倍(图7)。 考虑到KmPGK启动子是目。
33、 前报道的在马克斯克鲁维酵母中相对较强的启动子， 其启动子活性要明显强于KmTDH3和 KmADH1启动子( YangCetal .Characterizingyeastpromotersusedin Kluyveromycesmarxianus.WorldJMicrobiolBiotechnol,2015,31(10):1641-1646.)。 因此， 本发明提出的367bp的KmINU1启动子单就从强度而言具有巨大的应用潜力， 配合本发 明构建的适于在克鲁维属酵母中进行异源表达的载体， 可以说367bp的KmINU1启动子能够 实现外源蛋白的高表达。 0073 另外， KmINU1启动子与。
34、KmPGK启动子的整体表达模式也存在差异。 KmPGK启动子属 于典型的组成型表达的启动子， 在生长初期其表达量就已经达到最大， 其后保持不变或略 说明书 6/8 页 8 CN 105524923 A 8 有下降； 而KmINU1启动子在生长初期表达量相对较低， 随着发酵的延续表达量持续增加， 在 发酵的后期才能达到最大值。 因此， 就这一表达模式而言， KmINU1启动子还可以用于表达一 些有毒蛋白或者是适于在发酵后期表达的蛋白。 0074 实施例4 0075 以菊粉酶为报告基因， 乳酸克鲁维酵母为宿主的表达载体应用评价 0076 正如实施例3中所述， 本发明提供的长度为367bp的KmIN。
35、U1启动子具有较强的启动 活性， 在外源蛋白高表达方面极具应用前景。 同时我们所构建的表达载体也适用于克鲁维 属的酵母的外源蛋白表达并具有筛选简单的优势。 因此， 我们以菊粉酶为报告基因， 评价该 启动子和表达载体在蛋白表达方面的性能， 具体步骤如下： 0077 (1)以质粒pCXJ10为基本骨架， 并根据其酶切位点特性， 选择BamHI和EcoRI酶切位 点插入卡那霉素抗性基因(kanMX4)， kanMX4片段来源于质粒pFA6a-kanMX4的酶切产物。 经 过相应DNA片段的回收纯化， 用T4连接酶进行连接， 转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5 ， 重组质粒经过酶切验。
36、证后命名为pCXJ10-kan.载体结构示意图如图1。 0078 (2)以菊粉酶为报告基因的表达载体的构建 0079 以本发明上述构建的pCXJ10-kan为基本骨架， 根据其酶切位点特性， 选择BamHI和 SalI酶切位点连入相应的DNA片段。 DNA片段来源于PCR扩增反应:以鹰嘴豆胞克鲁维酵母 (Kluyveromycescicerisporus)CBS4857的基因组为模板， Inu-PS-F(SEQIDNo.5)和Inu- R(SEQIDNo.12)为引物PCR产物包含367bp长的KmINU1启动子、 菊粉酶信号肽(SEQID No.3所示)和菊粉酶的编码基因。 纯化后的PCR产。
37、物经过酶切后， 与同样酶切后的质粒进行 连接， 转化大肠杆菌DH5 ， 重组质粒经过酶切验证后命名为pCXJ10-kan-inu， 载体结构示意 图如图3。 0080 (3)外源蛋白表达性能评价 0081 将pCXJ10-kan空载质粒和pCXJ10-kan-inu质粒分别转入乳酸克鲁维酵母中。 转化 方法和筛选方法与实施例3中相同。 发酵培养基含有40g/L菊粉、 20g/L蛋白胨和10g/L酵母 粉。 其他的发酵方法也与实施例3完全一致。 0082 每24h取样后的发酵液取上清液进行菊粉酶酶活的测定。 酶活的测定方法参见文 献(Gaoetal.Effectsofcarbonsources,。
38、oxygenationandethanolonthe productionofinulinasebyKluyveromycesmarxianusYX01.JBiosciBiotech, 2012,1(2):155-161)。 1单位的酶活定义为1min水解菊粉生成1 mol的果糖所需要的酶量， 选取不含菊粉酶基因的空载质粒作为对照。 0083 如附图8所示， 其中， OD620-kan表示对照菌生物量； OD620-inu含有菊粉酶的重组菌 的生物量； inulinase-kan表示对照菌的菊粉酶活力； inulinase-inu表示含有菊粉酶的重 组菌的菊粉酶活力。 乳酸克鲁维酵母本身无法产。
39、生菊粉酶， 故对照菌株在以菊粉为唯一碳 源的发酵培养基中生物量始终低于实验组。 菊粉酶的活力， 对照菌株始终为0， 而实验菌株 随着发酵时间延长， 酶活力逐渐积累， 在72h开始检测到明显的菊粉酶活力， 在120h达到最 大值。 与实例3结果一致， 利用本发明提供的367长的KmINU1启动子(SEQIDNo.2所示)、 菊 粉酶信号肽(SEQIDNo.3所示)和pCXJ10-kan表达载体能够实现外源基因在乳酸克鲁维酵 母中的胞外高表达。 0084 实施例5以菊粉酶为报告基因， 马克斯克鲁维酵母为宿主的表达载体应用评价 说明书 7/8 页 9 CN 105524923 A 9 0085 除乳。
40、酸克鲁维酵母酵母外， 本发明提供的启动子、 信号肽和表达载体还能够在马 克斯克鲁维酵母实现外源基因的胞外高表达。 除选择的宿主细胞改为马克斯克鲁维酵母 1727外， 其余的实验操作步骤与实例4完全一致。 0086 由于马克斯克鲁维酵母本身能够分泌菊粉酶， 实验菌株与对照菌株生物量没有显 著差别。 但是实验菌株分泌了更多的胞外菊粉酶， 其菊粉酶活力是对照菌株的1.2倍， 酶活 力的绝对差值也要大于在乳酸克鲁维酵母中。 特别是单位生物量的菊粉酶活力， 实验组也 要明显高于对照组(图9)。 因此， 实验结果表明本发明提出的表达载体能够广泛应用于克鲁 维属酵母进行胞外蛋白的高表达， 同时在马克斯克鲁维。
41、酵母中能够实现更高的表达量。 说明书 8/8 页 10 CN 105524923 A 10 0001 序列表 1/5 页 11 CN 105524923 A 11 0002 序列表 2/5 页 12 CN 105524923 A 12 0003 序列表 3/5 页 13 CN 105524923 A 13 0004 序列表 4/5 页 14 CN 105524923 A 14 0005 序列表 5/5 页 15 CN 105524923 A 15 图1 说明书附图 1/5 页 16 CN 105524923 A 16 图2 图3 说明书附图 2/5 页 17 CN 105524923 A 17 图4 图5 图6 说明书附图 3/5 页 18 CN 105524923 A 18 图7 图8 说明书附图 4/5 页 19 CN 105524923 A 19 图9 说明书附图 5/5 页 20 CN 105524923 A 20 。