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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510967798.1 (22)申请日 2015.12.21 C12N 15/31(2006.01) C12N 15/80(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区孝陵卫钟 灵街 50 号江苏省农业科学院植物保护 研究所 (72)发明人 邓晟 林玲 张昕 (54) 发明名称 大丽轮枝菌致病相关基因 VdUGP 的功能分析 及其应用 (57) 摘要 从大丽轮枝菌 V07DF2 菌株中克隆了参与碳 水化合物代谢途径的 VdUGP 基因， 该基因全长。
2、为 4467个碱基。 通过农杆菌介导的T-DNA插入技术， 获得了该基因的表达下调突变体。根据该基因及 其侧翼的核酸序列， 构建了针对该基因的回补载 体。 利用农杆菌介导的转化方法， 获得了该基因的 回补菌株。通过对这些转基因材料的表型观察和 分析， 发现 VdUGP 基因控制大丽轮枝菌的分生孢 子产生数量， 同时还显著影响病原菌对棉花的致 病能力。因此针对该基因开发新的杀菌剂是一个 有效的病害控制策略。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表5页 附图2页 CN 105505951 A 2016.04.20 CN。
3、 105505951 A 1.一个来源于大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的致病相关基因， 命名为VdUGP， 该 基因的DNA序列包括其启动子、 外显子、 内含子和终止子， 共计4467个碱基。 2.根据权利要求1中所述的基因核酸序列构建的VdNUC-2回补质粒。 利用引物对大丽轮 枝菌基因组DNA进行VdUGP的克隆， 并对其进行的靶标研究和应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505951 A 2 大丽轮枝菌致病相关基因VdUGP的功能分析及其应用 技术领域 0001 本发明涉及大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)致病相关基因VdUGP的功能分。
4、析 及其潜在应用的研究， 属于生物技术研究领域。 背景技术 0002 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(简称UGP， UGPase或者UTP： 葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶， EC2.7.7.9)， 属于糖基转移酶家族， 催化可逆的1磷酸葡萄糖(Glc-1-P)和UDP-葡萄糖(UDP- Glc)的相互转化。 该类酶在生物体中广泛存在， 是一个参与碳水化合物代谢以及细胞壁合 成的重要酶类。 而参与其反应的UDP-葡萄糖(是产物亦是底物)又是多种细胞组分合成的前 体， 包括脂多糖(lipopolysaccharides)， 胞外多糖(extracellularpolysaccharides)以 及糖原(。
5、glucogen)等。 在拟南芥中， 该酶的突变体UDP-葡萄糖的含量降低， 并且表现明显的 生长缺陷和雄性不育。 相似的， 对水稻当中的同源基因进行基因沉默， 其相应突变体也表现 为花粉细胞壁异常， 导致雄性不育。 在本专利中， 我们发现土传病原菌大丽轮枝菌 (Verticilliumdahliae)的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(下文称为VdUGP基因)T-DNA插入 突变体表现为分生孢子产量减少， 而且致病力显著降低， 因此可以将其作为该病原菌防控 的生物学靶标。 0003 目前， 对大丽轮枝菌具有抗性的作物品种较少， 而且该病菌引起的作物黄萎病在 生产上一旦发生便无法用药物防治， 严重。
6、时常常导致绝收。 目前的防控策略主要是水旱轮 作， 但是， 这一措施很难在水资源匮乏或常年旱作的设施大棚中应用。 在这类地区进行防 控， 只能进行药剂的土壤处理， 但是这会导致后续的农药残留、 环境污染以及对人畜的毒害 问题。 因此， 针对该病原菌， 发掘更多的药物靶标将成为未来低毒高效防治的前提。 发明内容 0004 从大丽轮枝菌V07DF2菌株中克隆了参与碳水化合物代谢途径的VdUGP基因， 该基 因全长为4467个碱基(包括该基因的启动子、 外显子、 内含子和终止子， 详见序列1)。 通过农 杆菌介导的T-DNA插入技术， 获得了该基因的表达下调突变体。 根据该基因及其侧翼的核酸 序列，。
7、 构建了针对该基因的回补载体。 利用农杆菌介导的转化方法， 获得了该基因的回补菌 株。 通过对这些转基因材料的表型观察和分析， 发现VdUGP基因控制大丽轮枝菌的分生孢子 产生数量， 同时还显著影响病原菌对棉花的致病能力。 0005 相关技术路线如下： 0006 1.利用我们之前公开的双向启动子捕获载体1300-bisGFP-hyg， 通过农杆菌介导 的方法获得VdUGP基因下调表达的大丽轮枝菌突变体。 0007 2.利用网上共享的生物信息资源， 设计核酸引物， 构建VdUGP回补载体， 并将载体 导入大肠杆菌和农杆菌菌株中。 0008 3.回补载体利用农杆菌转化的方法导入到大丽轮枝菌VdUG。
8、P基因下调表达突变体 中， 获得回补突变体。 说明书 1/3 页 3 CN 105505951 A 3 0009 4.观察野生型菌株以及基因下调表达突变体和回补突变体在液体PDB培养条件下 和侵染植物过程中的差异。 0010 有益效果： VdUGP基因是大丽轮枝菌侵染棉花所需要的致病相关基因， 该基因的敲 除可以导致大丽轮枝菌分生孢子产量减少， 同时对棉花的致病能力显著降低。 因此针对该 基因开发新的杀菌剂是一个有效的病害控制策略。 附图说明 0011 图1.大丽轮枝菌基因组中VdUGP基因启动子T-DNA插入示意图 0012 图2.VdUGP回补载体图谱 0013 图3.野生型菌株以及沉默和。
9、回补突变体在液体PDB培养基中的产孢数量(V07DF2 为野生菌株； P-VdUGP为T-DNA插入启动子区域沉默突变体； VdUGP-C13VdUGP-C16和 VdUGP-C18为三个回补突变体菌株) 0014 图4.野生型菌株以及敲除和回补突变体对寄主棉花的致病力分析结果， 平均病情 指数标注在处理菌株的右侧(V07DF2为野生菌株； P-VdUGP为T-DNA插入启动子区域沉默 突变体； VdUGP-C13VdUGP-C16和VdUGP-C18为三个回补突变体菌株) 具体实施方式 0015 1.VdUGP基因表达沉默突变体的获得 0016 将我们公开的双向启动子捕获载体1300-bis。
10、GFP-hyg， 通过农杆菌介导的方法获 得VdUGP基因下调表达的大丽轮枝菌突变体。 具体的转化步骤如下： 大丽轮枝菌转接至液体 PDB中， 28， 150rpm培养3天； 含有T-DNA双元载体的农杆菌AGL-1挑取单克隆接至液体MM培 养基当中(现配现用， 1升超纯水中溶解： 2.05gK2HPO4， 1.45gKH2PO4， 0.15gNaCl， 0.5g MgSO47H2O， 0.1gCaCl26H2O， 0.0025gFeSO47H2O， 0.5g(NH4)2SO4和2.0gglucose)， 28 ， 150rpm培养2天。 之后将农杆菌用IM培养基(在90mlMM培养基中加入0。
11、.5ml甘油和 0.7808gMES， pH值调至5.3-5.5， 并用MM定容至100ml)稀释到OD6000.15， 预培养6小时， 然 后与等体积的、 浓度为1.0105孢子/ml的大丽轮枝菌孢子液混合。 将混合物取适量涂布于 灭菌的、 置于CM固体培养基(与IM培养基相似， 但葡萄糖浓度为IM培养基的一半， 另外还包 含200 M乙酰丁香酮)上的硝酸纤维素膜(0.45 m孔径)上， 于28共培养48小时。 之后， 硝酸 纤维素膜被转移至SM固体培养基上， 成份与MM相同， 另外包含琼脂、 200 Mcefotaxime和50 g/mlhygromycinB。 相同条件培养5-7天后， 。
12、可见小的转化子菌落， 用接种针分别挑取其 孢子进行培养， 经过单孢分离后以终浓度25甘油一70保存。 利用RT-PCR技术验证VdUGP 基因， 从中挑选出VdUGP基因启动子区域被T-DNA插入并下调表达的突变体。 0017 2.VdUGP基因回补载体的构建， 以及获得含有该质粒的AGL-1农杆菌菌株 0018 利用网上共享的生物信息资源(参见： http:/www .broadinstitute .org/ annotation/genome/verticillium_dahliae/MultiHome.html)， 分别设计两条核酸引物， 即 上 游 ： C C A T G A T T 。
13、A C G A A T T C A G G A C A A G T C A G G C T C G A A G G A ； 下 游 ： TACCGAGCTCGAATTCGCGAAACCACAGAACAAGAATC。 利用该引物对大丽轮枝菌基因组DNA进行PCR 扩增， 获得包括VdUGP基因启动子， ORF以及终止子在内的约4467bp的核酸片段。 将该序列纯 化， 利用ClonExpressTMII重组反应体系(购于Vazyme生物技术公司)将该片段连接至用 说明书 2/3 页 4 CN 105505951 A 4 HindIII线性化的1300-ble载体(经本实验室改造)上， 获得VdU。
14、GP回补质粒1300-ble-Pro- VdUGP。 经测序验证正确后， 将该质粒导入农杆菌AGL-1中， 获得具有回补功能的农杆菌菌 株。 0019 3.VdUGP基因回补突变体的获得 0020 利用上一步骤中获得的具有回补功能的AGL-1农杆菌菌株对T-DNA突变体库筛选 出来的VdUGPU基因沉默突变体进行转化， 具体的转化步骤如下： 大丽轮枝菌转接至液体PDB 中， 28， 150rpm培养3天； 含有T-DNA双元载体的农杆菌AGL-1挑取单克隆接至液体MM培养 基当中(现配现用， 1升超纯水中溶解： 2.05gK2HPO4， 1.45gKH2PO4， 0.15gNaCl， 0.5g。
15、 MgSO47H2O， 0.1gCaCl26H2O， 0.0025gFeSO47H2O， 0.5g(NH4)2SO4和2.0gglucose)， 28 ， 150rpm培养2天。 之后将农杆菌用IM培养基(在90mlMM培养基中加入0.5ml甘油和 0.7808gMES， pH值调至5.3-5.5， 并用MM定容至100ml)稀释到OD6000.15， 预培养6小时， 然 后与等体积的、 浓度为1.0105孢子/ml的大丽轮枝菌孢子液混合。 将混合物取适量涂布于 灭菌的、 置于CM固体培养基(与IM培养基相似， 但葡萄糖浓度为IM培养基的一半， 另外还包 含200 M乙酰丁香酮)上的硝酸纤维素。
16、膜(0.45 m孔径)上， 于28共培养48小时。 之后， 硝酸 纤维素膜被转移至SM固体培养基上， 成份与MM相同， 另外包含琼脂、 200 Mcefotaxime和25 g/mlBleomycin。 相同条件培养5-7天后， 可见小的转化子菌落， 用接种针分别挑取其孢子 进行培养， 经过单孢分离后以终浓度25甘油-70保存。 0021 3.大丽轮枝菌V07DF2野生菌株以及VdUGP沉默突变体和回补突变体在液体PDB中 的产孢情况分析和其致病力的分析 0022 A.我们将上述菌株的1ml孢子液(1107个孢子/毫升)转接至液体PDB中， 25， 150rpm培养一周， 然后利用普通光学显微。
17、镜和血球计数板分别对它们的孢子浓度进行测 定。 0023 B.将上述各菌株用液体PDB进行培养， 摇床温度25， 转速150rpm， 一周后取其孢 子， 并将孢子浓度稀释至1.0107个/ml， 分别对棉花苗进行灌根处理。 处理后的棉花培养 于25， 12h/12h(昼/夜)周期的温室中， 7-8周后分别对各处理进行病情指数调查、 统计并 拍照。 说明书 3/3 页 5 CN 105505951 A 5 0001 序列表 1/5 页 6 CN 105505951 A 6 0002 序列表 2/5 页 7 CN 105505951 A 7 0003 序列表 3/5 页 8 CN 105505951 A 8 0004 序列表 4/5 页 9 CN 105505951 A 9 0005 序列表 5/5 页 10 CN 105505951 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 105505951 A 11 图3 图4 说明书附图 2/2 页 12 CN 105505951 A 12 。